Summary
Compostmicrokosmos brengt de microbiële diversiteit in de natuur in het laboratorium om microbioomonderzoek in Caenorhabditis elegans te vergemakkelijken. Hier worden protocollen verstrekt voor het opzetten van microkosmosexperimenten, waarbij de experimenten het vermogen aantonen om de microbiële diversiteit van het milieu te moduleren om de relaties tussen microbiële diversiteit in het milieu en de samenstelling van het microbioom van de wormdarm te onderzoeken.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans is in opkomst als een nuttig model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan interacties tussen gastheren en hun darmmicrobiomen. Hoewel experimenten met goed gekarakteriseerde bacteriën of gedefinieerde bacteriële gemeenschappen de analyse van moleculaire mechanismen kunnen vergemakkelijken, is het bestuderen van nematoden in hun natuurlijke microbiële context essentieel voor het verkennen van de diversiteit van dergelijke mechanismen. Tegelijkertijd is de isolatie van wormen uit het wild niet altijd haalbaar, en zelfs als het mogelijk is, beperkt bemonstering uit het wild het gebruik van de genetische toolkit die anders beschikbaar is voor onderzoek van C. elegans . Het volgende protocol beschrijft een methode voor microbioomstudies met behulp van compostmicrokosmos voor de groei in het laboratorium in microbieel diverse en natuurlijk-achtige omgevingen.
Lokaal geproduceerde grond kan worden verrijkt met producten om de microbiële gemeenschappen waarin wormen worden gekweekt en waaruit ze worden geoogst, gewassen en gesteriliseerd voor latere analyses te diversifiëren. Representatieve experimenten tonen het vermogen aan om de microbiële gemeenschap in een gemeenschappelijke bodem te moduleren door deze te verrijken met verschillende producten en tonen verder aan dat wormen die in deze verschillende omgevingen zijn opgegroeid, vergelijkbare darmmicrobiomen samenstellen die verschillen van hun respectieve omgevingen, wat het idee van een soortspecifiek kerndarmmicrobioom ondersteunt. Over het algemeen bieden compostmicrokosmos natuurlijke in-labomgevingen voor microbioomonderzoek als alternatief voor synthetische microbiële gemeenschappen of voor de isolatie van wilde nematoden.
Introduction
De nematode Caenorhabditis elegans is in opkomst als een nuttig model voor het bestuderen van interacties tussen gastheren en hun darmmicrobiomen 1,2. Als model biedt het verschillende voordelen. Ten eerste zijn kiemvrije of gnotobiotische dieren gemakkelijk te verkrijgen en te onderhouden; bleekmiddel kan worden gebruikt om gravidwormen en bijbehorende microben te doden, waardoor hun bleekbestendige eieren ongedeerd blijven om te groeien als leeftijdsgesynchroniseerde populaties die kunnen worden gekoloniseerd door bacteriën van belang 3,4. Bovendien, wanneer gekweekt in de aanwezigheid van bacteriën, C. elegans, een bacterivoor, neemt de aangetroffen bacteriën op, met vatbare soorten verteerd of uitgescheiden, terwijl resistente en persistente soorten stabiel de wormdarmen koloniseren. Bovendien zijn C. elegans meestal hermafroditisch en produceren ze populaties van genetisch identieke nakomelingen, wat de verstorende genetische variatie vermindert. In combinatie met de beschikbaarheid van mutante en transgene wormstammen, biedt de samenwerking met C. elegans onderzoekers een gnotobiotisch en genetisch handelbaar model om de moleculaire onderbouwing van gastheer-microbe-interacties te onderzoeken 5,6,7,8.
Hoewel experimenten met goed gekarakteriseerde bacteriën de analyse van moleculaire mechanismen kunnen vergemakkelijken, is het identificeren en bestuderen van de bacteriën waarmee wormen in de natuur interageren essentieel voor het verkennen van de diversiteit van dergelijke mechanismen, het ontrafelen van de natuurlijke context voor hun functie en het begrijpen van de selectieve krachten die hun evolutie hebben gevormd. Buiten het laboratorium wordt C. elegans wereldwijd gevonden in vochtige gematigde klimaten, waar wordt gedacht dat populaties een "boom-and-bust" -levenscyclus ondergaan, gekenmerkt door snelle bevolkingsgroei wanneer hulpbronnen overvloedig zijn, gevolgd door een ontwikkelingsverschuiving naar baanbrekende, stresstolerante dauers wanneer hulpbronnen uitgeput zijn9. Hoewel beschouwd als een bodemnematode, worden wild-woekerende C. elegans-populaties meestal gevonden die zich voeden met ontbindend organisch materiaal zoals rottende bloemen of vruchten, waar bacteriepopulaties overvloedig en divers zijn.
