Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Karakterisering van een pathogene Escherichia coli-stam afgeleid van Oreochromis spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

De haalbaarheid van whole-genome sequencing (WGS) strategieën met behulp van benchtop instrumenten heeft de genoomondervraging van elke microbe van volksgezondheidsrelevantie in een laboratoriumomgeving vereenvoudigd. Een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS wordt beschreven en een bioinformatica pijplijn voor analyse wordt ook gepresenteerd.

Abstract

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en tilapia (Oreochromis spp.) landbouw vormt de belangrijkste zoetwatervisvariëteit die wordt gekweekt. Omdat aquacultuurpraktijken gevoelig zijn voor microbiële besmetting afgeleid van antropogene bronnen, is uitgebreid antibioticagebruik nodig, wat ertoe leidt dat aquacultuursystemen een belangrijke bron worden van antibioticaresistente en pathogene bacteriën van klinische relevantie, zoals Escherichia coli (E. coli). Hier werden de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam , hersteld van in het binnenland gekweekte Oreochromis spp., opgehelderd door middel van whole-genome sequencing (WGS) en in silico-analyse . Antimicrobiële gevoeligheidstests (ASAT) en WGS werden uitgevoerd. Bovendien werden fylogenetische groep, serotype, multilocussequentietypering (MLST), verworven antimicrobiële resistentie, virulentie, plasmide en profaaginhoud bepaald met behulp van diverse beschikbare webtools. Het E. coli-isolaat vertoonde alleen intermediaire gevoeligheid voor ampicilline en werd gekarakteriseerd als ONT:H21-B1-ST40-stam door op WGS gebaseerde typering. Hoewel slechts één antimicrobieel resistentie-gerelateerd gen werd gedetecteerd [mdf(A)], werden verschillende virulentie-geassocieerde genen (VAGs) van het atypische enteropathogene E. coli (aEPEC) pathotype geïdentificeerd. Bovendien werd de lading plasmide replicons uit grote plasmidegroepen en 18 profaag-geassocieerde regio's gedetecteerd. Kortom, de WGS-karakterisering van een aEPEC-isolaat, hersteld van een viskwekerij in Sinaloa, Mexico, biedt inzicht in het pathogene potentieel en het mogelijke risico voor de menselijke gezondheid van het consumeren van rauwe aquaculturele producten. Het is noodzakelijk om next-generation sequencing (NGS) technieken te gebruiken voor het bestuderen van micro-organismen in het milieu en om een één gezondheidskader aan te nemen om te leren hoe gezondheidsproblemen ontstaan.

Introduction

Aquacultuur is een van de snelst groeiende voedselproducerende sectoren ter wereld en de productiepraktijken zijn bedoeld om te voldoen aan de stijgende vraag naar voedsel voor menselijke consumptie. De wereldwijde aquacultuurproductie is verdrievoudigd van 34 miljoen ton (Mt) in 1997 tot 112 Mt in 20171. De belangrijkste soortengroepen, die bijdroegen aan bijna 75% van de productie, waren zeewier, karpers, tweekleppigen, meervallen en tilapia (Oreochromis spp.) 1. Het verschijnen van ziekten veroorzaakt door microbiële entiteiten is echter onvermijdelijk vanwege de intensieve viskweek, wat leidt tot potentiële economische verliezen2.

Antibioticagebruik in viskweekpraktijken staat bekend om het voorkomen en behandelen van bacteriële infecties, de belangrijkste beperkende factor in productiviteit 3,4. Niettemin hopen residuele antibiotica zich op in aquacultuursedimenten en water, waardoor selectieve druk wordt uitgeoefend en de vis-geassocieerde en de verblijvende bacteriële gemeenschappen worden gewijzigd 5,6,7,8. Bijgevolg dient de aquacultuuromgeving als reservoir voor antimicrobiële resistentiegenen (ARG's) en de verdere opkomst en verspreiding van antibioticaresistente bacteriën (ARB) in het omringende milieu9. Naast de bacteriële pathogenen die vaak worden waargenomen bij het kweken van vissen, worden leden van de Enterobacteriaceae-familie vaak aangetroffen, waaronder menselijke pathogene stammen van Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. en Salmonella spp.10. E. coli is het meest voorkomende micro-organisme geïsoleerd uit vismeel en water in de viskweek 11,12,13,14,15.

