Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering af en patogen Escherichia coli-stamme afledt af Oreochromis spp. Gårde ved hjælp af helgenomsekventering

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

Gennemførligheden af helgenomsekventering (WGS) strategier ved hjælp af benchtop-instrumenter har forenklet genomforhøret af hver mikrobe af folkesundhedsrelevans i en laboratorieindstilling. En metodologisk tilpasning af arbejdsgangen for bakteriel WGS er beskrevet, og en bioinformatikrørledning til analyse præsenteres også.

Abstract

Akvakultur er en af de hurtigst voksende fødevareproducerende sektorer på verdensplan, og dyrkning af tilapia (Oreochromis spp.) er den største dyrkede ferskvandsfiskesort. Da akvakulturpraksis er modtagelig for mikrobiel kontaminering fra menneskeskabte kilder, er der behov for omfattende antibiotikabrug, hvilket fører til, at akvakultursystemer bliver en vigtig kilde til antibiotikaresistente og patogene bakterier af klinisk relevans såsom Escherichia coli (E. coli). Her blev den antimikrobielle resistens, virulens og mobilomegenskaber ved en patogen E. coli-stamme , genvundet fra indlandsopdrættet Oreochromis spp., belyst gennem helgenomsekventering (WGS) og i silicoanalyse . Antimikrobiel følsomhedstest (ASAT) og WGS blev udført. Desuden blev fylogenetisk gruppe, serotype, multilocussekvenstypning (MLST), erhvervet antimikrobiel resistens, virulens, plasmid og prophageindhold bestemt ved hjælp af forskellige tilgængelige webværktøjer. E. coli-isolatet udviste kun mellemliggende modtagelighed for ampicillin og blev karakteriseret som ONT: H21-B1-ST40-stamme ved WGS-baseret typning. Selv om der kun blev påvist et enkelt antimikrobielt resistensrelateret gen [mdf(A)], blev der identificeret flere virulensassocierede gener (VAG'er) fra den atypiske enteropatogene E. coli (aEPEC) patotype. Derudover blev lasten af plasmid replicons fra store plasmidgrupper og 18 prophage-associerede regioner detekteret. Afslutningsvis giver WGS-karakteriseringen af et aEPEC-isolat, der er genvundet fra et dambrug i Sinaloa, Mexico, indsigt i dets patogene potentiale og den mulige sundhedsrisiko for mennesker ved indtagelse af rå akvakulturprodukter. Det er nødvendigt at udnytte næste generations sekventeringsteknikker (NGS) til undersøgelse af miljømikroorganismer og at vedtage en sundhedsramme for at lære, hvordan sundhedsspørgsmål opstår.

Introduction

Akvakultur er en af de hurtigst voksende fødevareproducerende sektorer på verdensplan, og dens produktionspraksis har til formål at tilfredsstille den stigende efterspørgsel efter fødevarer til konsum. Den globale akvakulturproduktion er tredoblet fra 34 mio. tons (Mt) i 1997 til 112 mio. tons i 20171. De vigtigste artsgrupper, der bidrog til næsten 75% af produktionen, var tang, karper, muslinger, havkat og tilapia (Oreochromis spp.) 1. Forekomsten af sygdomme forårsaget af mikrobielle enheder er imidlertid uundgåelig på grund af intensivt fiskeopdræt, hvilket fører til potentielle økonomiske tab2.

Brug af antibiotika i fiskeopdrætspraksis er velkendt for forebyggelse og behandling af bakterielle infektioner, den vigtigste begrænsende faktor i produktiviteten 3,4. Ikke desto mindre akkumuleres resterende antibiotika i akvakultursedimenter og vand, udøver selektivt tryk og ændrer de fiskeassocierede og de bosiddende bakteriesamfund 5,6,7,8. Derfor fungerer akvakulturmiljøet som et reservoir for antimikrobielle resistensgener (ARG'er) og den yderligere fremkomst og spredning af antibiotikaresistente bakterier (ARB) i det omgivende miljø9. Ud over de bakterielle patogener, der almindeligvis observeres, påvirker fiskeopdrætspraksis, forekommer der ofte medlemmer af Enterobacteriaceae-familien, herunder humane patogenstammer af Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. og Salmonella spp.10. E. coli er den mest almindelige mikroorganisme isoleret fra fiskemel og vand i fiskeopdræt 11,12,13,14,15.