Studies van het darmmicrobioom in uit het wild geïsoleerde nematoden hebben diverse, maar karakteristieke, bacteriële gemeenschappen geïdentificeerd10,11, waarvan de samenstelling verder werd ondersteund door studies uitgevoerd met wormen die zijn opgegroeid in natuurlijk-achtige microkosmosomgevingen12,13. Samen maakten dergelijke studies de afbakening van een kernworm darmmicrobioommogelijk 2. Terwijl de bemonstering van C. elegans-populaties in het wild het meest directe onderzoek van natuurlijke worm-microbe-interacties vertegenwoordigt, is het niet overal en altijd haalbaar, omdat het beperkt is tot regio's en seizoenen met voldoende neerslag10,11. Als alternatief, in plaats van wormen te isoleren van hun natuurlijke habitat, brengen experimenten met behulp van microkosmos de natuurlijke habitat in het laboratorium 6,8,12,13,14,15. Microkosmosomgevingen worden bereid uit grond gecomposteerd met verschillende groenten of fruit, wat verdere diversificatie van de uitgangsbodemgemeenschap mogelijk maakt. Ze bieden behandelbare experimentele methoden die de microbiële diversiteit en de driedimensionale wilde bodemomgeving combineren met de experimentele voordelen van een gecontroleerde laboratoriumfaciliteit en genetisch gedefinieerde wormstammen. Het onderstaande protocol beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het werken met compostmicrokosmos, wat het gebruik ervan aantoont bij het begrijpen van de assemblage van een karakteristiek wormbuikmicrobioom uit verschillende omgevingen.
Protocol
1. Bereiding van compost
- Verkrijg compost of tuinaarde van elke geschikte bron en bewaar in het laboratorium in een standaard plastic keukencontainer met gaten in het deksel om lucht binnen te laten. Dicht de gaten met watten om fruitvliegjes en andere ongewervelde dieren buiten te houden (figuur 1A).
OPMERKING: Vijfhonderd gram grond (passend in een container van 1,5 gallon, afmetingen: 30 cm x 20 cm x 10 cm) biedt voldoende materiaal voor 12 microkosmos. - Verrijk de compost of grond met gehakte producten of een mengsel van verschillende producten in een 1:2 massaverhouding van producten tot grond.
- Incubeer gedurende 7-14 dagen bij 20-25 °C, meng eenmaal per dag en voeg indien nodig M9-medium toe om vocht te behouden zonder het modderig te maken.
OPMERKING: Bodems die niet zijn verrijkt met producten ondersteunen meestal niet de groei van C. elegans , maar welke specifieke producten moeten worden gebruikt, is aan de onderzoeker, met veel soorten en mengsels die de groei van wormen kunnen ondersteunen. Verrijking met verschillende producten zal de diversificatie van de bacteriële gemeenschap op verschillende manieren bevorderen, waardoor de darmmicrobioomassemblage vanuit verschillende startpunten kan worden bestudeerd (zie de discussiesectie).
2. Bereiding van compostmicrokosmos
- Voeg voor elke microkosmos 10 g verrijkte compost toe aan een glazen bekerglas van 30 ml bedekt met tinfolie en autoclaaf (figuur 1B).
- Om microbieel extract te bereiden om de geautoclaveerde compost aan te vullen, begint u met het toevoegen van 30 g van dezelfde compost die in stap 2.1 is gebruikt aan elk van de drie buizen van 50 ml en vult u deze met M9. Vortex gedurende 1 min (figuur 1C).
OPMERKING: Dit zou voldoende bacteriën moeten opleveren voor negen microkosmos, die elk de ontwikkeling van honderden nematoden ondersteunen. - Centrifugeer de buizen bij 560 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Let op om de pellet niet te verstoren, verwijder de supernatanten met een serologische pipet en combineer in een nieuwe buis van 50 ml.
