Summary
Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour le transport sur de longues distances des acides perfluoroalkyliques dans le blé.
Abstract
De grandes quantités d’acides perfluoroalkyliques (APFA) ont été introduites dans le sol et accumulées par les plantes, ce qui pose des risques potentiels pour la santé humaine. Il est impératif d’étudier l’accumulation et la translocation des APFC dans les plantes. Le transport sur de longues distances est une voie importante pour les APFA transférés des feuilles de la plante aux tissus comestibles par le phloème. Cependant, il était auparavant difficile d’évaluer le potentiel de translocation de la contamination organique au cours d’une période d’exposition à court terme. L’expérience à racines fendues fournit une solution pour découvrir efficacement la translocation à longue distance des APFA à l’aide d’une expérience hydroponique, qui, dans cette étude, a été réalisée dans deux tubes à centrifuger de 50 mL (A et B), dont le tube à centrifuger A contenait 50 mL de solution nutritive stérile Hoagland d’un quart de concentration, tandis que le tube de centrifugation B avait la même concentration en nutriments. et les APFA cibles (acide perfluorooctane sulfonique, SPFO, et acide perfluorooctane, APFO) ajoutées à une concentration donnée. Une racine de blé entière a été séparée manuellement en deux parties et insérée avec précaution dans les tubes A et B. La concentration d’APFA dans les racines, les pousses de blé et les solutions dans les tubes A et B a été évaluée à l’aide de LC-MS/MS, respectivement, après avoir été cultivée dans un incubateur pendant 7 jours et récoltée. Les résultats suggèrent que l’APFO et le SPFO subissent un processus de transport sur de longues distances similaire à travers le phloème de la pousse à la racine et pourraient être libérés dans l’environnement ambiant. Ainsi, la technique de la racine fendue peut être utilisée pour évaluer le transport sur de longues distances de différents produits chimiques.
Introduction
Les acides perfluoroalkylés (PFAA) sont largement utilisés dans divers produits commerciaux et industriels en raison de leurs excellentes propriétés physicochimiques, y compris l’activité de surface et la stabilité thermique et chimique 1,2,3. L’acide perfluorooctane sulfonique (SPFO) et l’acide perfluorooctane (APFO) sont les deux principaux APFA utilisés dans le monde 4,5,6, bien que ces composés aient été inscrits dans la Convention internationale de Stockholm en 2009 et 2019 7,8, respectivement. En raison de leur persistance et de leur utilisation répandue, le SPFO et l’APFO ont été largement détectés dans diverses matrices environnementales. Les concentrations d’APFO et de SPFO dans les eaux de surface de différents fleuves et lacs du monde sont respectivement de 0,15 à 52,8 ng/L et de 0,09 à 29,7 ng/L, respectivement9. En raison de l’utilisation d’eau souterraine ou d’eau de récupération pour l’irrigation et de l’utilisation de biosolides comme engrais, l’APFO et le SPFO sont largement présents dans le sol, variant entre 0,01 et 123 μg/kg et entre 0,003 et 162 μg/kg, respectivement10, ce qui pourrait introduire une grande quantité d’APFC dans les plantes et poser des risques potentiels pour la santé humaine. Les concentrations de PFAA (C4-C8) dans les sols agricoles et les céréales (blé et maïs) montrent une corrélation linéaire positive11. Par conséquent, il est impératif d’étudier l’accumulation et la translocation des APFA dans les plantes.
La translocation des APFA dans les plantes se produit d’abord des racines vers les tissus aériens, et la translocation des APFA des racines vers les tissus comestibles est considérée comme un transport sur de longues distances12,13. Des études antérieures ont détecté du bisphénol A, du nonylphénol et des œstrogènes naturels dans les légumes et les fruits14, ce qui implique que ces produits chimiques pourraient migrer via le phloème. Par conséquent, il est important de découvrir la translocation des APFA dans les plantes pour évaluer leur risque potentiel. Cependant, l’accumulation et la translocation des APFA sont influencées par leur biodisponibilité dans le sol, de sorte qu’il n’est pas facile d’évaluer la capacité de translocation des APFA cibles dans les plantes. De plus, les expériences hydroponiques sont généralement limitées par plusieurs facteurs, ce qui rend plus difficile l’acquisition des tissus comestibles des plantes. Typiquement, le phloème a été recueilli directement sur les plantes pour observer la translocation des composés organiques sur de longues distances dans les plantes, alors qu’il est difficile d’acquérir des phloèmes à partir de plantsde plantes 15. Par conséquent, une méthode simple et efficace, la technique des racines fendues, a été introduite pour étudier la translocation des APFA dans les plantes lors d’une exposition à relativement court terme. En ce qui concerne l’étude de la racine fendue, les racines d’un plant plant sont séparées en deux parties; une partie est introduite dans la solution nutritive contenant les APFA cibles (tube A), et l’autre est placée dans la solution nutritive en l’absence d’APFA (tube B). Après une exposition de plusieurs jours, les APFA dans le tube B sont mesurés par LC-MS/MS. La concentration d’APFA dans le tube B révèle le potentiel de translocation des APFA à travers le phloème dans les plantes16,17,18.
