Summary
Kompostmikrokosmos bringer den mikrobielle mangfoldighed, der findes i naturen, ind i laboratoriet for at lette mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Forudsat her er protokoller til opsætning af mikrokosmoseksperimenter, hvor eksperimenterne demonstrerer evnen til at modulere miljømikrobiel mangfoldighed for at udforske forholdet mellem miljømikrobiel mangfoldighed og ormgutmikrobiomsammensætning.
Abstract
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig model til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem værter og deres tarmmikrobiomer. Mens eksperimenter med velkarakteriserede bakterier eller definerede bakteriesamfund kan lette analysen af molekylære mekanismer, er det vigtigt at studere nematoder i deres naturlige mikrobielle sammenhæng for at udforske mangfoldigheden af sådanne mekanismer. Samtidig er isolering af orme fra naturen ikke altid mulig, og selv når det er muligt, begrænser prøveudtagning fra naturen brugen af det genetiske værktøjssæt, der ellers er tilgængeligt til C. elegans-forskning. Følgende protokol beskriver en metode til mikrobiomundersøgelser, der anvender kompostmikrokosmos til vækst i laboratoriet i mikrobielt forskellige og naturlignende miljøer.
Lokalt fremskaffet jord kan beriges med produkter for at diversificere de mikrobielle samfund, hvor orme opdrættes, og hvorfra de høstes, vaskes og overfladesteriliseres til efterfølgende analyser. Repræsentative eksperimenter demonstrerer evnen til at modulere det mikrobielle samfund i en fælles jord ved at berige det med forskellige produkter og yderligere demonstrere, at orme opdrættet i disse forskellige miljøer samler lignende tarmmikrobiomer, der adskiller sig fra deres respektive miljøer, hvilket understøtter forestillingen om et artsspecifikt kernetarmmikrobiom. Samlet set giver kompostmikrokosmos naturlige miljøer i laboratoriet til mikrobiomforskning som et alternativ til syntetiske mikrobielle samfund eller til isolering af vilde nematoder.
Introduction
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig model til undersøgelse af interaktioner mellem værter og deres tarmmikrobiomer 1,2. Som model giver det flere fordele. For det første er kimfrie eller gnotobiotiske dyr lette at opnå og vedligeholde; blegemiddel kan bruges til at dræbe gravide orme og tilhørende mikrober, hvilket efterlader deres blegemiddelresistente æg uskadte til at vokse som alderssynkroniserede populationer, der kan koloniseres af bakterier af interesse 3,4. Hertil kommer, at når de dyrkes i nærværelse af bakterier, indtager C. elegans, en bakterie, de stødte bakterier, med modtagelige arter fordøjet eller udskilt, mens resistente og vedholdende arter stabilt koloniserer ormens tarm. Desuden er C. elegans for det meste hermafroditiske, der producerer populationer af genetisk identiske afkom, hvilket reducerer forvirrende genetisk variation. Sammen med tilgængeligheden af mutante og transgene ormestammer tilbyder arbejdet med C. elegans forskere en gnotobiotisk og genetisk medgørlig model til at undersøge det molekylære grundlag for værtsmikrobeinteraktioner 5,6,7,8.
Mens eksperimenter med velkarakteriserede bakterier kan lette analysen af molekylære mekanismer, er identifikation og undersøgelse af de bakterier, som orme interagerer med i naturen, afgørende for at udforske mangfoldigheden af sådanne mekanismer, optrævle den naturlige kontekst for deres funktion og forstå de selektive kræfter, der har formet deres udvikling. Uden for laboratoriet findes C. elegans globalt i fugtige tempererede klimaer, hvor befolkninger menes at gennemgå en "boom-and-bust" livscyklus, præget af hurtig befolkningstilvækst, når ressourcerne er rigelige, efterfulgt af et udviklingsmæssigt skift til banebrydende, stresstolerante dauers, når ressourcerne er udtømt9. Selvom det betragtes som en jordnematode, findes vildtvoksende C. elegans-populationer oftest fodring af nedbrydende organisk materiale såsom rådne blomster eller frugter, hvor bakteriepopulationer er rigelige og forskellige.