- Concentreer het bacteriële extract door te centrifugeren met maximale snelheid (2.000 × g) gedurende 15 minuten bij RT. Resuspendeer de pellets in voldoende M9 om 200 μL voor elke microkosmos en 200 μL meer toe te voegen aan een plaat die zal dienen als een zichtbare proxy van wormontwikkeling in microkosmos.
OPMERKING: Neem bijvoorbeeld voor negen microkosmos de microbiële pellet opnieuw op in 2 ml M9. - Voeg 200 μL van het geconcentreerde microbiële extract toe aan elk bekerglas van geautoclaveerde compost, evenals aan een NGM-plaat die zal dienen als de zichtbare proxyplaat.
- Incubeer microkosmos en proxyplaat gedurende 24 uur bij 20-25 °C voor toevoeging van wormen.
3. Wormen kweken in compostmicrokosmos
- Voeg 500-1000 eieren of L1-larven3 toe aan elke microkosmos en aan de proxyplaat (stap 2.7) om het experiment te starten (figuur 1D).
OPMERKING: De hier beschreven experimenten maken gebruik van N2 wild-type wormen. Andere C. elegans-stammen (en mogelijk andere nematoden) kunnen echter worden gebruikt. - Verhoog de wormen tot volwassenheid bij 20 °C (meestal 3 dagen).
Figuur 1: Compostmicrokosmos bereiden, wormen kweken en oogsten. (A) Verrijk de lokale grond of compost met producten en incubeer gedurende 2 weken. Combineer (B) geautoclaveerde verrijkte grond met (C) microbieel extract en (D) incubeer gedurende ten minste 24 uur voordat u gesynchroniseerde L1s-wormen aan microkosmos toevoegt om het experiment te starten. (E, F) Wanneer u klaar bent om te oogsten, voegt u compost uit de microkosmos toe aan een Baermann-trechtersteuncilinder en dek u af met M9. (G) Laat het filtraat na 15 minuten los in een buis van 50 ml. Afkorting: sup. = supernatant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Een Baermann-trechter voorbereiden voor het oogsten van wormen
- Monteer een Baermann-trechter door 5-8 cm stijve rubberen buis aan het uiteinde van een plastic trechter te bevestigen.
- Schuif een klem op de slang en klem deze dicht.
- Plaats in de trechter een 7 cm lange, 5 cm diameter, cilindrische PVC-buis met een nylon gaas van 1 mm aan de onderkant gelijmd (figuur 1E). Bekleed de cilinder met twee vellen tissuepapier.
- Plaats de Baermann-trechter in een kolf (figuur 1F).
5. Wormen uit microkosmos oogsten en de respectievelijke bodemmonsters verzamelen
- Voeg 20 ml M9 toe aan de microkosmos waarin de wormen zijn opgetild, roer het mengsel en giet het mengsel vervolgens uit het bekerglas in de met tissuepapier beklede cilinder in de Baermann-trechteropstelling. Voeg meer M9 toe om de compost volledig onder te dompelen in de trechter.
OPMERKING: C. elegans (N2) populaties bereiken de volwassenheid in compostmicrokosmos met een vergelijkbaar tempo als op standaard agarplaten bezaaid met Escherichia coli. Voor verdere nauwkeurigheid bij het oogsten van wormen in een specifiek ontwikkelingsstadium, raadpleegt u de proxyplaat uit stap 3.3. - Maak na 30 minuten de klem los om het filtraat met de geoogste wormen vrij te maken in een buis van 50 ml (figuur 1G).
- Voeg meer M9 toe aan de cilinder en herhaal dit voor een tweede ronde om meer wormen te oogsten, en nogmaals als er extra wormen nodig zijn.
OPMERKING: Wanneer u oogstrondes herhaalt, moet u oppassen dat u de integriteit van het tissuepapier niet in gevaar brengt, waardoor bodemdeeltjes kunnen passeren. Een maximum van vier oogstrondes moet ten minste 50% van de wormen isoleren die oorspronkelijk aan de microkosmos zijn toegevoegd zonder de integriteit van tissuepapier in gevaar te brengen. - Concentreer de wormen door gedurende 2 minuten te centrifugeren op 560 × g (RT). Verwijder 35 ml van het supernatant met een serologische pipet.
