Summary
本协议描述了一种在小麦中长距离运输全氟烷基酸的简单有效的方法。
Abstract
大量的全氟烷基酸（PFAAs）被引入土壤并由植物积累，对人类健康构成潜在风险。必须研究植物内PFAA的积累和易位。长距离运输是PFAA通过韧皮部从植物叶子转移到可食用组织的重要途径。然而，以前很难在短期接触期内评估有机污染的易位潜力。裂根实验提供了一种使用水培实验有效揭示PFAAs长距离易位的解决方案，在本研究中，该实验在两个50 mL离心管（A和B）中进行，其中离心管A具有50 mL四分之一强度的Hoagland无菌营养液，而离心管B具有相同的营养浓度， 以及以给定浓度添加的目标PFAA（全氟辛烷磺酸，PFOS和全氟辛烷酸，PFOA）。将全麦根手动分成两部分，并小心地插入管A和B中。在培养箱中培养7 d并收获后，分别使用LC-MS / MS评估根，小麦芽和管A和B中的溶液中PFAA的浓度。结果表明，PFOA和PFOS经历了类似的长距离运输过程，通过韧皮部从芽到根部，并可能释放到周围环境中。因此，裂根技术可用于评估不同化学品的长距离传输。
Introduction
全氟烷基酸（PFAAs）由于其优异的物理化学性质，包括表面活性以及热稳定性和化学稳定性1，2，3，广泛用于各种商业和工业产品。全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛烷酸（PFOA）是全球使用的两种最重要的PFAAs4，5，6，尽管这些化合物分别于2009年和2019年被列入国际斯德哥尔摩公约7，8。全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸由于其持久性和广泛使用，已在各种环境基质中得到广泛检测。全球不同河流和湖泊地表水中全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸的浓度分别为0.15-52.8纳克/升和0.09-29.7纳克/升9。由于使用地下水或再生水进行灌溉，也使用生物固体作为肥料，全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸广泛存在于土壤中，分别为0.01-123微克/千克和0.003-162微克/千克，10，这可能将大量全氟辛烷磺酸引入植物，对人类健康构成潜在风险。农业土壤和谷物（小麦和玉米）中的PFAA（C4-C8）浓度呈正线性相关11。因此，研究PFAAs在植物内的积累和易位势在必行。
植物中PFAAs的易位首先发生在根部到地上组织，PFAAs从根部到食用组织的易位被认为是长距离运输12，13。以前的研究已经在蔬菜和水果中检测到双酚A，壬基酚和天然雌激素14，这意味着这些化学物质可能通过韧皮部迁移。因此，揭示植物中PFAA的易位对于评估其潜在风险非常重要。然而，PFAAs的积累和易位受其在土壤中的生物利用度的影响，因此评估目标PFAAs在植物中的易位能力并不容易。此外，水培实验通常受到多种因素的限制，使得获得植物的可食用组织变得更加困难。通常，韧皮部直接从植物中收集，以观察有机化合物在植物中长距离的易位，而很难从植物幼苗中获取韧皮部15。因此，引入一种简单有效的方法，即分根技术，用于研究植物中PFAAs在相对短期暴露下的易位。至于分根研究，将一株植物幼苗的根分成两部分;一部分放入含有目标PFAA的营养液（管A），另一部分在没有PFAA的情况下放入营养液（管B）。暴露几天后，通过LC-MS / MS测量管B中的PFAA。管B中PFAA的浓度揭示了PFAAs通过植物内韧皮部的易位潜力16，17，18。
据报道，裂根实验用于研究植物中许多化合物的长距离易位，例如CuO纳米颗粒17，类固醇雌激素18和有机磷酸酯16。这些研究提供了证据，证明这些化合物可以通过韧皮部转移到植物的可食用部分。然而，PFAAs是否有助于植物的易位以及化合物特性的影响需要进一步探索。基于这些报道，本研究进行了分根实验，以揭示PFAAs在小麦中的长距离运输。
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Protocol
小麦种子小麦种子小麦L .被采购（见 材料表）并用于本研究。
1.小麦幼苗萌发与水培培养
- 选择大小相似的小麦种子，并用8%（w / w）过氧化氢溶液消毒15分钟。
- 消毒后的种子用去离子水彻底冲洗，然后在室温下在黑暗中将其置于潮湿的滤纸上发芽5天。
- 选择大约九个大小均匀的发芽幼苗，并将它们转移到装有250 mL营养液（Hoagland溶液的1/4强度;其化学成分如 表1所示）的塑料烧杯中。
注：在九颗种子中，分别选择了三种用于空白、全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸。 - 在暴露前在生长室中培养幼苗7天，在22°C下循环14小时，在27°C下循环10小时。
2.根分裂实验
- 在两个 50 mL 离心管（A 和 B）中进行幼苗培养。