Undersøgelser af tarmmikrobiomet i nematoder isoleret fra naturen har identificeret forskellige, men karakteristiske bakteriesamfund 10,11, hvis sammensætning yderligere blev understøttet af undersøgelser udført med orme opdrættet i naturlignende mikrokosmosmiljøer 12,13. Sammen muliggjorde sådanne undersøgelser afgrænsningen af et kerneormtarmmikrobiom2. Mens prøveudtagningen af C. elegans-populationer i naturen repræsenterer den mest direkte undersøgelse af naturlige orme-mikrobe-interaktioner, er det ikke muligt overalt og når som helst, da det er begrænset til regioner og årstider med rigelig nedbør10,11. Alternativt, i stedet for at isolere orme fra deres naturlige habitat, bringer eksperimenter ved hjælp af mikrokosmos det naturlige habitat ind i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmos miljøer er forberedt af jord komposteret med forskellige frugter eller grøntsager, hvilket muliggør yderligere diversificering af startjordsamfundet. De tilbyder medgørlige eksperimentelle metoder, der kombinerer den mikrobielle mangfoldighed og det tredimensionelle vilde jordmiljø med de eksperimentelle fordele ved et kontrolleret laboratorieanlæg og genetisk definerede ormestammer. Protokollen nedenfor beskriver de trin, der er involveret i arbejdet med kompostmikrokosmos, og demonstrerer deres anvendelse til at forstå samlingen af et karakteristisk ormtarmmikrobiom fra forskellige miljøer.
Protocol
1. Fremstilling af kompost
- Få kompost eller havejord fra enhver bekvem kilde og opbevar inde i laboratoriet i en standard køkkenplastbeholder med huller skåret i låget for at lade luft komme ind. Sæt hullerne i med vat for at holde bananfluer og andre hvirvelløse dyr ude (figur 1A).
BEMÆRK: Fem hundrede gram jord (passer i en 1.5 gallon beholder, dimensioner: 30 cm x 20 cm x 10 cm) giver nok materiale til 12 mikrokosmos. - Berig komposten eller jorden med hakkede produkter eller en blanding af forskellige produkter i et masseforhold på 1:2 mellem produkt og jord.
- Inkuberes i 7-14 dage ved 20-25 °C, blandes en gang dagligt og M9-medium tilsættes efter behov for at opretholde fugt uden at gøre det mudret.
BEMÆRK: Jord, der ikke er beriget med produkter, understøtter normalt ikke C. elegans vækst, men hvilke specifikke produkter der skal bruges, er op til forskeren med mange typer og blandinger, der er i stand til at understøtte ormvækst. Berigelse med forskellige produkter vil fremme bakteriel samfundsdiversificering på forskellige måder, hvilket muliggør undersøgelse af tarmmikrobiomsamling fra forskellige udgangspunkter (se diskussionsafsnittet).
2. Fremstilling af kompostmikrokosmos
- For hvert mikrokosmos tilsættes 10 g beriget kompost til et 30 ml glasbægerglas dækket med stanniol og autoklave (figur 1B).
- For at forberede mikrobielt ekstrakt til genopfyldning af den autoklaverede kompost skal du starte med at tilføje 30 g af den samme kompost, der blev brugt i trin 2.1, til hvert af tre 50 ml rør og fylde med M9. Hvirvel i 1 min (figur 1C).
BEMÆRK: Dette skulle give nok bakterier til ni mikrokosmos, der hver understøtter udviklingen af hundredvis af nematoder. - Centrifuger rørene ved 560 × g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Vær opmærksom på ikke at forstyrre pelleten, fjern supernatanterne med en serologisk pipette og kombiner i et nyt 50 ml rør.
- Koncentrer bakterieekstraktet ved centrifugering ved maksimal hastighed (2.000 × g) i 15 minutter ved RT. Resuspender pellets i nok M9 til at have 200 μL for hvert mikrokosmos og 200 μL mere for at tilføje til en plade, der vil tjene som en synlig proxy for ormudvikling inde i mikrokosmos.
BEMÆRK: For eksempel for ni mikrokosmos skal du suspendere den mikrobielle pellet i 2 ml M9. - Der tilsættes 200 μL koncentreret mikrobielt ekstrakt til hvert bægerglas autoklaveret kompost samt til en NGM-plade, der skal fungere som den synlige proxyplade.
- Inkuber mikrokosmos og proxyplade i 24 timer ved 20-25 °C før tilsætning af orme.
3. Opdræt af orme i kompostmikrokosmos
- Der tilsættes 500-1000 æg eller L1-larver3 til hvert mikrokosmos og til proxypladen (trin 2.7) for at påbegynde forsøget (figur 1D).