E. coli is een veelzijdige gramnegatieve bacterie die het maagdarmkanaal van zoogdieren en vogels bewoont als een commensaal lid van hun darmmicrobiota. E. coli bezit echter een zeer adaptief vermogen om te koloniseren en te volharden in verschillende milieuniches, waaronder bodem, sedimenten, voedsel en water16. Vanwege de genwinst en -verlies door het fenomeen horizontale genoverdracht (HGT), is E. coli snel geëvolueerd tot een goed aangepast antibioticumresistente ziekteverwekker, die een breed spectrum van ziekten bij mens en dier kan veroorzaken17,18. Op basis van de oorsprong van de isolatie worden pathogene varianten gedefinieerd als intestinale pathogene E. coli (InPEC) of extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC). Bovendien zijn InPEC en ExPEC onderverdeeld in goed gedefinieerde pathotypes op basis van ziektemanifestatie, genetische achtergrond, fenotypische eigenschappen en virulentiefactoren (VFs)16,17,19.

Traditionele kweek- en moleculaire technieken voor pathogene E. coli-stammen hebben de snelle detectie en identificatie van verschillende pathotypen mogelijk gemaakt. Ze kunnen echter tijdrovend, bewerkelijk en vaak een hoge technische training vereisen19. Bovendien kan geen enkele methode worden gebruikt om alle pathogene varianten van E. coli betrouwbaar te bestuderen vanwege de complexiteit van hun genetische achtergrond. Momenteel zijn deze nadelen overwonnen met de komst van high-throughput sequencing (HTS) -technologieën. Whole-genome sequencing (WGS) benaderingen en bioinformatische hulpmiddelen hebben de exploratie van microbieel DNA betaalbaar en op grote schaal verbeterd, waardoor de diepgaande karakterisering van microben in één run is vergemakkelijkt, inclusief nauw verwante pathogene varianten 20,21,22. Afhankelijk van de biologische vragen kunnen verschillende bioinformatica-tools, algoritmen en databases worden gebruikt om gegevensanalyse uit te voeren. Als het hoofddoel bijvoorbeeld is om de aanwezigheid van ARGs, VFs en plasmiden te beoordelen, kunnen tools zoals ResFinder, VirulenceFinder en PlasmidFinder, samen met hun bijbehorende databases, een goed startpunt zijn. Carriço et al.22 gaven een gedetailleerd overzicht van de verschillende bioinformatica-software en gerelateerde databases die worden toegepast voor microbiële WGS-analyse, van ruwe datavoorbewerking tot fylogenetische inferentie.

Verschillende studies hebben het brede nut van WGS aangetoond voor genoomondervraging met betrekking tot antimicrobiële resistentieattributen, pathogeen potentieel en het volgen van de opkomst en evolutionaire relaties van klinisch relevante varianten van E. coli afkomstig van verschillende oorsprong 23,24,25,26 . WGS heeft de identificatie mogelijk gemaakt van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de fenotypische resistentie tegen antimicrobiële stoffen, inclusief die zeldzame of complexe resistentiemechanismen. Dit gebeurt door het detecteren van verworven ARG-varianten, nieuwe mutaties in geneesmiddeldoelgenen of promotorregio's27,28. Bovendien biedt WGS het potentieel om antimicrobiële resistentieprofielen af te leiden zonder voorafgaande kennis over het resistentiefenotype van een bacteriestam29. Als alternatief heeft WGS de karakterisering van de mobiele genetische elementen (MGE's) met zowel antimicrobiële resistentie als virulentiekenmerken mogelijk gemaakt, wat de bacteriële genoomevolutie van bestaande pathogenen heeft aangedreven. De toepassing van WGS tijdens het onderzoek naar de Duitse E. coli-uitbraak in 2011 resulteerde bijvoorbeeld in het blootleggen van de unieke genomische kenmerken van een schijnbaar nieuw E. coli-pathotype; interessant is dat die uitbraakstammen afkomstig waren van de enteroaggregatieve E. coli (EGA) -groep, die de profaag verwierf die codeert voor het Shiga-toxine van het enterohemorragische E. coli (EHEC) pathotype30.