- Breng de resterende 15 ml over in een buis van 15 ml en centrifugeer opnieuw op 560 × g gedurende 1 minuut om de wormen verder te concentreren. Verwijder 14 ml van het supernatant met een serologische pipet.
- Verzamel tegelijkertijd 1 g van de resterende microkosmosgrond in een buis van 1,5 ml. Verwerk de bodemmonsters die de milieubacteriële gemeenschap bevatten onmiddellijk of bewaar ze bij −20 °C voor latere extractie van nucleïnezuren, zoals hieronder beschreven voor wormmonsters.
6. Wassen en oppervlaktesterilisatie van geoogste wormen
- Breng 1 ml van de geconcentreerde, geoogste wormen over van stap 5,5 naar een buis van 1,5 ml met behulp van een glazen pipet. Incubeer gedurende 2 minuten om de wormen op de bodem van de buis te laten bezinken. Verwijder het supernatant en laat de onderste 100 μL ongestoord.
- Was 6x met 1,5 ml M9+T (0,025% Triton-X in M9), zodat de wormen zich telkens op de bodem kunnen nestelen.
- Breng de gewassen wormen in een volume van 100 μL over naar een nieuwe buis van 1,5 ml met behulp van een glazen pipet.
OPMERKING: Op dit punt in het protocol zou ongeveer 30 minuten moeten zijn verstreken sinds de eerste wasbeurt (stap 6.2). Het wordt aanbevolen om de wormen ten minste 1 uur zonder voedsel te laten blijven voordat levamisol wordt toegevoegd om de uitscheiding van voorbijgaande bacteriën en de volledige vertering van voedselbacteriën mogelijk te maken. - Voeg 100 μL 25 mM levamisolhydrochloride toe om de wormen te verlammen. Incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg 200 μL 4% bleekoplossing toe. Incubeer gedurende 2 min.
- Verwijder het supernatant, laat de onderste 150 μL ongestoord en was 3x met M9+T, zoals hierboven.
OPMERKING: Om de verontreiniging van de monsters te minimaliseren, wordt aanbevolen om gefilterde M9 + T te gebruiken (door een filter van 0,2 μm) en vanaf dit punt handschoenen te dragen. - Neem na de wasbeurten 50 μL van de resterende 150 μL uit de laatste wasbeurt en plaat op een LB-plaat, broedend bij 25 °C gedurende 48 uur om de effectieve verwijdering van externe bacteriën te bevestigen.
OPMERKING: Het observeren van maximaal 30 kolonies in de laatste wasbeurt (die 60 externe bacteriële cellen vertegenwoordigen die in totaal in het monster achterblijven) is toegestaan en zal naar verwachting slechts een marginale bijdrage leveren aan de geanalyseerde samenstelling van het microbioom, gezien de duizenden bacteriën die doorgaans elke volwassen worm koloniseren15. Wanneer er meer worden waargenomen, kan de integriteit van monsters in het gedrang komen. - Gebruik de oppervlakte-gesteriliseerde wormen onmiddellijk (bijvoorbeeld om levende bacteriën te extraheren voor het kweken [CFU-tellingen]) of bewaar bij −20 °C voor de daaropvolgende extractie van nucleïnezuren.
7. DNA-extractie
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven DNA-extractie van de geoogste wormen met behulp van een commerciële kit die is ontworpen voor de extractie van microbieel DNA uit de bodem (zie tabel met materialen), met wijzigingen die hieronder worden beschreven om de extractie van microbieel DNA uit wormen te vergemakkelijken.
- Breng het monster met oppervlakte-gesteriliseerde wormen (ontdooi indien nodig op RT) over naar de buizen die door de kit worden geleverd en vervang de meegeleverde glasparels door zirkoniakralen met een diameter van ongeveer 30-50 1 mm (zie materiaaltabel).