BEMÆRK: De her beskrevne eksperimenter bruger N2 vildtypeorme. Imidlertid kan andre C. elegans-stammer (og potentielt andre nematoder) anvendes. - Hæv ormene til voksenalderen ved 20 °C (typisk 3 dage).
Figur 1: Forberedelse af kompostmikrokosmos, opdræt af orme og høst. (A) Berig lokal jord eller kompost med produkter og inkuber i 2 uger. Kombiner (B) autoklaveret beriget jord med (C) mikrobielt ekstrakt og (D) inkuber i mindst 24 timer, før du tilføjer synkroniserede L1s-orme til mikrokosmos for at starte eksperimentet. (E, F) Når du er klar til høst, tilsættes kompost fra mikrokosmos i en Baermann-tragtstøttecylinder og dækkes med M9. (G) Efter 15 minutter frigøres filtratet i et 50 ml rør. Forkortelse: sup. = supernatant. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Forberedelse af en Baermann-tragt til høst af orme
- Saml en Baermann-tragt ved at fastgøre 5-8 cm stive gummislanger til enden af en plasttragt.
- Skub en klemme på slangen, og klem den fast.
- I tragten anbringes et 7 cm langt, 5 cm i diameter, cylindrisk PVC-rør med et 1 mm nylonnet limet i bunden (figur 1E). Beklæd cylinderen med to ark silkepapir.
- Baermann-tragten anbringes i en kolbe (figur 1F).
5. Høst af orme fra mikrokosmos og indsamling af de respektive jordprøver
- Tilsæt 20 ml M9 til mikrokosmos, hvori ormene blev rejst, omrør blandingen, og hæld derefter blandingen fra bægerglasset i den silkepapirforede cylinder i Baermann-tragtopsætningen. Tilføj mere M9 for at nedsænke komposten helt i tragten.
BEMÆRK: C. elegans (N2) populationer når voksenalderen i kompostmikrokosmos med samme hastighed som på standard agarplader podet med Escherichia coli. For yderligere nøjagtighed ved høst af orme på et bestemt udviklingsstadium henvises til proxypladen fra trin 3.3. - Efter 30 minutter løsnes klemmen for at frigøre filtratet indeholdende de høstede orme i et 50 ml rør (figur 1G).
- Tilsæt mere M9 til cylinderen og gentag i en anden runde for at høste flere orme, og endnu en gang, hvis der kræves yderligere orme.
BEMÆRK: Når du gentager høstrunder, skal du passe på ikke at kompromittere silkepapirets integritet, hvilket kan tillade jordpartikler at passere igennem. Højst fire høstrunder bør isolere mindst 50% af de orme, der oprindeligt blev tilsat mikrokosmos uden at gå på kompromis med silkepapirets integritet. - Koncentrer ormene ved centrifugering ved 560 × g i 2 min (RT). Fjern 35 ml supernatant med en serologisk pipette.
- Overfør de resterende 15 ml til et 15 ml rør og centrifuge igen ved 560 × g i 1 minut for yderligere at koncentrere ormene. Fjern 14 ml supernatant med en serologisk pipette.
- Parallelt samles 1 g af den resterende mikrokosmos jord i et 1,5 ml rør. Behandle jordprøverne, der indeholder det miljømæssige bakteriesamfund, med det samme, eller opbevar dem ved -20 °C til senere ekstraktion af nukleinsyrer, som beskrevet nedenfor for ormeprøver.
6. Vask og overfladesterilisering af høstede orme
- Overfør 1 ml af de koncentrerede, høstede orme fra trin 5,5 til et 1,5 ml rør ved hjælp af en glaspipette. Inkuber i 2 minutter for at lade ormene slå sig ned i bunden af røret. Fjern supernatanten, og lad de nederste 100 μL være uforstyrrede.
- Vask 6x med 1,5 ml M9+T (0,025% Triton-X i M9), så ormene kan sætte sig i bunden hver gang.
- Overfør de vaskede orme i et volumen på 100 μL til et nyt 1,5 ml rør ved hjælp af en glaspipette.
BEMÆRK: På dette tidspunkt i protokollen skulle der være gået ca. 30 minutter siden første vask (trin 6.2). Det anbefales at lade ormene forblive uden mad i mindst 1 time før tilsætning af levamisol for at tillade udskillelse af forbigående bakterier og fuld fordøjelse af fødevarebakterier. - Tilsæt 100 μL 25 mM levamisolhydrochlorid for at lamme ormene. Inkuberes i 5 minutter ved RT.