Dit werk presenteert een methodologische aanpassing van de workflow voor bacteriële WGS met behulp van een benchtop sequencer. Bovendien wordt een bioinformatica-pijplijn geleverd met behulp van webgebaseerde tools om de resulterende sequenties te analyseren en onderzoekers met beperkte of geen bioinformatica-expertise verder te ondersteunen. De beschreven methoden maakten het mogelijk om de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van een pathogene E. coli-stam ACM5, geïsoleerd in 2011 uit in het binnenland gekweekt Oreochromis spp. in Sinaloa, Mexico, opte helderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: De E. coli-stam ACM5 werd teruggevonden door het vismonster te verwerken en te kweken voor fecale coliforme (FC) bepaling12. Tijdens de visbemonstering vertoonden vissen geen klinische tekenen van ziekte, bacteriële of schimmelinfectie en heerste een gemiddelde temperatuur van 22,3 °C. Na isolatie werd het E. coli-isolaat onderworpen aan biochemische tests en gecryopreserveerd in hersenhartinfusie (BHI) bouillon met DMSO (8% v / v) als cryoprotectief middel.

1. Reactivering van bevroren E. coli ACM5-stamcultuur

  1. Open van de bevroren bacteriële voorraad de buis en gebruik een steriele lus, pipetpunt of tandenstoker om het oppervlak van de bevroren bacteriecultuur te schrapen.
  2. Strooi de bacteriën op een Luria-Bertani (LB) agarplaat en incubeer bij 37 ± 2 °C gedurende 24 uur.

2. Bepaling van antibacteriële gevoeligheid

OPMERKING: De hier beschreven antimicrobiële gevoeligheidstests komen overeen met de schijfdiffusiemethode op basis van de richtlijnen van het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (M02 Ed13:2018)31. E. coli ATCC 25922 stam is vereist voor kwaliteitscontrole doeleinden.

  1. Entvoorbereiding volgens koloniesuspensiemethode
    1. Streep vanaf de in stap 1.2 geïncubeerde LB-plaat een of twee kolonies op een Mueller-Hinton (MH) agarplaat en incubeer bij 37 ± 2 °C gedurende 18-24 uur.
    2. Gebruik een steriele lus om twee of drie kolonies te plukken uit het vers gesubkweekte E. coli-isolaat op MH-agarplaat en resuspenseer ze in 3 ml steriele MH-bouillon of 0,85% (w / v) zoutoplossing, grondig mengen door vortexing om een uniforme bacteriële suspensie te verkrijgen.
    3. Gebruik een UV-zichtbare spectrofotometer (zie Materiaaltabel) en pas de bacteriële suspensie aan op troebelheid die vergelijkbaar is met een 0,5 MacFarland-standaard (equivalent aan ongeveer 1-2 x 108 cellen / ml). Als de bacteriële suspensie te licht of te zwaar is, voeg dan meer E. coli-kolonies of MH-bouillon toe. Gebruik het bereide entmateriaal binnen 15 minuten na bereiding.
  2. Inenting van de test agar platen
    1. Dompel een steriel wattenstaafje in de aangepaste bacteriële suspensie. Draai het wattenstaafje meerdere keren en druk het stevig op de binnenwand van de buis om overtollig vocht uit het wattenstaafje te verwijderen.
    2. Ent een MH-agarplaat door het wattenstaafje 3x over het gehele agaroppervlak te strijken en de plaat telkens 60° te draaien. Wattenstaaf ook de rand van de agar om een gelijkmatige verdeling van het entmateriaal te garanderen.
    3. Laat het deksel van de petrischaal 3-5 minuten op een kier staan om vocht te laten verdampen.
  3. Toepassing van de antimicrobiële schijf op geënte agarplaten
    1. Verdeel gelijkmatig en druk elke antimicrobiële schijf (zie Materiaaltabel) op het oppervlak van de geënte agarplaten om volledig contact te garanderen. Keer de platen binnen 15 minuten na het aanbrengen van de schijf om en incubeer bij 35 ± 2 °C gedurende 16-18 uur.
      OPMERKING: Maximaal 12 en zes schijven moeten worden gebruikt in petrischalen van respectievelijk 150 mm en 100 mm.
  4. Meet na incubatie de zone van remmingsgroottes met behulp van een Vernier-remklauw en interpreteer de resulterende diameters volgens de CLSI-breekpuntcriteria (M100 - Tabel 2A)32.