E. coli er en alsidig gramnegativ bakterie, der befinder sig i mave-tarmkanalen hos pattedyr og fugle som et kommensalt medlem af deres tarmmikrobiota. E. coli har imidlertid en meget adaptiv kapacitet til at kolonisere og fortsætte i forskellige miljømæssige nicher, herunder jord, sedimenter, mad og vand16. På grund af gengevinsten og -tabet gennem fænomenet horisontal genoverførsel (HGT) har E. coli hurtigt udviklet sig til et veltilpasset antibiotikaresistent patogen, der er i stand til at forårsage et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker og dyr17,18. Baseret på isolationsoprindelsen defineres patogene varianter som intestinal patogen E. coli (InPEC) eller ekstra-intestinal patogen E. coli (ExPEC). Desuden er InPEC og ExPEC underklassificeret i veldefinerede patotyper i henhold til sygdomsmanifestation, genetisk baggrund, fænotypiske træk og virulensfaktorer (VF'er)16,17,19.

Traditionel kultur og molekylære teknikker til patogene E. coli-stammer har muliggjort hurtig påvisning og identifikation af forskellige patotyper. De kan dog være tidskrævende, besværlige og kræver ofte høj teknisk uddannelse19. Desuden kan ingen enkelt metode bruges til pålideligt at studere alle patogene varianter af E. coli på grund af kompleksiteten af deres genetiske baggrund. I øjeblikket er disse ulemper blevet overvundet med fremkomsten af teknologier til high-throughput sekventering (HTS). Helgenomsekventering (WGS) tilgange og bioinformatiske værktøjer har forbedret udforskningen af mikrobielt DNA overkommeligt og i stor skala, hvilket letter den dybtgående karakterisering af mikrober i en enkelt kørsel, herunder nært beslægtede patogene varianter20,21,22. Afhængigt af de biologiske spørgsmål kan flere bioinformatikværktøjer, algoritmer og databaser bruges til at udføre dataanalyse. For eksempel, hvis hovedmålet er at vurdere tilstedeværelsen af ARG'er, VF'er og plasmider, kan værktøjer som ResFinder, VirulenceFinder og PlasmidFinder sammen med deres tilknyttede databaser være et godt udgangspunkt. Carriço et al.22 gav et detaljeret overblik over de forskellige bioinformatiksoftware og relaterede databaser, der blev anvendt til mikrobiel WGS-analyse, fra forbehandling af rådata til fylogenetisk slutning.

Flere undersøgelser har vist WGS's brede anvendelighed til genomforhør vedrørende antimikrobielle resistensegenskaber, patogent potentiale og sporing af fremkomsten og de evolutionære forhold mellem klinisk relevante varianter af E. coli hentet fra forskellige oprindelser23,24,25,26 . WGS har gjort det muligt at identificere molekylære mekanismer, der ligger til grund for den fænotypiske resistens over for antimikrobielle stoffer, herunder de sjældne eller komplekse resistensmekanismer. Dette er ved at detektere erhvervede ARG-varianter, nye mutationer i lægemiddelmålsgener eller promotorregioner27,28. Desuden tilbyder WGS potentialet til at udlede antimikrobielle resistensprofiler uden at kræve forudgående viden om resistensfænotypen for en bakteriestamme29. Alternativt har WGS tilladt karakterisering af de mobile genetiske elementer (MGE'er), der bærer både antimikrobiel resistens og virulensegenskaber, hvilket har drevet bakteriegenomudviklingen af eksisterende patogener. For eksempel resulterede anvendelsen af WGS under undersøgelsen af det tyske E. coli-udbrud i 2011 i at afdække de unikke genomiske træk ved en tilsyneladende ny E. coli-patotype; interessant nok stammede disse udbrudsstammer fra den enteroaggale E. coli (EAEC) gruppe, som erhvervede prophage, der koder for Shiga-toksinet fra den enterohemorragiske E. coli (EHEC) patotype30.