L’expérience de racine fendue a été rapportée pour étudier la translocation à longue distance de nombreux composés dans les plantes, tels que les nanoparticules de CuO17, les œstrogènes stéroïdes 18 et les esters organophosphorés16. Ces études ont fourni des preuves que ces composés pouvaient être transférés via le phloème aux parties comestibles des plantes. Cependant, la question de savoir si les APFA pourraient aider à la translocation dans les plantes et l’impact des propriétés des composés doivent être explorées plus avant. Sur la base de ces rapports, l’expérience à racines fendues a été menée dans la présente étude pour divulguer le transport sur de longues distances des APFC dans le blé.
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Protocol
Des semences de blé, Triticum aestivum L., ont été achetées (voir le tableau des matières) et utilisées pour la présente étude.
1. Germination des semis de blé et culture hydroponique
- Choisissez des graines de blé de taille similaire et désinfectez-les pendant 15 minutes avec une solution de peroxyde d’hydrogène à 8 % (p/p).
- Rincez soigneusement les graines désinfectées à l’eau désionisée, puis placez-les sur du papier filtre humide à l’obscurité à température ambiante pour germer pendant 5 jours.
- Sélectionner environ neuf plantules germées de taille uniforme et les transférer dans des béchers en plastique avec 250 ml de solution nutritive (1/4 de la force de la solution de Hoagland; sa composition chimique est indiquée dans le tableau 1).
REMARQUE : Sur les neuf graines, trois ont été sélectionnées pour le blanc, l’APFO et le SPFO, respectivement. - Cultiver les plantules dans des chambres de croissance pendant 7 jours avant l’exposition avec un cycle de 14 h à 22 °C et de 10 h à 27 °C.
2. L’expérience de fractionnement des racines
- Effectuer la culture des plants dans deux tubes à centrifuger de 50 ml (A et B).
REMARQUE : Dans le tube à centrifuger A, 50 mL de solution stérile de Hoagland de concentration 1/4 était présente, et la même quantité de solution nutritive était présente dans le tube de centrifugation B.- Dissoudre l’APFO et le SPFO commerciaux (voir le tableau des matières) dans du méthanol et les diluer avec la solution nutritive stérile comme solution mère. Ensuite, ajouter la solution mère dans le tube B à une concentration d’APFO/SPFO de 100 μg/L.
- Effectuer les traitements en trois exemplaires avec une commande à blanc pour surveiller la contamination de fond. Un diagramme schématique des expériences d’exposition à racines fendues est présenté à la figure 1.
- Séparez les racines entières du semis de blé à l’aide d’une pince à épiler en deux parties égales afin que les racines soient toujours accrochées à la même pousse et insérez-les soigneusement dans les tubes A et B, respectivement.
- Scellez les deux tubes avec du papier d’aluminium et cultivez-les dans un incubateur pendant 7 jours. Maintenir les mêmes conditions d’incubation que celles indiquées à l’étape 1.4.
- Recueillir les plants de blé après 7 jours de culture et séparer le blé en trois parties: pousses et racines cultivées dans la solution enrichie d’AAFC et la solution non enrichie, respectivement, à l’aide de ciseaux stérilisés.
- Lyophiliser les échantillons de plantes dans un lyophilisateur à −55 °C pendant 48 h.
- Homogénéiser et peser les échantillons de racines et de pousses. Recueillir les échantillons de solution enrichie et non enrichie.
3. Extraction de l’APFO et du SPFO des tissus végétaux
- Ajouter 2 mL de tampon de carbonate de sodium (0,25 mol/L), 1 mL d’hydrogénosulfate de tétrabutylammonium (0,5 mol/L) et 5 mL d’éther méthyl tert-butylique (voir le tableau des matières) à un tube en polypropylène de 15 mL, y compris la racine ou la pousse homogénéisée.