3. Genomisch DNA (gDNA) extractie en kwantificering

  1. Genomische DNA-extractie
    1. Resuspenseer een lus vol vers gekweekte E. coli-kolonies in 5 ml LB-bouillon en incubeer een nacht in een schuddende incubator (180 tpm) bij 37 ± 2 °C.
    2. Centrifugeer de bacteriële suspensie bij 3.500 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg.
    3. Extraheer gDNA volgens de richtlijnen van de DNA-extractiekit (zie materiaaltabel).
    4. Controleer de zuiverheid van het gDNA door de optische dichtheid te meten bij 260/280 nm (verhouding: >1,8) en 260/230 nm (verhouding: 2,0-2,2) met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer. Voer 0,8% agarose gel-elektroforese uit om de gDNA-integriteit te verifiëren.
  2. Genomische DNA-kwantificering
    OPMERKING: Gebruik alleen dunwandige, heldere PCR-buizen van 0,5 ml die zijn goedgekeurd door de fabrikant van de fluorescentietestkit (zie materiaaltabel).
    1. Stel het vereiste aantal buizen in voor monsters en testnormen. Bereid de werkende testoplossing voor door component A en component B in de kit te mengen, volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    2. Bereid de testnormen voor door 190 μL van de werkoplossing en 10 μL van elke standaard aan de juiste buis toe te voegen (er zijn twee normen vereist).
    3. Voeg 198 μL van de werkoplossing en 2 μL van het DNA-monster toe aan de juiste buis. Meng krachtig door alle buizen gedurende 5 s te vortexen. Pas op dat je geen bubbels creëert.
    4. Incubeer alle buizen gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Meet de fluorescentie van alle buizen op basis van de richtlijnen van de fabrikant met behulp van de fluorometer (zie Materiaaltabel).
    5. Pas de concentratie van het gDNA-monster goed aan voor de volgordebepaling.

4. Voorbereiding van de DNA-bibliotheek

OPMERKING: DNA-bibliotheekvoorbereiding en -sequencing werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en protocollen van de fabrikant (zie materiaaltabel). De beginnende gDNA-concentratie is 4,0 ng.