Dette arbejde præsenterer en metodologisk tilpasning af arbejdsgangen for bakteriel WGS ved hjælp af en benchtop sequencer. Desuden leveres en bioinformatikrørledning ved hjælp af webbaserede værktøjer til at analysere de resulterende sekvenser og yderligere støtte forskere med begrænset eller ingen bioinformatikekspertise. De beskrevne metoder tillod belysning af antimikrobiel resistens, virulens og mobilomegenskaber ved en patogen E. coli-stamme ACM5, isoleret i 2011 fra indlandsopdrættet Oreochromis spp. i Sinaloa, Mexico12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: E. coli-stammen ACM5 blev genvundet ved forarbejdning og dyrkning af fiskeprøven til bestemmelse af fækal coliform (FC)12. Under prøveudtagningen af fisk viste fisk ikke kliniske tegn på sygdom, bakteriel eller svampeinfektion, og der herskede en gennemsnitstemperatur på 22,3 °C. Efter isolering blev E. coli-isolatet udsat for biokemisk test og kryopræservering i hjernehjerteinfusion (BHI) bouillon med DMSO (8% v / v) som kryoprotektivt middel.

1. Reaktivering af frossen E. coli ACM5 stamkultur

  1. Fra den frosne bakteriestamme skal du åbne røret og bruge en steril løkke, pipettespids eller tandstikker til at skrabe overfladen af den frosne bakteriekultur.
  2. Stribe bakterierne på en Luria-Bertani (LB) agarplade og inkuberes ved 37 ± 2 °C i 24 timer.

2. Bestemmelse af antibakteriel modtagelighed

BEMÆRK: Den antimikrobielle følsomhedstest, der er beskrevet her, svarer til diskdiffusionsmetoden baseret på retningslinjerne fra Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922 stamme er påkrævet til kvalitetskontrolformål.

  1. Inokulumpræparation ved kolonisuspensionsmetode
    1. Fra LB-pladen, der inkuberes i trin 1.2, stryges en eller to kolonier på en Mueller-Hinton (MH) agarplade og inkuberes ved 37 ± 2 °C i 18-24 timer.
    2. Brug en steril løkke til at vælge to eller tre kolonier fra det friskt subkulturerede E. coli-isolat på MH-agarpladen og suspenderer dem i 3 ml steril MH bouillon eller 0,85% (w / v) saltopløsning, blandes grundigt ved hvirvlning for at opnå en ensartet bakteriel suspension.
    3. Ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer (se Materialetabel) justeres bakteriesuspensionen til turbiditet, der kan sammenlignes med en 0,5 MacFarland-standard (svarende til ca. 1-2 x 108 celler / ml). Hvis bakteriesuspensionen er for let eller for tung, tilsættes flere E. coli-kolonier eller MH-bouillon efter behov. Brug det tilberedte podepunkt inden for 15 minutter efter tilberedningen.
  2. Podning af prøvepladerne
    1. Dyp en steril vatpind i den justerede bakteriesuspension. Drej vatpinden flere gange, og tryk den fast på rørets indvendige væg for at fjerne overskydende væske fra vatpinden.
    2. Pod en MH agarplade ved at stribe vatpinden 3x over hele agaroverfladen, og drej pladen 60° hver gang. Svøm også agarens rand for at sikre en jævn fordeling af podet.
    3. Lad petriskålens låg stå på klem i 3-5 minutter for at lade fugt fordampe.
  3. Påføring af den antimikrobielle disk på podede agarplader
    1. Fordel jævnt, og tryk hver antimikrobiel disk (se Materialetabel) ned på overfladen af de podede agarplader for at sikre fuldstændig kontakt. Vend pladerne inden for 15 minutter efter diskpåføring, og inkuberes ved 35 ± 2 °C i 16-18 timer.
      BEMÆRK: Der må maksimalt anvendes 12 og seks skiver i petriskåle på henholdsvis 150 mm og 100 mm.
  4. Efter inkubation måles inhiberingszonen ved hjælp af en Vernier-tykkelse, og de resulterende diametre fortolkes i henhold til CLSI-breakpointkriterierne (M100 - tabel 2A)32.