- Agiter le tube à 250 tr/min pendant 20 min et centrifuger à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour obtenir la phase organique surnageante. Effectuez le processus d’extraction deux fois.
- Mélanger les extraits recueillis, vaporiser à sec dans un léger flux d’azote (N2), puis reconstituer avec 5 mL de méthanol et les vorter, en maintenant la même vitesse pendant environ 30 s.
- Conditionner la cartouche de pesticarbe (voir le tableau des matières) avec 5 mL de NH4OH à 0,1 % dans du méthanol, 5 mL d’eau et 5 mL de méthanol.
- Ajouter les 5 mL de solution d’extraction du méthanol à travers la cartouche de pesticarbe (500 mg/6 mL) pour enlever le pigment, éluer la cartouche avec 5 mL de méthanol et recueillir dans les mêmes tubes.
- Évaporer les 10 mL de solution de méthanol recueillie jusqu’à quasi-sécheresse et reconstituer avec 200 μL de méthanol, puis tourbillonner et centrifuger à 10 000 x g pendant 20 min à température ambiante.
4. Préparation de l’échantillon à partir de la solution nutritive
- Conditionner avec 5 mL de méthanol et 5 mL d’eau pour activer la cartouche d’extraction de polymère amélioré polaire (PEP) (60 mg/g, 3 mL) (voir le tableau des matériaux).
- Ajouter 1 mL de la solution enrichie ou 50 mL des échantillons de solution non enrichie (étape 2.6) dans la cartouche, respectivement.
- Éluer les APFA cibles avec 10 mL de méthanol, évaporer l’extrait avec du N2 doux, puis reconstituer avec 200 μL de méthanol pour analyse.
5. Analyse instrumentale
- Utiliser une chromatographie liquide ultra-performante UPLC couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour quantifier les APFA cibles en mode multi-réaction (MRM) et ionisation électrospray négative (ESI-) (voir le tableau des matériaux).
- Injecter 10 μL d’échantillons et séparer les APFA cibles à l’aide d’une colonne de chromatographie liquide en C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, voir le tableau des matériaux), et utiliser 2 mM d’acétate d’ammonium dans l’eau (phase A) et le méthanol (phase B) comme phase mobile pour l’UPLC, avec un débit de 0,3 mL/min. Maintenir la température de la colonne à 50 °C.
NOTA : Les transitions ioniques de l’APFO et du SPFO sont de 413 à 369 et de 499 à 80, respectivement. Le programme d’élution par gradient et les paramètres instrumentaux LC-MS/MS pour la quantification des APFA cibles sont énumérés au tableau 2. - Traitez les données avec le logiciel d’analyse des données (voir Tableau des matériaux).
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Representative Results
L’expérience à racines fendues a étudié le transport sur de longues distances des APFA dans le blé. Comme le montre la figure 2A, C, l’APFO et le SPFO pourraient être absorbés par la racine de blé et transférés à la pousse. Le SPFO et l’APFO n’ont pas été détectés dans la racine de blé et la solution dans le tube A de l’essai témoin vierge. Il a été constaté que le SPFO et l’APFO ont été détectés dans les racines de blé cultivées dans la solution non enrichie, avec une concentration de 0,26 ng/g ± 0,02 ng/g et 0,64 ng/g ± 0,05 ng/g de poids sec (poids sec) (n = 3), respectivement, qui représentent 1,5 % et 1,8 % de la quantité d’accumulation dans la plante de blé entier. Ce résultat suggère que le SPFO et l’APFO pourraient être transportés sur de longues distances à travers le phloème de la pousse à la racine. Il convient de noter que le SPFO et l’APFO ont également été trouvés dans la solution nutritive non enrichie avec une concentration de 17,8 ng/L ± 0,28 ng/L et de 28,5 ng/L ± 5,9 ng/L (n = 3), respectivement, ce qui donne à penser que l’APFO et le SPFO pourraient traverser la bande de Casparian19,20 racinaire et être rejetés dans l’environnement ambiant. Les résultats des travaux actuels fournissent des preuves solides que le transport sur de longues distances est également une voie importante pour le blé d’éliminer les APFA.