- Tilsæt 200 μL 4% blegemiddelopløsning. Inkuberes i 2 min.
- Fjern supernatanten, lad de nederste 150 μL være uforstyrret, og vask 3x med M9+T, som ovenfor.
BEMÆRK: For at minimere forurening af prøverne anbefales det at bruge filtreret M9 + T (gennem et 0,2 μm filter) og at bære handsker fra dette tidspunkt og fremefter. - Efter vasken tages 50 μL af de resterende 150 μL fra den sidste vask og plade på en LB-plade, der inkuberes ved 25 °C i 48 timer for at bekræfte effektiv fjernelse af eksterne bakterier.
BEMÆRK: Observation af op til 30 kolonier i den sidste vask (repræsenterer 60 eksterne bakterieceller i alt resterende i prøven) er tilladt og forventes kun at have et marginalt bidrag til den analyserede mikrobiomsammensætning i betragtning af de tusindvis af bakterier, der typisk koloniserer hver voksen orm15. Når der observeres mere, kan prøveintegriteten blive kompromitteret. - Brug straks de overfladesteriliserede orme (f.eks. til at ekstrahere levende bakterier til dyrkning [CFU-tællinger]) eller opbevar ved -20 °C til efterfølgende ekstraktion af nukleinsyrer.
7. DNA-ekstraktion
BEMÆRK: Følgende trin beskriver DNA-ekstraktion af de høstede orme ved hjælp af et kommercielt sæt designet til ekstraktion af mikrobielt DNA fra jord (se Materialetabel) med ændringer beskrevet nedenfor for at lette udvindingen af mikrobielt DNA fra orme.
- Prøven indeholdende overfladesteriliserede orme overføres (om nødvendigt afrimes ved RT) til rørene fra sættet, og de medfølgende glasperler erstattes med zirconiaperler med en diameter på ca. 30-50 1 mm (se Materialetabel).
BEMÆRK: De observerede DNA-udbytter er højere med zirkoniaperler end med glasperlerne fra sættet. Selvom årsagen bag denne observation forbliver ubestemt, kan zirkoniaperler bryde nematodokebåndet mere effektivt og frigive flere bakterier. - For kompostprøver tilsættes ca. 250 mg af den opsamlede jord til sættets rør uden at erstatte glasperlerne.
- Efter tilsætning af bufferopløsningen leveret af sættet til alle prøverne homogeniseres med en effekthomogenisator ved RT (se Materialetabel) i to runder på 2.000 o / min i 30 s hver og holder pause i 30 s imellem.
- Gennemfør de resterende DNA-rensningstrin i henhold til kitprotokollen. Elute ormprøverne i højst 50 μL elueringsbuffer for at sikre DNA-koncentrationer, der er høje nok til sekventering.
Representative Results
For at undersøge evnen til at diversificere samfundet af jordmikrokosmos sammenlignede vi de mikrobielle samfund i kompostmikrokosmos fremstillet ved at berige den samme oprindelige jord, en kompost af industriel kvalitet, der er tilgængelig fra byen Berkeley, Californien, med forskellige produkter: æbler, paprika, appelsiner eller kartofler (hvert sæt i tre eksemplarer). Vi sammenlignede yderligere de mikrobielle samfund i hvert kompostmiljø med tarmmikrobiomet af vildtype C. elegans opdrættet i det respektive mikrokosmos. Analysen blev udført med DNA-prøver ekstraheret fra ca. 500 overfladesteriliserede voksne pr. mikrokosmos og fra 250 mg kompostprøver af de respektive mikrokosmos.
Karakterisering af de miljømæssige jord- og ormtarmmikrobiomer var afhængige af næste generations sekventering af V4-regionen af det bakterielle 16S rRNA-gen. Forberedelse af sekventeringsbibliotek blev opnået ved hjælp af standardsættene og udført i henhold til producentens anvisninger, med sekventering udført på en kommerciel sequencer (se Materialetabel). Demultipleksede sekvenser blev behandlet ved hjælp af DADA2, tildelt taksonomi baseret på SILVA v132-referencedatabasen og analyseret med phyloseq16,17,18 (se supplerende fil 1, supplerende figur S1, supplerende figur S2, supplerende figur S3, supplerende tabel S1 og supplerende tabel S2 for en detaljeret beskrivelse af rækkefølgen og analysen den fulde beregningspipeline er tilgængelig i GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Rådata er tilgængelige på NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).