3. Genomisk DNA (gDNA) ekstraktion og kvantificering

  1. Genomisk DNA-ekstraktion
    1. Resuspender en loopfuld frisk dyrkede E. coli-kolonier i 5 ml LB bouillon og inkuberes natten over i en rystende inkubator (180 o / min) ved 37 ± 2 ° C.
    2. Bakteriesuspensionen centrifugeres ved 3.500 x g i 5 minutter, og supernatanten kasseres forsigtigt.
    3. Uddrag gDNA efter retningslinjerne for DNA-ekstraktionssæt (se Materialetabel).
    4. Kontroller renheden af gDNA ved at måle optisk densitet ved 260/280 nm (forhold: >1,8) og 260/230 nm (forhold: 2,0-2,2) ved hjælp af et UV-synligt spektrofotometer. Udfør 0,8% agarosegelelektroforese for at verificere gDNA-integriteten.
  2. Genomisk DNA-kvantificering
    BEMÆRK: Brug kun tyndvæggede, klare, 0,5 ml PCR-rør, der er godkendt af fluorescensassaysætproducenten (se Materialetabel).
    1. Opsæt det krævede antal rør til prøver og analysestandarder. Forbered arbejdsanalyseopløsningen ved at blande komponent A og komponent B, der leveres i sættet, i overensstemmelse med producentens retningslinjer.
    2. Forbered analysestandarderne ved at tilføje 190 μL af arbejdsløsningen og 10 μL af hver standard til det relevante rør (to standarder er påkrævet).
    3. Der tilsættes 198 μL af arbejdsløsningen og 2 μL af DNA-prøven til det relevante rør. Bland kraftigt ved at hvirvle alle rørene i 5 s. Pas på ikke at skabe bobler.
    4. Inkuber alle rør i 2 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Mål fluorescensen af alle rør baseret på producentens retningslinjer ved hjælp af fluorometeret (se Materialetabel).
    5. Juster gDNA-prøvekoncentrationen korrekt til sekventeringsprocedure.

4. Forberedelse af DNA-bibliotek

BEMÆRK: DNA-biblioteksforberedelse og -sekventering blev udført efter producentens retningslinjer og protokoller (se Materialetabel). Den startende gDNA-koncentration er 4,0 ng.

  1. Tagmentation, PCR-forstærkning og indeksering
    1. I et 0,2 ml rør tilsættes 2,5 μL mærkningsbuffer og 2 μL input gDNA (2,0 ng/μL). Bland forsigtigt ved pipettering.
    2. Tilsæt 1 μL forstærkningsbuffer og bland forsigtigt ved pipettering. Drej ned ved 280 x g i 1 min ved stuetemperatur.
    3. Anbring prøverne i en termocykler (se Materialetabel) og kør følgende PCR-program: 55 °C i 5 min., og hold derefter ved 10 °C. Når prøverne når 10 °C, fortsættes straks med at neutralisere reaktionen.
    4. Der tilsættes 1 μL neutraliserende buffer til prøverørene og blandes forsigtigt ved pipettering. Drej ned ved 280 x g i 1 min og inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    5. Tilføj 1,7 μL af hver indeksadapter (dvs. indeks i7 og i5) og 3 μL indeksering af PCR-mastermix. Bland forsigtigt ved pipettering. Drej ned ved 280 x g i 1 min ved stuetemperatur.
    6. Prøverne anbringes i termocyklisten, og der udføres en anden PCR-reaktion som følger: 72 °C i 3 min., 95 °C i 30 s, 18 cyklusser på 95 °C i 10 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 30 s, 72 °C i 5 min., og hold dem ved 10 °C.
  2. Forstærket biblioteksoprydning
    1. Bland ved at sprøjte den kommercielle magnetiske perleopløsning (se Materialetabel) baseret på producentens retningslinjer.
    2. Overfør den tagnede/indekserede gDNA-prøve til et nyt 1,5 ml rør, og tilsæt 0,6 μL magnetiske perler for hver μL af det endelige volumen af gDNA-prøven (≈13 μL). Bland forsigtigt ved pipettering og inkuber i 5 min ved stuetemperatur.
    3. Prøverørene anbringes på et magnetstativ (se Materialetabel) i 2 minutter, indtil supernatanten er ryddet. Fjern og kassér supernatanten forsigtigt uden at forstyrre perlerne.
    4. Tilsæt 200 μL frisklavet 80% ethanol uden blanding. Inkuberes i 30 s, indtil eluatet rydder, og fjern forsigtigt og kassér supernatanten uden at forstyrre perlerne.
    5. Udfør et andet vasketrin. Tilsæt 200 μL 80% ethanol til perlerne og inkuber i 30 s. Når eluatet er ryddet, fjernes og kasseres supernatanten og lufttørrer perlerne i 10 min.
    6. Tilsæt 15 μL 10 mM trisbuffer (pH 8) til perlerne og bland forsigtigt ved pipettering. Inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur. Placer prøverørene igen på magnetstativet i 2 minutter, så supernatanten kan rydde.
    7. Overfør forsigtigt 14 μL supernatant fra prøverøret til et nyt 0,2 ml rør. Dette er det ryddede bibliotek.
      BEMÆRK: På dette tidspunkt kan det rensede bibliotek opbevares ved -20 °C i op til 7 dage.
  3. Normalisering af bibliotek
    1. Fortsæt med at kvantificere de rensede biblioteker ved hjælp af fluorescensanalyse som beskrevet i trin 3.2, bortset fra trin 3.2.5.
    2. Visualiser de rensede biblioteker på en 1% agarosegelelektroforese for at bestemme de gennemsnitlige fragmentstørrelser.
    3. Beregn bibliotekets molaritetsværdi ved hjælp af følgende ligning:
      Equation 1
    4. Ved hjælp af molaritetsværdien beregnes de korrekte mængder resuspensionsbuffer (RSB) og rensede biblioteker for at fortynde det enkelte bibliotek ved en startkoncentration på 10 nM.