Figure 1 : Schéma des expériences de racines divisées. Les racines entières du plant de blé ont été séparées également en deux parties et soigneusement insérées dans des tubes (A) et (B). Un dispositif de retenue de racine en plastique hydroponique avec une éponge assortie a été utilisé pour connecter les deux tubes et fixer le semis. Le groupe vide est défini sur la solution dans A ; Les tubes B sont tous non dopés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Distribution des concentrations d’APFO et de SPFO dans l’expérience à racines fendues après 7 jours d’exposition. La solution enrichie (solution contenant les APFA cibles), la racine enrichie (racine dans une solution enrichie d’AAFA) et la pousse de (A) APFO et (C) de SPFO. Solution non enrichie (solution sans APFA) et racine non enrichie (racine dans une solution non enrichie) de (B) APFO (D) et SPFO. Les barres d’erreur indiquent les écarts-types (n = 3). Abréviation : dw = poids sec. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composant | Masse moléculaire | Conc. de solution mère (g/L) | Volume de solution mère par litre de solution finale (mL) | Élément | Conc. final de l’élément dans la solution nutritive (ppm) |
| Macronutriments | |||||
| KNO3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NO(3)2. 4H2O | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH4H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | CA | 40 |
| MgSO4. 7H2O | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| Mg | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| Fer (EDTA-FeNa) | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | Fe | 0.28 |
| Micronutriments | |||||
| H3 BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2. 4H2O | 197.91 | 1.81 | Mn | 0.125 | |
| ZnSO4. 7H2O | 287.56 | 0.22 | Zn | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | Cu | 0.005 | |
| H2MoO4 (85% MoO3) | 161.97 | 0.017 | Lu | 0.0025 |
Tableau 1 : Composition chimique de la solution nutritive Hoagland de concentration 1/4. Cette solution nutritive représente la solution non enrichie dans l’expérience de la racine fendue.
| Température de la colonne | 50 °C | |||||
| Phase mobile | Acétate d’ammonium 2 mM dans l’eau pH = 9 (A) et méthanol (B) | |||||
| Pente | Temps (min) | Débit (mL/min) | A (%) | B (%) | ||
| Initial | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| Paramètres de masse | Tension capillaire : -1,5 kV | |||||
| Température de désolvatation 500 °C | ||||||
| Débit de gaz de désolvatation : 1000 L/h | ||||||
| Débit de gaz du cône : 150 L/h | ||||||
| Multiple | Composés | Ions parents | Ions produit (m/z) | |||
| réaction | (h/z) | |||||
| surveillance | ||||||
| (MRM) | APFO | 413 | 369 | |||
| Transitions | SPFO | 499 | 80 | |||
Tableau 2 : Paramètres instrumentaux LC-MS/MS pour la quantification des APFA cibles.
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Discussion
Pour assurer la précision de cette méthode, une opération prudente doit être effectuée pour s’assurer que la solution enrichie dans le tube B ne contamine pas la solution non enrichie dans le tube A. La concentration donnée des APFA cibles dans la présente étude était relativement plus élevée que leur concentration dans l’environnement réel, ce qui permet de surveiller les APFA cibles dans le blé et les solutions non enrichies à l’aide de LC-MS/MS.
Il y a des limites à cette méthode. Étant donné qu’un seul semis de blé a été utilisé dans chaque groupe de traitement et que la racine a été divisée en deux, si la concentration initiale de la solution enrichie est relativement faible, moins la biomasse obtenue lors du traitement final peut entraîner une concentration d’APFA dans les racines cultivées dans la solution non enrichie inférieure à la limite de détection. De plus, en raison de la courte durée d’exposition, le transport de l’APFA des racines aux parties comestibles du blé n’a pas pu être déterminé. L’expérience à racines fendues n’a pu analyser que le transport du phloème des APFA ayant des propriétés différentes au sein des plantes16.
Cette méthode est d’une grande importance pour comprendre le transport sur de longues distances12,13 des polluants dans les tissus végétaux. Selon les résultats, les PFAA peuvent être absorbés par les racines et transportés vers les pousses principalement à travers le xylème; Cependant, il est à noter qu’ils pourraient être transférés des feuilles aux tissus comestibles, ainsi que des pousses aux racines à travers le phloème, ce qui est important pour l’évaluation de leur risque potentiel de translocation chez les plantes. De plus, la translocation des APFA des tissus aériens vers les racines, puis leur rejet dans l’environnement ambiant fournissent des preuves solides des voies d’élimination des APFA dans les plantes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la Fondation chinoise des sciences naturelles (NSFC 21737003), le Fonds scientifique des universités chinoises (n ° 2452021103) et la Fondation chinoise des sciences postdoctorales (n ° 2021M692651, 2021M702680).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
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