I gennemsnit blev der opnået 73.220 sekvenser pr. Prøve. Disse sekvenser repræsenterer 15.027 ampliconsekvensvarianter (ASV'er), der spænder over 27 phyla og 216 familier, herunder familier, der betragtes som en del af kernen C. elegans tarmmikrobiom13, såsom Rhizobiaceae, Burkholderiaceae og Bacillaceae. Enterobacteriaceae og Pseudomonadaceae, som tidligere viste sig at være dominerende medlemmer, var et mindretal denne gang, men blev stadig beriget (2-10 gange) sammenlignet med deres respektive jordmiljøer. Sammenligninger baseret på både uvægtede og vægtede UniFrac 19,20-afstande viste god reproducerbarhed blandt mikrokosmos-triplikater beriget med de samme produkter, som angivet ved tæt klyngedannelse. I modsætning hertil grupperede miljøjordmikrobiomer beriget med forskellige produkter sig væk fra hinanden, hvilket viser evnen til at diversificere et indledende mikrobielt samfund ved tilsætning af forskellige produkter (figur 2).
I sammenligninger af ormetarmmikrobiomer og miljøsamfund viste hovedkoordinatanalyse (PCoA) med enten uvægtede eller vægtede UniFrac-afstande tydelig klyngedannelse af ormgutmikrobiomer væk fra deres respektive miljøer for hver mikrokosmostype (figur 2). Mens PCoA baseret på uvægtede UniFrac-afstande ikke skelnede mellem jord- og ormmikrobiomer (figur 2A), afslørede klyngedannelse baseret på vægtede afstande en klar adskillelse af ormtarm og kompostmikrobiomer (figur 2B). Disse resultater understøtter en proces, hvor værtsfiltrering fungerer på miljøtilgængelighed for at forme et tarmmikrobiom, der ikke er helt adskilt fra dets miljøkilde med hensyn til tilstedeværelsen af taxa, men modulerer deres overflod ved at berige for en delmængde af de tilgængelige taxa, hvilket i sidste ende resulterer i et kerneormtarmmikrobiom, der deles mellem orme, der er opdrættet i forskellige miljøer.
Figur 2: Orm-tarmmikrobiomer, der klynger sig væk fra deres respektive produktdiversificerede mikrobielle miljøer. Mikrobiomsammensætningen blev bestemt med 16S-sekventering, og samfund fra mikrokosmos beriget med de udpegede produkter eller fra orme opdrættet i dem blev grupperet ved hjælp af PCoA baseret på (A) uvægtede eller (B) vægtede UniFrac-afstande. De viste akser er dem, der forklarer den største variation i samfundssammensætningen mellem prøverne (N = 3 for hver mikrokosmostype). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Næste generations sekventering og dataanalyse. Her præsenteres trinene til biblioteksforberedelse, sekvensering i laboratoriet og dataanalyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S1: Et eksempel på en kvalitetskontrolgraf for omvendt læsning fra en prøve. X-aksen (cyklus) viser nukleotidpositionen langs den aflæste sekvens. Den venstre Y-akse viser kvalitetsresultatet. Gråtonevarmekortet repræsenterer frekvensen af kvalitetsscoren ved hver nukleotidposition; den grønne linje viser mediankvalitetsscoren ved hver nukleotidposition; den øverste orange linje viser kvartilerne i kvalitetsscorefordelingen; den nederste røde linje viser procentdelen af sekvenslæsninger, der forlængede den nukleotidposition (højre Y-akse, her 100%). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Fejlprocenter for forskellige stikprøver. Fejlfrekvensen i de forskellige prøver (sorte prikker) bør falde med stigende kvalitetsscore for hver mulig afbildet baseparsubstitution, hvilket afspejler den forventede tendens. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Et eksempel på PCoA baseret på vægtede UniFrac-afstande. Gruppenavnene vist i legenden repræsenterer de produkter, der bruges til at berige komposten, der anvendes i de forskellige mikrokosmos. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S1: Sekventiel sekvensfiltrering. en Antal sekvenslæsninger før filtrering. b-d Hver kolonne repræsenterer antallet af sekvenslæsninger, der er tilbage efter et filtreringstrin: filtrering af læsninger af lav kvalitet (trin 2.5), denoisingalgoritme udført af dada () (trin 2.8), fletning af fremadgående og omvendte læsninger (trin 2.9) og fjernelse af kimærer (trin 2.11). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel S2: Metadatatabel. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Protokollen, der præsenteres her, beskriver en metode til at studere tarmmikrobiomet af nematoder opdrættet i naturlignende miljøer, der tilbyder en alternativ tilgang til isolering af orme fra naturen eller til at opdrætte dem på syntetiske samfund.