5. Bibliotekspooling, denaturalisering og sequencer-initiering

  1. Optø reagenspatronen efter producentens anvisninger. Flowcellen ekstraheres fra køleskabet (4 °C), og den bringes op til stuetemperatur inden sekventering.
  2. Pool 5 μL af hvert normaliseret bibliotek (10 nM) i et lavbundet 1,5 ml rør. Fortynd det samlede bibliotek ved 4 nM med det korrekte volumen af RSB.
  3. Tilføj 5 μL af det samlede bibliotek (4 nM) og 5 μL af 0,2 N NaOH i et nyt lavbundet 1,5 ml rør. Bland kort ved hvirvelstrøm, drej ned ved 280 x g i 1 min, og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at denaturere det samlede bibliotek i enkeltstrenge.
  4. Bland forsigtigt 10 μL denatureret poolbibliotek og 990 μL prechilled hybridiseringsbuffer ved pipettering og læg dem på is, indtil den endelige fortynding til sequencerbelastning er udført. Koncentrationen af det denaturerede puljebibliotek er 20 pM.
  5. Optø og forbered et kontrolbibliotek (se Materialetabel) i en koncentration på 4 nM ved at blande 2 μL kontrolbibliotek (10 nM) og 3 μL nukleasefrit vand.
  6. Bland 5 μL af kontrolbiblioteket (4 nM) og 5 μL frisklavet 0,2 N NaOH. Bland kort ved hvirvelstrøm, drej ned ved 280 x g i 1 min, og inkuber i 5 minutter ved stuetemperatur for at denaturere kontrolbiblioteket til enkeltstrenge.
  7. Bland forsigtigt 10 μL denatureret kontrolbibliotek og 990 μL prechilled hybridiseringsbuffer ved pipettering og læg dem på is, indtil den endelige fortynding til sequencerbelastning er færdig. Koncentrationen af det denaturerede kontrolbibliotek er 20 pM.
  8. I et nyt lavbundet 1,5 ml rør kombineres 594 μL af det denaturerede poolbibliotek ved 20 pM og 6 μL af det denaturerede kontrolbibliotek ved 20 pM. Bland ordentligt.
  9. Den endelige biblioteksblanding (20 pM) fortyndes til en endelig belastningskoncentration på 1,2 pM i et volumen på 600 μL ved hjælp af den forkølede hybridiseringsbuffer.
  10. Før du lægger den endelige biblioteksblanding på reagenspatronen, skal du udføre en ekstra termisk forbehandling for at opnå effektiv indlæsning i flowcellen. Inkuber den endelige biblioteksblanding i 2 minutter ved 96 °C. Vend røret for at blande, og læg røret på is i 5 min.
  11. Læg 500 μL af den endelige biblioteksblanding i det designede reservoir på reagenspatronen. Start sekventering efter retningslinjerne. Ilæg flowcellen og reagenspatronen, og opsæt sekventeringskørslen.