  1. Tagmentatie, PCR-versterking en indexering
    1. Voeg in een buis van 0,2 ml 2,5 μL tagmentatiebuffer en 2 μL input gDNA (2,0 ng/μL) toe. Meng voorzichtig door te pipetteren.
    2. Voeg 1 μL versterkingsbuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de monsters in een thermocycler (zie Materiaaltabel) en voer het volgende PCR-programma uit: 55 °C gedurende 5 minuten en houd ze vervolgens op 10 °C. Wanneer de monsters 10 °C bereiken, ga dan onmiddellijk verder om de reactie te neutraliseren.
    4. Voeg 1 μL neutraliserende buffer toe aan de monsterbuizen en meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voeg 1,7 μL van elke indexadapter (d.w.z. indexen i7 en i5) en 3 μL indexerende PCR-mastermix toe. Meng voorzichtig door te pipetteren. Draai af op 280 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
    6. Plaats de monsters in de thermocycler en voer als volgt een tweede PCR-reactie uit: 72 °C gedurende 3 min, 95 °C gedurende 30 s, 18 cycli van 95 °C gedurende 10 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 5 minuten en vasthouden op 10 °C.
  2. Versterkte bibliotheek opruimen
    1. Meng door vortexing van de commerciële magnetische kraaloplossing (zie Tabel van materialen) op basis van de richtlijnen van de fabrikant.
    2. Breng het gelabelde/geïndexeerde gDNA-monster over in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 0,6 μL magnetische kralen toe voor elke μL van het uiteindelijke volume van het gDNA-monster (≈13 μL). Meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Plaats de monsterbuizen gedurende 2 minuten op een magnetisch rek (zie Materiaaltabel) totdat het supernatant is opgeruimd. Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
    4. Voeg 200 μL vers bereide 80% ethanol toe zonder te mengen. Incubeer gedurende 30 s totdat het eluaat is verdwenen en verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te storen.
    5. Voer een tweede wasstap uit. Voeg 200 μL 80% ethanol toe aan de kralen en incubeer gedurende 30 s. Nadat het eluaat is opgeklaard, verwijdert u het supernatant en gooit u het weg en droogt u de kralen gedurende 10 minuten aan de lucht.
    6. Voeg 15 μL 10 mM tris buffer (pH 8) toe aan de kralen en meng voorzichtig door te pipetteren. Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsterbuizen opnieuw op het magnetische rek gedurende 2 minuten, zodat het supernatant kan worden gewist.
    7. Breng voorzichtig 14 μL van het supernatant over van de monsterbuis naar een nieuwe buis van 0,2 ml. Dit is de opgeschoonde bibliotheek.
      OPMERKING: Op dit punt kan de opgeschoonde bibliotheek maximaal 7 dagen bij -20 °C worden bewaard.
  3. Bibliotheek normalisatie
    1. Ga verder met het kwantificeren van de opgeschoonde bibliotheken door fluorescentietest zoals beschreven in stap 3.2, met uitzondering van stap 3.2.5.
    2. Visualiseer de opgeschoonde bibliotheken op een 1% agarose gel-elektroforese om de gemiddelde fragmentgroottes te bepalen.
    3. Bereken de molariteitswaarde van de bibliotheek met behulp van de volgende vergelijking:
      Equation 1
    4. Bereken met behulp van de molariteitswaarde de juiste volumes resuspensiebuffer (RSB) en opgeschoonde bibliotheken om de individuele bibliotheek te verdunnen met een startconcentratie van 10 nM.

5. Bibliotheekpooling, denaturalisatie en sequencer initiëren

  1. Ontdooi de reagenspatroon volgens de aanwijzingen van de fabrikant. Haal de stroomcel uit de koelkast (4 °C) en breng deze op kamertemperatuur voordat u deze opvolgt.
  2. Pool 5 μL van elke genormaliseerde bibliotheek (10 nM) in een low-bind 1,5 ml buis. Verdun de gepoolde bibliotheek op 4 nM met het juiste volume RSB.
  3. Voeg 5 μL van de gepoolde bibliotheek (4 nM) en 5 μL 0,2 N NaOH toe in een nieuwe buis met lage binding van 1,5 ml. Kort mengen door vortexing, spin naar beneden op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de gepoolde bibliotheek in enkele strengen te denatureren.
  4. Meng voorzichtig 10 μL gedenatureerde gepoolde bibliotheek en 990 μL vooraf gechilleerde hybridisatiebuffer door pipetteren en op ijs plaatsen totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is uitgevoerd. De concentratie van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek is 20 pM.
  5. Ontdooi en bereid een controlebibliotheek (zie materiaaltabel) in een concentratie van 4 nM door 2 μL controlebibliotheek (10 nM) en 3 μL nucleasevrij water te mengen.
  6. Meng 5 μL van de controlebibliotheek (4 nM) en 5 μL vers bereid 0,2 N NaOH. Kort mengen door vortexing, spin naar beneden op 280 x g gedurende 1 min en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de besturingsbibliotheek in enkele strengen te denatureren.
  7. Meng voorzichtig 10 μL gedenatureerde controlebibliotheek en 990 μL vooraf gechilleerde hybridisatiebuffer door pipetteren en plaats op ijs totdat de uiteindelijke verdunning voor het laden van de sequencer is voltooid. De concentratie van de gedenatureerde controlebibliotheek is 20 pM.
  8. Combineer in een nieuwe low-bind buis van 1,5 ml 594 μL van de gedenatureerde gepoolde bibliotheek bij 20 pM en 6 μL van de gedenatureerde controlebibliotheek bij 20 pM. Meng goed.
  9. Verdun de uiteindelijke bibliotheekmix (20 pM) tot een uiteindelijke belastingsconcentratie van 1,2 pM in een volume van 600 μL met behulp van de vooraf voorgeschreven hybridisatiebuffer.
  10. Voordat u het uiteindelijke bibliotheekmengsel op de reagenscartridge laadt, voert u een extra thermische voorbehandeling uit om een efficiënte belasting in de stroomcel te bereiken. Incubeer de uiteindelijke bibliotheekmix gedurende 2 min bij 96 °C. Keer de buis om te mengen en plaats de buis gedurende 5 minuten op ijs.
  11. Laad 500 μL van de uiteindelijke bibliotheekmix in het ontworpen reservoir op de reagenspatroon. Start de volgorde volgens de richtlijnen. Laad de flowcel en de reagenscartridge en stel de sequencingrun in.