OPMERKING: De waargenomen DNA-opbrengsten zijn hoger met zirkonia-kralen dan met de glasparels die door de kit worden geleverd. Hoewel de reden achter deze waarneming nog steeds niet bekend is, kunnen zirkonia-kralen de nagelriem efficiënter openbreken, waardoor meer bacteriën vrijkomen. - Voeg voor compostmonsters ongeveer 250 mg van de verzamelde grond toe aan de buizen van de kit zonder de glaskralen te vervangen.
- Na de toevoeging van de bufferoplossing die door de kit aan alle monsters wordt geleverd, homogeniseert u met een vermogenshomogenisator bij RT (zie Materiaaltabel) gedurende twee rondes van 2.000 tpm gedurende elk 30 s, pauzeer gedurende 30 s ertussen.
- Voltooi de resterende DNA-zuiveringsstappen volgens het kitprotocol. Eluteer de wormmonsters in niet meer dan 50 μL elutiebuffer om DNA-concentraties te garanderen die hoog genoeg zijn voor sequencing.
Representative Results
Om het vermogen te onderzoeken om de gemeenschap van bodemmicrokosmos te diversifiëren, vergeleken we de microbiële gemeenschappen in compostmicrokosmos bereid door dezelfde initiële bodem te verrijken, een compost van industriële kwaliteit die beschikbaar is in de stad Berkeley, Californië, met verschillende producten: appels, paprika's, sinaasappels of aardappelen (elk in drievoud). We vergeleken verder de microbiële gemeenschappen van elke compostomgeving met het darmmicrobioom van wild-type C. elegans die in de respectieve microkosmos zijn opgegroeid. Analyse werd uitgevoerd met DNA-monsters geëxtraheerd van ongeveer 500 oppervlakte-gesteriliseerde volwassenen per microkosmos en van 250 mg compostmonsters van de respectieve microkosmos.
Karakterisering van de omgevingsbodem en darmmicrobiomen van wormen was gebaseerd op de volgende generatie sequencing van het V4-gebied van het bacteriële 16S-rRNA-gen. Sequencing bibliotheekvoorbereiding werd bereikt met behulp van de standaardkits en uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, met sequencing uitgevoerd op een commerciële sequencer (zie Materiaaltabel). Gedemultiplexeerde sequenties werden verwerkt met behulp van DADA2, toegewezen taxonomie op basis van de SILVA v132 referentiedatabase, en geanalyseerd met phyloseq 16,17,18 (zie Aanvullend bestand 1, Aanvullend figuur S1, Aanvullend figuur S2, Aanvullend figuur S3, Aanvullende tabel S1 en Aanvullende tabel S2 voor een gedetailleerde beschrijving van de volgorde en analyse; de volledige computationele pijplijn is beschikbaar in GitHub [https://github.com/kennytrang/CompostMicrocosms]). Ruwe gegevens zijn beschikbaar op het NCBI Sequence Read Archive (Bioproject ID PRJNA856419).
Gemiddeld werden 73.220 sequenties per monster verkregen. Deze sequenties vertegenwoordigen 15.027 ampliconsequentievarianten (ASV's), verspreid over 27 phyla en 216 families, waaronder families die worden beschouwd als onderdeel van het kern C. elegans darmmicrobioom13, zoals Rhizobiaceae, Burkholderiaceae en Bacillaceae. Enterobacteriaceae en Pseudomonadaceae, die eerder dominante leden bleken te zijn, waren deze keer een minderheid, maar waren nog steeds verrijkt (2-10-voudig) in vergelijking met hun respectieve bodemmilieus. Vergelijkingen op basis van zowel ongewogen als gewogen UniFrac19,20 afstanden toonden een goede reproduceerbaarheid tussen microkosmostriplicaten verrijkt met hetzelfde product, zoals aangegeven door nauwe clustering. Daarentegen zijn milieubodemmicrobiomen verrijkt met verschillende producten geclusterd van elkaar, wat het vermogen aantoont om een initiële microbiële gemeenschap te diversifiëren door de toevoeging van verschillende producten (figuur 2).