6. Sekvensdataanalyse

BEMÆRK: Tjek supplerende fil 1 for yderligere beskrivelse af den generelle WGS-dataforbehandling, software, parameterindstillinger og sekvensanalyse af E. coli-genomet.

  1. Opret forbindelse til sekventeringsdataserveren, og download FASTQ-filerne.
  2. Evaluer den indledende kvalitet af rå sekvensdata med tredjepartssoftware. Fjern resterende adaptersekvenser, baser af lav kvalitet (supplerende fil 1).
  3. Saml de kvalitetskontrollerede sekventeringsdata på contig- eller stilladsniveau ved hjælp af tredjepartssoftware (se supplerende fil 1).
  4. Udfør genomannotering ved at indsende FASTA-filen, der indeholder det samlede genom, til RAST-serveren (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Upload FASTA-filen til webplatformene Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) og ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) for at identificere epidemiologiske træk, ARG'er, VAG'er og plasmider (se supplerende fil 1).
  6. Upload FASTA-filen til PHASTER-serveren for at identificere prophagesekvenser (https://phaster.ca/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den antimikrobielle modtagelighed blev bestemt ved diskdiffusionsmetoden og fortolket af CLSI-breakpointkriterier for 12 antibiotika, der spænder over seks forskellige antimikrobielle klasser, det vil sige aminoglycosider, β-lactamer, fluorquinoloner, nitrofuraner, phenicols og folatvejantagonister. E. coli ACM5 udviste følsomhed over for alle antibiotika undtagen et β-lactamlægemiddel. Fire β-lactam lægemidler blev testet: ampicillin, carbenicillin, cephalothin og cefotaxim. Blandt disse blev der målt en 14 mm hæmningsglorie til ampicillin. I henhold til CLSI-fortolkningskategorierne for ampicillin (modtagelig: ≥17 mm; mellemliggende: 14-16 mm; resistent: ≤13 mm) 32 viser E. coli ACM5 derfor en mellemliggende modtagelighed for ampicillin.

E. coli ACM5 blev udsat for WGS ved hjælp af benchtop sequencer. Derfor blev DNA-prøven forberedt, multiplekset og sekventeret efter den beskrevne protokol. Samlet set gav sekventeringskørslen med mid-output-konfiguration 3,37 Gb data med en fejlrate på 0,73%, og 89,71% af baserne scorede en kvalitet over Q3033. Især sekventeringen af E. coli ACM5 genererede i alt 1.490.594 parrede endelæsninger (PE). De rå sekvensdata fra denne undersøgelse blev deponeret i sequence read archive (SRA) databasen på det nationale center for bioteknologisk information (NCBI) under BioProject-nummer PRJNA715781.

Efter den indledende kvalitetskontrol og filtrering blev 96,8% af læsningerne bevaret fra rå sekventeringsdata og samlet i stilladser med en dækningsdybde på 38x. Genomsamlingen på stilladsniveau genererede 83 stilladser (>300 bp), 5.272.433 bp i længden og med 50.61% GC-indhold. Genomannotering afslørede 5.633 kodede funktioner, hvoraf 5.524 er proteinkodende gener (CDS'er) og 109 er RNA-relaterede sekvenser (figur 1). Derudover grupperede genomannotering CDS'er i samlinger af funktionelt relaterede proteiner kaldet delsystemer, især dem, der spiller funktionelle roller i kulhydrater, proteiner, aminosyrer og afledte metabolismer og membrantransport (figur 2).

In silico typing forudsagde E. coli ACM5 som en O-nontypeable (ONT) stamme tildelt ONT: H21 serotypen. Derudover viste det, at det tilhører fylogruppen B1 og sekvenstypen (ST) 40. En enkelt erhvervet antimikrobiel resistensdeterminant, der koder for en multidrug effluxpumpe med bredspektret, blev identificeret, det vil sige mdf (A) genet (figur 1).