De tusindvis af potentielle bakteriearter, der er fanget i det repræsentative mikrokosmoseksperiment, afspejler den mikrobielle mangfoldighed, som ormene har udviklet sig med, og demonstrerer mikrokosmosrørledningens evne til at kombinere fordelene ved at arbejde med en modelværtsorganisme og fordelene ved at arbejde med naturlige, forskellige mikrobielle samfund.
De repræsentative resultater viser, at berigelse af en fælles jordbund med forskellige produkttyper modulerer den mikrobielle mangfoldighed i miljøet og fremhæver den vifte af mikrobiel mangfoldighed, der er tilgængelig til udforskning ved hjælp af denne rørledning. Produktvalg er ikke særlig vigtigt. Tidligere arbejde har brugt bananer, æbler, appelsiner, jordbær, grønne teblade og kartofler til at berige jorden, hvilket resulterer i lignende orm, der øger effektiviteten. Blandede produkter er også blevet brugt effektivt. Nøglefunktionen er, at forskellige produkter vil diversificere en given jord på forskellige måder.
På trods af den brede variation i miljømæssig mikrobiel mangfoldighed varierer ormgutmikrobiomer betydeligt mindre, hvilket rekapitulerer betydningen af ormens tarmniche og værtsfiltrering til samling af et kernetarmmikrobiom, der adskiller sig fra dets jordmiljø13. Dette mønster observeres bedst med vægtet UniFrac PCoA-analyse, der viser, at forskellene mellem miljøjord og ormetarmmikrobiomer hovedsagelig stammer fra forskelle i den relative overflod af nøgletaxa.
Selvom protokollen beskrevet her fokuserer på høst af orme til 16S-sekventering, kan mikrokosmos bruges til at udforske yderligere spørgsmål af interesse. For eksempel kan orme høstet fra mikrokosmos efterfølgende undersøges for effekten af et forskelligt tarmmikrobiom på værtsresistens over for forskellige ugunstige forhold, herunder patogener eller toksiner. Alternativt kan nye bakteriearter og stammer isoleres og dyrkes fra jordhøstede orme, hvilket udvider den taksonomiske og funktionelle mangfoldighed af bakterier, der er tilgængelige til at udføre eksperimenter med.
Mens forskningsmetoder i laboratorieindstillinger søger konsistens og reproducerbarhed, udnytter arbejde med mikrokosmos den naturlige variation til at udforske værtsmikrobeinteraktioner i en naturlignende sammenhæng. Ikke desto mindre giver denne variation også nogle udfordringer. Nogle jordarter, der omfatter høje niveauer af endogene hvirvelløse dyr, kan kræve yderligere centrifugering, filtrering og undersøgelsestrin for effektivt at eliminere uønskede organismer fra mikrokosmospræparatet. Derudover kan lav mikrobiel overflod i jord fremkalde uønsket dauerdannelse i ormpopulationer, hvilket kræver en stigning i mikrobielt ekstrakt eller berigelse af jord med en større mængde produkter. Med hvert mikrokosmoseksperiment, der udføres, fortsætter forskerne med at udforske den fulde taksonomiske og funktionelle mangfoldighed, der leveres af naturen, hvilket muliggør opdagelsen af nye mikrobielle taxa og funktionelle evner lige fra infektionsresistens til beskyttelse mod miljøfremmede xenobiotika.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære, der er relevante for indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript, blev støttet af NIH-tilskud R01OD024780 og R01AG061302. K.T. blev yderligere støttet af et Summer Undergraduate Research Fellowship fra University of California, Berkeley, finansieret af Rose Hills Foundation. Tegneseriedesign i figur 1 blev hentet fra BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
| Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
| DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
| dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
| Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
| Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
| Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
| M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
| MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
| MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
| Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
| PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
| Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |
References
- Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 7-8 (2006).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604 (2019).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
- Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
- Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343 (2022).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