In vergelijkingen van wormdarmmicrobiomen en milieugemeenschappen toonde de hoofdcoördinaatanalyse (PCoA) met ongewogen of gewogen UniFrac-afstanden een duidelijke clustering van wormdarmmicrobiomen weg van die van hun respectieve omgevingen voor elk microkosmostype (figuur 2). Terwijl PCoA op basis van ongewogen UniFrac-afstanden geen onderscheid maakte tussen bodem- en wormmicrobiomen (figuur 2A), onthulde clustering op basis van gewogen afstanden een duidelijke scheiding van wormdarm- en compostmicrobiomen (figuur 2B). Deze resultaten ondersteunen een proces waarin gastheerfiltering werkt op de beschikbaarheid van het milieu om een darmmicrobioom te vormen dat niet volledig verschilt van zijn milieubron met betrekking tot de aanwezigheid van taxa, maar hun overvloed moduleert door te verrijken voor een deel van de beschikbare taxa, wat uiteindelijk resulteert in een kernworm darmmicrobioom gedeeld tussen wormen die in verschillende omgevingen zijn opgegroeid.
Figuur 2: Worm darmmicrobiomen clusteren weg van hun respectievelijke product-gediversifieerde microbiële omgevingen. De samenstelling van het microbioom werd bepaald met 16S-sequencing en gemeenschappen van microkosmos verrijkt met de aangewezen producten of van wormen die erin werden gekweekt, werden geclusterd met behulp van PCoA op basis van (A) ongewogen of (B) gewogen UniFrac-afstanden. De getoonde assen zijn die welke de grootste variatie in gemeenschapssamenstelling tussen monsters verklaren (N = 3 voor elk microkosmostype). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Next-generation sequencing en data-analyse. Hier worden de stappen gepresenteerd voor bibliotheekvoorbereiding, in-lab sequencing en data-analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Een voorbeeld van een kwaliteitscontrolegrafiek voor de reverse leest van één monster. De X-as (cyclus) toont de nucleotidepositie langs de afgelezen reeks. De linker Y-as toont de kwaliteitsscore. De grijswaarden heatmap geeft de frequentie van de kwaliteitsscore op elke nucleotidepositie weer; de groene lijn geeft de mediane kwaliteitsscore op elke nucleotidepositie weer; de bovenste oranje lijn geeft de kwartielen van de kwaliteitsscoreverdeling weer; de onderste rode lijn geeft het percentage sequentielezingen weer dat die nucleotidepositie verlengde (rechter Y-as, hier 100%). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Foutpercentages voor verschillende steekproeven. De foutfrequentie in de verschillende steekproeven (zwarte stippen) zou moeten afnemen met een toenemende kwaliteitsscore voor elke mogelijke basispaarvervanging die wordt afgebeeld, wat de verwachte trend weerspiegelt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Een voorbeeld van PCoA op basis van gewogen UniFrac-afstanden. De groepsnamen in de legenda vertegenwoordigen de producten die worden gebruikt om de compost te verrijken die in de verschillende microkosmos wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Sequentiële sequentiefiltering. een Aantal sequentielezingen voordat u filtert. b-d Elke kolom vertegenwoordigt het aantal sequentielezingen dat overblijft na een filtratiestap: het filteren van leeswaarden van lage kwaliteit (stap 2.5), het denoe-algoritme uitgevoerd door dada() (stap 2.8), het samenvoegen van voorwaartse en omgekeerde reads (stap 2.9) en het verwijderen van chimera's (stap 2.11). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S2: Tabel met metagegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een methode om het darmmicrobioom van nematoden te bestuderen die in natuurlijke omgevingen zijn opgegroeid, en biedt een alternatieve benadering voor de isolatie van wormen uit de natuur of voor het verhogen ervan op synthetische gemeenschappen.
De duizenden potentiële bacteriesoorten die zijn vastgelegd in het representatieve microkosmosexperiment weerspiegelen de microbiële diversiteit waarmee de wormen zijn geëvolueerd en tonen het vermogen van de microkosmospijplijn om de voordelen van het werken met een modelgastorganisme en die van het werken met natuurlijke, diverse microbiële gemeenschappen te combineren.