Med hensyn til virulensegenskaber optrådte flere VAG'er i E. coli-genomet under undersøgelse, herunder gener, der koder for et varmestabilt enterotoxin (astA), et serumresistensprotein (iss) og type III-sekretionssystemet (T3SS) sammen med dets udskillede effektorproteiner (figur 1). Den bundtdannende pili (BFP) operon og perABC-genklyngen blev ikke bevist. Ifølge den forudsagte virulensprofil blev E. coli ACM5 derfor tildelt aEPEC-patotypen.

WGS-analyse afslørede også to formodede store plasmider, der tilhører forskellige inkompatibilitetsgrupper (Inc) i E. coli-genomet (dvs. IncF- og IncI-plasmidgrupperne). Begge manglede dog ARG'er og VAG'er. Desuden blev der identificeret 18 prophage-associerede regioner; I modsætning til plasmider har disse imidlertid VAG'er, herunder iss-genet, sitABCD-operonen, der koder for en jern/ mangantransportør, og et par T3SS-effektorproteiner (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Cirkulært kort over udkastet til genom af E. coli ACM5. Data fra den yderste til den inderste cirkel er erklæret og farvet som følger. Cirkel 1: Genom størrelse skala i basepar. Cirkel 2 og 3: Kommenterede CDS'er transskriberet på henholdsvis den forreste (blå) og den omvendte (røde) DNA-streng. Cirkel 4 og 5: Ribosomale RNA'er (sorte) og overførsels-RNA'er (grønne). Cirkel 6: 83 stilladser af udkastet til genom (grå). Cirkel 7: Kommenterede træk: antimikrobielle resistensdeterminanter (rød), virulensassocierede gener (lilla) og prophageregioner (aqua). Cirkel 8: %GC-indhold (sort). Kreds 9: GC skæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Delsystemfordeling af aEPEC-stamme ACM5. Analysen er baseret på RAST SEED-anmærkning. Cirkeldiagrammet organiserer delsystemerne efter cellulær proces, og de proteinkodende gener, der er involveret i den respektive cellulære proces, er angivet i parentes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende sag 1. Beskrivelse af WGS-dataforbehandling, software, parameterindstillinger og sekvensanalyse af E. coli ACM5-genomet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne undersøgelse præsenterer en tilpasning af den bakterielle WGS-arbejdsgang ved hjælp af en benchtop sequencer og en pipeline til genomisk karakterisering af en patogen E. coli-variant. Afhængigt af den anvendte sekventeringsplatform kan behandlingstiderne (TAC'er) for våde laboratorieprocedurer (bakteriedyrkning, gDNA-ekstraktion, biblioteksforberedelse og sekventering) og sekvensanalyse variere, især hvis langsomt voksende bakterier studeres. Efter protokollen for WGS beskrevet ovenfor var TAT inden for 4 dage, hvilket kan sammenlignes med, hvad litteraturen i øjeblikket siger (<5 dage) 34.

Den teoretiske dybde af dækningen for genomsekventering af E. coli ACM5 blev beregnet til 30x. Ikke desto mindre genererede sekventeringen empiriske data for genomsamlingen i 38x dybde. Som tidligere anbefalet35 var dette tilstrækkeligt til at få en hel genomrepræsentation og følge downstream-dataanalyse vedrørende den antimikrobielle resistens, virulens og mobilomegenskaber ved E. coli ACM5. Med hensyn til antimikrobiel resistens blev kun de erhvervede determinanter undersøgt. E. coli ACM5 er et ampicillinresistent isolat, men kun MdfA multidrug efflux pumpekodende gen blev observeret. Dette giver imidlertid ikke resistens over for β-lactamer36, og der blev ikke identificeret andre erhvervede determinanter involveret i β-lactamresistens. Derfor er det sandsynligt, at en kombination af andre molekylære mekanismer, såsom nedsat cellemembranpermeabilitet og øget ekspression af forskellige udstrømningspumpesystemer, ligger til grund for den observerede ampicillinresistens37.