注意：在离心管A中，存在50mL无菌1/4强度的Hoagland溶液，离心管B中存在相同量的营养液。- 将商用PFOA和PFOS（见 材料表）溶解在甲醇中，并用无菌营养液作为储备溶液稀释。然后，将储备溶液加入全氟辛烷磺酸/全氟辛烷磺酸浓度为100微克/升的试管B中。
- 使用空白对照一式三份进行处理，以监测背景污染。分裂根暴露实验的示意图如图 1所示。
- 用镊子将小麦幼苗的整个根分成两个相等的部分，使根仍然钩在同一条枝上，并小心地将它们分别插入管A和B中。
- 用铝箔密封两个管，并在培养箱中培养7天。保持与步骤1.4中所述相同的孵育条件。
- 培养7天后收集小麦幼苗，并使用无菌剪刀将小麦分成三部分：分别在PFAAs的加标溶液和未加标溶液中培养的芽和根。
- 在-55°C的冻干机中冷冻干燥植物样品48小时。
- 均质化并称量根和芽样品。收集加标和未加标的溶液样品。
3. 从植物组织中提取全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸
- 将 2 mL 碳酸钠缓冲液 （0.25 mol/L）、1 mL 四丁基硫酸氢铵 （0.5 mol/L） 和 5 mL 甲基叔丁基醚（参见 材料表）加入 15 mL 聚丙烯管中，包括均质化的根或芽。
- 以250rpm摇动管20分钟，并在室温下以2，000× g 离心10分钟，以获得上清液有机相。执行提取过程两次。
- 混合收集的提取物，在温和的氮气（N2）流中蒸发至干，然后用5mL甲醇复溶并涡旋它们，保持相同的速度约30秒。
- 用 5 mL 0.1% NH4OH 的甲醇溶液、5 mL 水和 5 mL 甲醇调节害虫威药筒（参见材料表）。
- 通过瘟毒威盒（500 mg/6 mL）加入 5 mL 提取甲醇溶液以去除色素，用 5 mL 甲醇洗脱滤芯，并收集在同一管中。
- 将收集的 10 mL 甲醇溶液蒸发至几乎干燥，并用 200 μL 甲醇复溶，然后在室温下以 10，000 x g 涡旋离心 20 分钟。
4. 从营养液制备样品
- 用 5 mL 甲醇和 5 mL 水调节以激活极性增强聚合物 （PEP） 提取柱（60 mg/g，3 mL）（参见 材料表）。
- 分别通过小柱加入 1 mL 加标溶液或 50 mL 未加标溶液样品（步骤 2.6）。
- 用 10 mL 甲醇洗脱目标 PFAA，用温和的 N2 蒸发提取物，然后用 200 μL 甲醇复溶进行分析。
5. 仪器分析
- 使用超高效液相色谱UPLC联合串联质谱（LC-MS/MS）在多反应模式（MRM）和负电喷雾电离（ESI-）下定量目标PFAA（参见 材料表）。
- 进样10 μL样品，使用C18液相色谱柱（1.7 μm，2.1 mm x 50 mm，参见 材料表）分离目标PFAA，并使用2 mM乙酸铵的水溶液（A相）和甲醇（B相）作为UPLC的流动相，流速为0.3 mL/min。将柱温保持在50°C。
注：PFOA和PFOS的离子跃迁分别为413至369和499至80。用于定量目标PFAA的梯度洗脱程序和LC-MS/MS仪器参数如 表2所示。 - 使用数据分析软件处理数据（见 材料表）。
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Representative Results
分根实验研究了PFAAs在小麦中的长距离运输。如图 2A，C所示，全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸都可以被小麦根部吸收并转移到枝条上。在空白对照的试管A中的小麦根和溶液中未检测到PFOS和PFOA。研究发现，在未加标溶液中培养的小麦根系中检测到全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸，浓度分别为0.26纳克/克±0.02纳克/克和0.64纳克/克±0.05纳克/克干重（dw）（n=3），分别占全麦植株积累量的1.5%和1.8%。这一结果表明，全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸可以通过韧皮部从枝条到根部进行长距离迁移。值得注意的是，在未加标的营养液中也发现了全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸，浓度分别为17.8纳克/升±0.28纳克/升和28.5纳克/升±5.9纳克/升（n=3），这表明全氟辛烷磺酸和全氟辛烷磺酸可以通过卡斯帕里亚根带19，20 并释放到周围环境中。本工作的结果提供了确凿的证据，证明长距离运输也是小麦消除PFAA的重要途径。
图 1：分裂根实验的示意图。 将小麦幼苗的整个根平均分成两部分，并小心地插入管（A）和（B）中。使用带有匹配海绵的水培塑料根保持器连接两个管并固定幼苗。空白组设置为A中的解决方案;B管都是无加标的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：暴露7天后裂根实验中PFOA和PFOS浓度的分布。 加标溶液（含有目标PFAA的溶液）、加标根（加标PFAAs溶液中的根）和（A）PFOA和（C）全氟辛烷磺酸的芽。（B）全氟辛烷磺酸（D）和全氟辛烷磺酸的未加标溶液（不含PFAA的溶液）和未加标根（根在未加标溶液中）。误差线表示标准偏差 （n = 3）。缩写：dw = 干重。 请点击此处查看此图的大图。
| 元件 | 分子量 | 储备液浓度（克/升） | 每升最终溶液的储备溶液体积（mL） | 元素 | 营养液中元素的最终浓度（ppm） |
| 宏量营养素 | |||||
| 旋钮3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| 钙（3号）2.4H2O | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH 4 H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | 钙 | 40 |
| 镁硫4.7H2O | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| 毫克 | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| 铁（EDTA-FeNa） | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | 铁 | 0.28 |
| 微量营养素 | |||||
| H 3BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| 氯化锰2.4H2O | 197.91 | 1.81 | 锰 | 0.125 | |
| 氧化锌4.7H2O | 287.56 | 0.22 | 锌 | 0.0125 | |
| 铜4 | 159.61 | 0.051 | 铜 | 0.005 | |
| H2月O4（85% 月O 3） | 161.97 | 0.017 | 莫 | 0.0025 |
表1：1/4强度霍格兰营养液的化学成分。 该营养液代表裂根实验中的未加标溶液。
| 柱温 | 50 °C | |||||
| 流动相 | 2 mM 乙酸铵在水 pH = 9 （A） 和甲醇 （B） 中的溶液 | |||||
| 梯度 | 时间（分钟） | 流速（毫升/分钟） | A (%) | B (%) | ||
| 初 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 质量参数 | 毛细管电压：-1.5 kV | |||||
| 脱溶剂温度 500°C | ||||||
| 脱溶剂气体流量：1000升/小时 | ||||||
| 锥形气体流量：150 L/h | ||||||
| 倍数 | 化合物 | 母离子 | 积离子 （米/z） | |||
| 反应 | （米/兹） | |||||
| 监测 | ||||||
| （马哎呀） | 全氟辛烷磺酸 | 413 | 369 | |||
| 转换 | 全氟辛烷磺酸 | 499 | 80 | |||
表 2：用于定量目标 PFAA 的 LC-MS/MS 仪器参数。
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Discussion
为确保该方法的准确性，必须谨慎操作，以确保管B中的加标溶液不会污染管A中的未加标溶液。本研究中给定的目标PFAAs浓度相对高于其在真实环境中的浓度，确保使用LC-MS/MS监测小麦和未加标溶液中的目标PFAAs。
此方法存在局限性。由于每个处理组仅使用一株小麦幼苗，并且根被分成两半，如果加标溶液的初始浓度相对较低，则从最终处理中获得的生物量越少，可能导致在未加标溶液中培养的根中PFAA的浓度低于检测限。此外，由于暴露时间短，无法确定PFAA从小麦根部到可食用部分的运输。裂根实验只能分析植物内不同性质的PFAAs的韧皮部转运16。
该方法对于理解污染物在植物组织中的长距离迁移12、13 具有重要意义。根据结果，PFAAs可以被根部吸收并主要通过木质部输送到枝条;然而，需要注意的是，它们可以通过韧皮部从叶子转移到可食用组织，以及从芽转移到根部，这对于评估它们在植物中易位的潜在风险很重要。此外，PFAAs从地上组织转移到根部，然后释放到周围环境中，为植物中PFAAs的消除途径提供了坚实的证据。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们衷心感谢国家自然科学基金（NSFC 21737003）、中国高校科学基金（第2452021103号）和中国博士后科学基金（编号：2021M692651，2021M702680）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
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