De representatieve resultaten tonen aan dat het verrijken van een gemeenschappelijke bodem met verschillende producttypen de microbiële diversiteit in het milieu moduleert, wat het bereik van microbiële diversiteit benadrukt dat beschikbaar is voor exploratie met behulp van deze pijplijn. Productkeuze is niet bijzonder belangrijk. Eerder werk heeft bananen, appels, sinaasappels, aardbeien, groene theebladeren en aardappelen gebruikt om de bodem te verrijken, wat resulteert in een vergelijkbare efficiëntie van de worm. Gemengde producten zijn ook effectief gebruikt. Het belangrijkste kenmerk is dat verschillende producten een bepaalde bodem op verschillende manieren zullen diversifiëren.
Ondanks de grote variatie in microbiële diversiteit in het milieu, variëren de darmmicrobiomen van wormen aanzienlijk minder, waardoor het belang van de wormdarmniche en gastheerfiltering voor de assemblage van een kerndarmmicrobioom dat verschilt van dat van zijn bodemomgevingwordt samengevat 13. Dit patroon wordt het best waargenomen met gewogen UniFrac PCoA-analyse, waaruit blijkt dat de verschillen tussen milieubodem en wormdarmenmicrobiomen meestal voortkomen uit verschillen in de relatieve abundantie van belangrijke taxa.
Hoewel het hier beschreven protocol zich richt op het oogsten van wormen voor 16S-sequencing, kunnen microkosmos worden gebruikt om aanvullende vragen van belang te onderzoeken. Wormen geoogst uit microkosmos kunnen bijvoorbeeld vervolgens worden onderzocht op het effect van een divers darmmicrobioom op de resistentie van de gastheer tegen verschillende ongunstige omstandigheden, waaronder pathogenen of toxines. Als alternatief kunnen nieuwe bacteriesoorten en stammen worden geïsoleerd en gekweekt uit op de grond geoogste wormen, waardoor de taxonomische en functionele diversiteit van bacteriën die beschikbaar zijn om experimenten mee uit te voeren, wordt uitgebreid.
Terwijl onderzoeksmethoden in laboratoriumomgevingen consistentie en reproduceerbaarheid nastreven, maakt het werken met microkosmos gebruik van de natuurlijke variatie om gastheer-microbe-interacties in een natuurlijk-achtige context te onderzoeken. Toch brengt deze variatie ook enkele uitdagingen met zich mee. Sommige bodems met hoge niveaus van endogene ongewervelde dieren kunnen extra centrifugatie, filtratie en onderzoeksmaatregelen vereisen om ongewenste organismen effectief uit de microkosmosvoorbereiding te verwijderen. Bovendien kan een lage microbiële abundantie in de bodem ongewenste dauervorming in wormpopulaties veroorzaken, waardoor een toename van microbieel extract nodig is of de bodem wordt verrijkt met een grotere hoeveelheid producten. Met elk uitgevoerd microkosmosexperiment blijven onderzoekers de volledige taxonomische en functionele diversiteit van de natuur verkennen, waardoor nieuwe microbiële taxa en functionele vaardigheden kunnen worden ontdekt, variërend van infectieresistentie tot bescherming tegen xenobiotica uit het milieu.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren die relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.
Acknowledgments
Het werk dat in dit manuscript wordt beschreven, werd ondersteund door NIH-subsidies R01OD024780 en R01AG061302. K.T. werd verder ondersteund door een Summer Undergraduate Research Fellowship van de University of California, Berkeley, gefinancierd door de Rose Hills Foundation. Cartoonontwerpen in figuur 1 werden verkregen van BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
| Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
| DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
| dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
| Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
| Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
| Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
| M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
| MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
| MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
| Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
| PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
| Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |
References
- Shapira, M. Host-microbiota interactions in Caenorhabditis elegans and their significance. Current Opinion in Microbiology. 38, 142-147 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 285 (2017).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 7-8 (2006).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10, 604 (2019).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 81 (2), 514-520 (2013).
- Frézal, L., Félix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: Gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14 (1), 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Berg, M., Zhou, X. Y., Shapira, M. Host-specific functional significance of Caenorhabditis gut commensals. Frontiers in Microbiology. 7, 1622 (2016).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Slowinski, S., et al. Interactions with a complex microbiota mediate a trade-off between the host development rate and heat stress resistance. Microorganisms. 8 (11), 1-9 (2020).
- Pérez-Carrascal, O. M., et al. Host preference of beneficial commensals in a microbially-diverse environment. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 795343 (2022).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 590-596 (2013).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