Med hensyn til virulensegenskaber er den eneste tilstedeværelse af det intiminkodende gen (eae) kendetegnende genetisk markør for aEPEC-stammer. aEPEC-patotypen er en delmængde af tarmpatogen E. coli-stamme, der bærer stedet for enterocytudeffacement (LEE) patogenicitetsø, hvor en T3SS og tilhørende effektor/ translokatorproteiner er kodet, herunder Cif, EspA / B / d, EspF, intimin og den translokerede intiminreceptor (Tir). Samspillet mellem T3SS og dets effektorer er direkte involveret i evnen til at fremme de vedhæftende og udslettende (A / E) læsioner på tarmepitelceller ved typiske enteropatogene E. coli (EPEC) og EHEC, begge patotyper kendt som humane fødevarebårne sygdomsfremkaldende midler17,19. AstA-genet koder for et varmebestandigt enterotoksin ved navn EAST1, og selvom det først blev anerkendt og forbundet med EAEC-stammer, er EAST1-toksinet bredt fordelt blandt E. coli-patotyper38. Her viste WGS, at E. coli ACM5 besidder astA-genet, og på trods af at EAST1-producerende E. coli-isolater har været forbundet med diarrésygdom hos mennesker og dyr, er dets patogene rolle i at fremkalde diarré fortsat kontroversiel39.

Den centrale begrænsning af denne metodologiske tilgang bør anerkendes; Den indledende samling på contig-niveau resulterede i et fragmenteret udkast til genom og blev derfor yderligere udsat for stilladser mod et tættere referencegenom. Den implementerede sekventeringslæselængdekonfiguration (2 x 150 bp) og tilstedeværelsen af store, gentagne elementer i hele genomet af E. coli er de mest formodede forklaringer på den fragmenterede samling på contig-niveau. Kortlæste datasæt kan ikke løses korrekt og rekonstruerer derfor store gentagne elementer, hvilket forårsager potentielle fejlmonteringer og flere brudpunkter under monteringsprocessen. Derfor vil implementeringen af langlæste sekventeringsteknologier hjælpe med at overvinde disse begrænsninger og opnå lukkede genomer40.

Flere kritiske trin skal overvejes i hele WGS-protokollen. GDNA af høj kvalitet er det første kontrolpunkt, der kræves for at sikre sekventeringsdata af høj kvalitet. For det andet skal der i biblioteksforberedelsen udvises ekstra forsigtighed under mærkningsprocessen, især ved håndtering af flere prøver og tilsætning af indeksprimere, for at undgå krydskontaminering og ved kontrol af inkubationstiden for korrekt fragmentering af DNA-prøverne. Desuden er kvantificerings- og normaliseringstrin afgørende for at eliminere enhver bias, som DNA-biblioteker kan introducere i de endelige sekventeringsdata, da et forkert ækvimolært forhold i det samlede bibliotek kan favorisere en væsentligt ulige fordeling i antallet af læsninger pr. Prøve. Den metode, der præsenteres her, er ligetil og repræsenterer et omkostningseffektivt alternativ, hovedsageligt til optimal brug af reagenserne indeholdt i DNA-bibliotekets forberedelsessæt. Protokollen for WGS beskrevet ovenfor er blevet anvendt ikke kun på E. coli-genomsekventering, men også på andre ikke-relaterede bakteriearter såsom Vibrio parahaemolyticus41. Ifølge FN's Fødevare- og Landbrugsorganisation (FAO) og Verdenssundhedsorganisationen (WHO) kan NGS-metoder spille en afgørende rolle for fødevaresikkerheden ved at give hurtig identifikation og karakterisering af mikroorganismer og antimikrobiel resistens (AMR) med en nøjagtighed, der tidligere ikke var mulig42. Derfor udgør disse metoder et redskab til overvågning og kildesporing af patogener, ikke kun i klinisk sammenhæng, men også i risikovurderingen af fødevarebårne patogener, der afslører indsigt i disse mikroorganismers økologiske og fysiologiske egenskaber43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Til Mexicos nationale råd for videnskab og teknologi (CONACyT ved dets akronym på spansk) for ph.d.-stipendiet tildelt José Antonio Magaña-Lizárraga [nr. 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Tags

Genetik udgave 190 helgenomsekventering Escherichia coli aEPEC antimikrobiel resistens akvakultur Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Karakterisering af en patogen <em>Escherichia coli-stamme</em> afledt af <em>Oreochromis</em> spp. Gårde ved hjælp af helgenomsekventering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter