Summary
O presente protocolo descreve um método simples e eficiente para o transporte de longa distância de ácidos perfluoroalquil em trigo.
Abstract
Grandes quantidades de ácidos perfluoroalquil (PFAAs) foram introduzidas no solo e acumuladas pelas plantas, representando riscos potenciais para a saúde humana. É imperativo investigar o acúmulo e a translocação de PFAAs dentro das plantas. O transporte de longa distância é uma via importante para os PFAAs transferidos das folhas da planta para os tecidos comestíveis através do floema. No entanto, anteriormente era difícil avaliar o potencial de translocação da contaminação orgânica em um período de exposição de curto prazo. O experimento de raiz dividida fornece uma solução para descobrir efetivamente a translocação de longa distância de PFAAs usando um experimento hidropônico, que, neste estudo, foi realizado em dois tubos de centrífuga de 50 mL (A e B), dos quais o tubo de centrífuga A tinha 50 mL de solução nutritiva estéril de Hoagland de um quarto de força, enquanto o tubo de centrífuga B tinha a mesma quantidade de concentração de nutrientes, e os PFAAs alvo (ácido perfluorooctano sulfônico, PFOS e ácido perfluorooctano, PFOA) adicionados a uma determinada concentração. Uma raiz de trigo integral foi separada manualmente em duas partes e inserida cuidadosamente nos tubos A e B. A concentração de PFAAs nas raízes, parte aérea do trigo e soluções nos tubos A e B foi avaliada por LC-MS/MS, respectivamente, após ser cultivada em incubadora por 7 dias e colhida. Os resultados sugeriram que o PFOA e o PFOS experimentam um processo de transporte de longa distância semelhante através do floema da parte aérea até a raiz e poderiam ser liberados no ambiente ambiente. Assim, a técnica de raiz dividida pode ser usada para avaliar o transporte de longa distância de diferentes produtos químicos.
Introduction
Os ácidos perfluoroalquil (PFAAs) são amplamente utilizados em diversos produtos comerciais e industriais devido às suas excelentes propriedades físico-químicas, incluindo atividade superficial e estabilidade térmica e química 1,2,3. O ácido perfluorooctanosulfônico (PFOS) e o ácido perfluorooctano (PFOA) são os dois PFAAs mais importantes utilizados mundialmente 4,5,6, embora esses compostos tenham sido listados na Convenção Internacional de Estocolmo em 2009 e 2019 7,8, respectivamente. Devido à sua persistência e uso generalizado, PFOS e PFOA têm sido amplamente detectados em várias matrizes ambientais. As concentrações de PFOA e PFOS em águas superficiais de diferentes rios e lagos mundiais são de 0,15-52,8 ng/L e 0,09-29,7 ng/L, respectivamente9. Devido ao uso de água subterrânea ou água recuperada para irrigação e também usando biossólidos como fertilizante, PFOA e PFOS estão amplamente presentes no solo, variando entre 0,01-123 μg/kg e 0,003-162 μg/kg, respectivamente10, o que poderia introduzir uma grande quantidade de PFAAs nas plantas e representar riscos potenciais para a saúde humana. As concentrações de PFAA (C4-C8) em solo agrícola e grãos (trigo e milho) apresentam correlação linear positiva11. Portanto, é imperativo investigar o acúmulo e a translocação de PFAAs dentro das plantas.
A translocação de PFAAs em plantas ocorre primeiramente das raízes para os tecidos acima do solo, e a translocação de PFAAs das raízes para os tecidos comestíveis é considerada como transporte de longa distância12,13. Estudos anteriores detectaram bisfenol A, nonilfenol e estrogênios naturais em vegetais e frutas14, o que implica que esses produtos químicos podem migrar através do floema. Assim, descobrir a translocação de PFAAs em plantas é importante para avaliar seu risco potencial. No entanto, o acúmulo e a translocação de PFAAs são impactados por sua biodisponibilidade no solo, por isso não é fácil avaliar a capacidade de translocação de PFAAs alvo em plantas. Além disso, os experimentos hidropônicos são geralmente limitados por vários fatores, tornando mais difícil a aquisição dos tecidos comestíveis das plantas. Tipicamente, o floema foi coletado diretamente das plantas para observar a translocação de compostos orgânicos por longas distâncias nas plantas, sendo difícil a aquisição de floemas de plântulas de plantas15. Assim, um método simples e eficaz, a técnica de raiz dividida, foi introduzido para estudar a translocação de PFAAs em plantas durante uma exposição relativamente de curto prazo. Quanto à investigação de raízes divididas, as raízes em uma muda de planta são separadas em duas partes; uma parte é colocada na solução nutritiva contendo PFAAs alvo (tubo A), e a outra é colocada na solução nutritiva na ausência de PFAAs (tubo B). Após exposição por vários dias, os PFAAs no tubo B são medidos por LC-MS/MS. A concentração de PFAAs no tubo B revela o potencial de translocação dos PFAAs através do floema dentro das plantas16,17,18.
O experimento de raiz dividida tem sido relatado para estudar a translocação de longa distância de muitos compostos em plantas, como nanopartículas de CuO17, estrogênios esteroides 18 e ésteres organofosforados16. Esses estudos forneceram evidências de que esses compostos poderiam ser transferidos através do floema para as partes comestíveis das plantas. No entanto, se os PFAAs poderiam ajudar na translocação em plantas e o impacto das propriedades dos compostos precisam ser mais explorados. Com base nesses relatos, o experimento de raiz dividida foi conduzido no presente estudo para revelar o transporte de longa distância de PFAAs em trigo.
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Protocol
Sementes de trigo, Triticum aestivum L., foram adquiridas (ver Tabela de Materiais) e utilizadas para o presente estudo.
1. Germinação de plântulas de trigo e cultura hidropônica
- Selecione sementes de trigo de tamanho semelhante e desinfete-as por 15 min com solução de peróxido de hidrogênio a 8% (p/p).
- Lave bem as sementes desinfetadas com água desionizada e, em seguida, coloque-as em papel de filtro úmido no escuro à temperatura ambiente para germinar por 5 dias.
- Selecionar aproximadamente nove plântulas germinadas de tamanho uniforme e transferi-las para copos plásticos com 250 mL de solução nutritiva (1/4 de força da solução de Hoagland; sua composição química é mostrada na Tabela 1).
NOTA: Das nove sementes, três foram selecionadas para blank, PFOA e PFOS, respectivamente. - Cultivar as plântulas em câmaras de crescimento durante 7 dias antes da exposição com um ciclo de 14 h a 22 °C e 10 h a 27 °C.
2. O experimento de divisão de raiz
- Realizar o cultivo de plântulas em dois tubos centrífugos de 50 mL (A e B).
NOTA: No tubo de centrífuga A, 50 mL de solução de Hoagland de 1/4 de força estéril estavam presentes, e a mesma quantidade de solução nutritiva estava presente no tubo de centrífuga B.- Dissolver o PFOA comercial e o PFOS (ver Tabela de Materiais) em metanol e diluí-los com a solução nutritiva estéril como solução-mãe. Em seguida, adicionar a solução-mãe ao tubo B a uma concentração de PFOA/PFOS de 100 μg/L.
- Realizar os tratamentos em triplicados com um controle em branco para monitorar a contaminação do fundo. Um diagrama esquemático dos experimentos de exposição de raiz dividida é mostrado na Figura 1.
- Separe as raízes inteiras da muda de trigo usando pinças em duas partes iguais para que as raízes ainda estejam presas à mesma parte aérea e insira-as cuidadosamente nos tubos A e B, respectivamente.
- Sele os dois tubos com papel alumínio e cultive-os em uma incubadora por 7 dias. Manter as mesmas condições de incubação indicadas no passo 1.4.
- Coletar as plântulas de trigo após 7 dias de cultura e separar o trigo em três partes: parte aérea e raízes cultivadas na solução cravada de PFAAs e solução sem espinhos, respectivamente, utilizando tesoura esterilizada.
- Liofilizar as amostras da planta em um liofilizador a -55 °C por 48 h.
- Homogeneizar e pesar as amostras de raiz e parte aérea. Recolha as amostras de solução com e sem pontas.
3. Extração de PFOA e PFOS de tecidos vegetais
- Adicionar 2 ml de tampão de carbonato de sódio (0,25 mol/L), 1 ml de sulfato de hidrogénio de tetrabutilamónio (0,5 mol/L) e 5 ml de éter metil-terc-butílico (ver Tabela de Materiais) a um tubo de polipropileno de 15 ml, incluindo a raiz ou parte aérea homogeneizada.
- Agitar o tubo a 250 rpm durante 20 min e centrifugar a 2.000 x g durante 10 min à temperatura ambiente para obter a fase orgânica sobrenadante. Execute o processo de extração duas vezes.
- Misture os extratos coletados, vaporize até a secura em um fluxo suave de nitrogênio (N2) e, em seguida, reconstitua com 5 mL de metanol e vortex-os, mantendo a mesma velocidade por aproximadamente 30 s.
- Condicione o cartucho de pesticarbe (ver Tabela de Materiais) com 5 mL de NH4OH a 0,1% em metanol, 5 mL de água e 5 mL de metanol.
- Adicione os 5 mL de solução de metanol de extração através do cartucho de pesticarbe (500 mg/6 mL) para remover o pigmento, elua o cartucho com 5 mL de metanol e colete nos mesmos tubos.
- Evaporar os 10 mL de solução de metanol coletados até quase secar e reconstituir com 200 μL de metanol, seguido de vórtice e centrifugação a 10.000 x g por 20 min à temperatura ambiente.
4. Preparação da amostra a partir da solução nutritiva
- Condição com 5 mL de metanol e 5 mL de água para ativar o cartucho de extração de polímero polar aprimorado (PEP) (60 mg/g, 3 mL) (ver Tabela de Materiais).
- Adicionar 1 ml da solução cravada ou 50 ml das amostras de solução não cravada (passo 2.6) através do cartucho, respetivamente.
- Eluir os PFAAs alvo com 10 mL de metanol, evaporar o extrato com N2 suave e, em seguida, reconstituir com 200 μL de metanol para análise.
5. Análise instrumental
- Use uma cromatografia líquida ultra-eficiente UPLC juntamente com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) para quantificação dos PFAAs alvo em modo multi-reação (MRM) e ionização por eletrospray negativo (ESI-) (ver Tabela de Materiais).
- Injetar 10 μL de amostras e separar os PFAAs alvo usando uma coluna cromatográfica líquida C18 (1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, ver Tabela de Materiais) e usar acetato de amônio 2 mM em água (fase A) e metanol (fase B) como fase móvel para UPLC, com uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min. Manter a temperatura da coluna a 50 °C.
NOTA: As transições de íons de PFOA e PFOS são 413 a 369 e 499 a 80, respectivamente. O programa de eluição de gradiente e os parâmetros instrumentais LC-MS/MS para quantificação dos PFAAs alvo estão listados na Tabela 2. - Processe os dados com o software de análise de dados (consulte Tabela de Materiais).
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Representative Results
O experimento de raiz dividida investigou o transporte de longa distância de PFAAs em trigo. Como mostrado na Figura 2A,C, tanto o PFOA quanto o PFOS poderiam ser absorvidos pela raiz do trigo e transferidos para a parte aérea. PFOS e PFOA não foram detectados na raiz de trigo e solução no tubo A do controle em branco. Verificou-se que PFOS e PFOA foram detectados nas raízes de trigo cultivadas na solução não cravada, com concentração de 0,26 ng/g ± 0,02 ng/g e 0,64 ng/g ± massa seca (dw) de 0,05 ng/g (n = 3), respectivamente, que representam 1,5% e 1,8% da quantidade de acúmulo na planta de trigo integral. Este resultado sugere que o PFOS e o PFOA poderiam experimentar o transporte de longa distância através do floema da parte aérea até a raiz. Vale ressaltar que PFOS e PFOA também foram encontrados na solução nutritiva não cravada com concentração de 17,8 ng/L ± 0,28 ng/L e 28,5 ng/L ± 5,9 ng/L (n = 3), respectivamente, o que sugere que PFOA e PFOS poderiam passar pela tira caspariana radicular19,20 e ser liberados no ambiente ambiente. Os resultados do presente trabalho fornecem evidências sólidas de que o transporte de longa distância também é um caminho importante para o trigo eliminar os PFAAs.
Figura 1: Diagrama esquemático dos experimentos de raiz dividida. As raízes inteiras da plântula de trigo foram igualmente separadas em duas partes e cuidadosamente inseridas em tubos (A) e (B). Um retentor de raiz de plástico hidropônico com uma esponja correspondente foi usado para conectar os dois tubos e fixar a muda. O grupo em branco é definido como a solução em A; Os tubos B são todos sem espinhos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Distribuição das concentrações de PFOA e PFOS no experimento de raiz dividida após 7 dias de exposição. A solução cravada (solução contendo PFAAs alvo), raiz cravada (raiz na solução cravada por PFAAs) e parte aérea de (A) PFOA e (C) PFOS. Solução não cravada (solução sem PFAAs) e raiz não cravada (raiz em solução sem espinho) de (B) PFOA (D) e PFOS. As barras de erro denotam os desvios padrão (n = 3). Abreviatura: dw = peso seco. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componente | Peso molecular | Conc. da solução-mãe (g/L) | Volume de solução-mãe por litro de solução final (ml) | Elemento | Conc. final do elemento em solução nutritiva (ppm) |
| Macronutrientes | |||||
| KNO3 | 101.1 | 101.1 | 1.25 | K | 56 |
| Ca(NO3)2. 4H2O | 236.16 | 236.16 | 1 | N | 58.75 |
| NH4H2PO4 | 115.08 | 115.08 | 0.5 | Ca | 40 |
| MgSO4. 7H2O | 246.48 | 246.48 | 0.25 | P | 15.5 |
| Mg | 6 | ||||
| S | 8 | ||||
| Ferro (EDTA-FeNa) | |||||
| EDTA-FeNa | 367.05 | 7.342 | 0.25 | Fe | 0.28 |
| Micronutrientes | |||||
| H 3BO3 | 61.83 | 2.86 | B | 0.125 | |
| MnCl2. 4H2O | 197.91 | 1.81 | Mn | 0.125 | |
| ZnSO4. 7H2O | 287.56 | 0.22 | Zn | 0.0125 | |
| CuSO4 | 159.61 | 0.051 | 0.005 | ||
| H2MoO4 (85% MoO3) | 161.97 | 0.017 | Mo | 0.0025 |
Tabela 1: Composições químicas da solução nutritiva de Hoagland de 1/4 de força. Esta solução nutritiva representa a solução sem espinhos no experimento de raiz dividida.
| Temperatura da coluna | 50 °C | |||||
| Fase móvel | Acetato de amónio 2 mM em pH da água = 9 (A) e metanol (B) | |||||
| Gradiente | Tempo (min) | Vazão (mL/min) | A (%) | B (%) | ||
| Inicial | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 0.5 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 5 | 0.3 | 15 | 85 | |||
| 5.1 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7 | 0.3 | 0 | 100 | |||
| 7.1 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| 9 | 0.3 | 75 | 25 | |||
| Parâmetros de massa | Tensão capilar: -1,5 kV | |||||
| Temperatura de desolvação 500 °C | ||||||
| Fluxo de gás de desolvação: 1000 L/h | ||||||
| Fluxo de gás do cone: 150 L/h | ||||||
| Múltiplo | Compostos | Íons pais | Íons do produto (m/z) | |||
| reação | (m/z) | |||||
| monitorização | ||||||
| (MRM) | PFOA | 413 | 369 | |||
| Transições | PFOS | 499 | 80 | |||
Tabela 2: Parâmetros instrumentais LC-MS/MS para quantificação dos PFAAs alvo.
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Discussion
Para garantir a precisão deste método, deve ser feita uma operação cuidadosa para garantir que a solução cravada no tubo B não contamine a solução sem espinhos no tubo A. A concentração dada de PFAAs alvo no presente estudo foi relativamente maior do que sua concentração no ambiente real, garantindo o monitoramento de PFAAs alvo em trigo e solução não cravada usando LC-MS/MS.
Existem limitações para este método. Como apenas uma plântula de trigo foi utilizada em cada grupo de tratamento e a raiz foi dividida ao meio, se a concentração inicial da solução cravada for relativamente baixa, a menor biomassa obtida do tratamento final pode resultar na concentração de PFAAs nas raízes cultivadas na solução não cravada abaixo do limite da detecção. Além disso, devido ao curto tempo de exposição, o transporte de PFAA das raízes para as partes comestíveis do trigo não pôde ser determinado. O experimento de raiz dividida só pôde analisar o transporte de floemas de PFAAs com diferentes propriedades dentro das plantas16.
Este método é de grande importância para a compreensão do transporte de longa distância12,13 de poluentes em tecidos vegetais. De acordo com os resultados, os PFAAs podem ser absorvidos pelas raízes e transportados para os brotos principalmente através do xilema; no entanto, deve-se notar que eles podem ser translocados das folhas para os tecidos comestíveis, bem como da parte aérea para as raízes através do floema, o que é importante para a avaliação de seu risco potencial de translocação nas plantas. Além disso, a translocação de PFAAs dos tecidos acima do solo para as raízes e, em seguida, a liberação no ambiente fornece evidências sólidas para as vias de eliminação de PFAAs em plantas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos o apoio financeiro da Fundação de Ciências Naturais da China (NSFC 21737003), do Fundo Científico das Universidades Chinesas (Nº 2452021103) e da Fundação Chinesa de Ciência de Pós-Doutorado (Nº 2021M692651, 2021M702680).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACQUITY UPLC BEH C18 column | Waters, Milford, MA | Liquid chromatographic column | |
| Cleanert PEP cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| Clearnert Pesticarb cartridge | Bonna- Angel Technologies, China | Solid phase extraction column | |
| LC-MS/MS(Waters Acquity UPLC i-Class Coupled to Xevo TQ-S) | Waters, Milford, MA | Liquid chromatography and mass spectrometry | |
| Lyophilizer | Boyikang Instrument Ltd., Beijing, China | FD-1A50 | Freeze-dried sample |
| Masslynx | Waters, Milford, MA | data analysis software | |
| Methyl tert-butyl ether | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| MPFAC-MXA | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXA0518 | the internal standards |
| PFAC-MXB | Wellington Laboratories (Ontario, Canada) | PFACMXB0219 | mixture of PFAA calibration standards |
| PFOA | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 335-67-1 | a represent PFAAs |
| PFOS | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | 2795-39-3 | a represent PFAAs |
| Sodium carbonate buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Tetrabutylammonium hydrogen sulfate | Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, US) | use for extracting target compounds from plant tissues | |
| Wheat seeds | Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing,China) | Triticum aestivum L. |
References
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