6. Analyse van sequentiegegevens

OPMERKING: Raadpleeg aanvullend bestand 1 voor een verdere beschrijving van de algemene voorbewerking van WGS-gegevens, software, parameterinstellingen en sequentieanalyse van het E. coli-genoom .

  1. Maak verbinding met de sequencing-gegevensserver en download de FASTQ-bestanden.
  2. Evalueer de initiële kwaliteit van onbewerkte sequentiegegevens met software van derden. Verwijder restadaptersequenties, basissen van lage kwaliteit (Aanvullend bestand 1).
  3. Verzamel de op kwaliteit gecontroleerde sequencinggegevens in contig- of steigerniveau met behulp van software van derden (zie Aanvullend bestand 1).
  4. Voer genoomannotatie uit door het FASTA-bestand met het geassembleerde genoom in te dienen bij de RAST-server (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Upload het FASTA-bestand naar de webplatforms Center for Genome Epidemiology (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) en ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) om epidemiologische kenmerken, ARG's, VAGs en plasmiden te identificeren (zie aanvullend bestand 1).
  6. Upload het FASTA-bestand naar de PHASTER-server om prophagesequenties te identificeren (https://phaster.ca/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De antimicrobiële gevoeligheid werd bepaald door de schijfdiffusiemethode en geïnterpreteerd door CLSI-breekpuntcriteria voor 12 antibiotica verspreid over zes verschillende antimicrobiële klassen, dat wil zeggen aminoglycosiden, β-lactams, fluoroquinolonen, nitrofuranen, fenicolen en folaatrouteantagonisten. De E. coli ACM5 vertoonde gevoeligheid voor alle antibiotica behalve één β-lactamgeneesmiddel. Vier β-lactamgeneesmiddelen werden getest: ampicilline, carbenicilline, cefalotheïne en cefotaxime. Onder deze werd een remmingshalo van 14 mm voor ampicilline gemeten. Daarom vertoont E. coli ACM5 volgens de CLSI-interpretatieve categorieën voor ampicilline (vatbaar: ≥17 mm; intermediair: 14-16 mm; resistent: ≤13 mm) 32, een intermediaire gevoeligheid voor ampicilline.

De E. coli ACM5 werd onderworpen aan WGS met behulp van de benchtop sequencer. Daarom werd het DNA-monster voorbereid, gemultiplext en gesequenced volgens het beschreven protocol. Over het algemeen leverde de sequencingrun met mid-outputconfiguratie 3,37 Gb aan gegevens op met een foutenpercentage van 0,73%, en 89,71% van de bases scoorde een kwaliteit boven Q3033. Met name de sequencing van E. coli ACM5 genereerde een totaal van 1.490.594 paired end (PE) reads. De ruwe sequentiegegevens van deze studie werden gedeponeerd in de sequence read archive (SRA) database bij het national center for biotechnology information (NCBI) onder BioProject nummer PRJNA715781.

Na de eerste kwaliteitscontrole en filtering werd 96,8% van de reads bewaard gebleven uit ruwe sequencinggegevens en samengevoegd tot steigers met een dekkingsdiepte van 38x. De genoomassemblage op steigerniveau genereerde 83 scaffolds (>300 bp), 5.272.433 bp lang en met een GC-gehalte van 50,61%. Genoomannotatie onthulde 5.633 gecodeerde kenmerken, waarvan 5.524 eiwitcoderende genen (CDS'en) en 109 RNA-gerelateerde sequenties (figuur 1). Bovendien groepeerde genoomannotatie CDS'en in verzamelingen van functioneel gerelateerde eiwitten die subsystemen worden genoemd, vooral die welke een functionele rol spelen in koolhydraten, eiwitten, aminozuren en afgeleide stofwisselingen en membraantransport (figuur 2).

In silico typering voorspelde E. coli ACM5 als een O-niet-typeerbare (ONT) stam toegewezen aan het ONT:H21 serotype. Bovendien toonde het aan dat het behoort tot de fyllogroep B1 en het sequentietype (ST) 40. Een enkele verworven antimicrobiële resistentiedeterminant die codeert voor een multidrug effluxpomp van breedspectrum werd geïdentificeerd, dat wil zeggen het mdf(A) -gen (figuur 1).

Wat virulentiekenmerken betreft, kwamen verschillende VAGs voor in het E. coli-genoom dat wordt bestudeerd, waaronder genen die coderen voor een hittestabiel enterotoxine (astA), een serumresistentie-eiwit (iss) en het type III-secretiesysteem (T3SS) samen met de uitgescheiden effectoreiwitten (figuur 1). De bundelvormende pili (BFP) operon en de perABC-gencluster werden niet aangetoond. Bijgevolg werd volgens het voorspelde virulentieprofiel E. coli ACM5 toegewezen aan het aEPEC-pathotype.

WGS-analyse onthulde ook twee vermeende grote plasmiden die behoren tot verschillende incompatibiliteitsgroepen (Inc) in het E. coli-genoom (d.w.z. de IncF- en IncI-plasmidegroepen). Beide misten echter ARGs en VAGs. Bovendien werden 18 profaaggerelateerde regio's geïdentificeerd; in tegenstelling tot plasmiden herbergen die echter VAGs, waaronder het iss-gen , het sitABCD-operon dat codeert voor een ijzer / mangaantransporter en een paar T3SS-effectoreiwitten (figuur 1).

Figure 1
Figuur 1: Cirkelvormige kaart van het trekgenoom van E. coli ACM5. Gegevens van de buitenste naar de binnenste cirkels worden als volgt gedeclareerd en gekleurd. Cirkel 1: Genoomgrootteschaal in basenparen. Cirkels 2 en 3: Geannoteerde CDS'en getranscribeerd op respectievelijk de voorwaartse (blauwe) en omgekeerde (rode) DNA-streng. Cirkels 4 en 5: Respectievelijk Ribosomale RNA's (zwart) en transfer-RNA's (groen). Cirkel 6: 83 steigers van het trekgenoom (grijs). Cirkel 7: Geannoteerde kenmerken: antimicrobiële resistentiedeterminanten (rood), virulentie-geassocieerde genen (paars) en profaaggebieden (aqua). Cirkel 8: %GC-gehalte (zwart). Cirkel 9: GC scheef. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Subsysteemverdeling van aEPEC-stam ACM5. De analyse is gebaseerd op RAST SEED-annotatie. Het cirkeldiagram organiseert de subsystemen per cellulair proces en de eiwitcoderende genen die betrokken zijn bij het respectieve cellulaire proces worden tussen haakjes aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1. Beschrijving van WGS-gegevensvoorverwerking, software, parameterinstellingen en sequentieanalyse van het E. coli ACM5-genoom. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze studie presenteert een aanpassing van de bacteriële WGS-workflow met behulp van een benchtop sequencer en een pijplijn voor genomische karakterisering van een pathogene E. coli-variant . Afhankelijk van het gebruikte sequencingplatform kunnen de doorlooptijden (TATs) voor natte laboratoriumprocedures (bacteriekweek, gDNA-extractie, bibliotheekvoorbereiding en sequencing) en sequentieanalyse variëren, vooral als langzaam groeiende bacteriën worden bestudeerd. Volgens het hierboven beschreven protocol voor WGS was de TAT binnen 4 dagen, wat vergelijkbaar is met wat de literatuur momenteel stelt (<5 dagen) 34.

De theoretische diepte van de dekking voor genoomsequencing van E. coli ACM5 werd berekend op 30x. Niettemin genereerde de sequencing empirische gegevens voor de genoomassemblage op 38x diepte. Zoals eerder aanbevolen35, was dit voldoende om een volledige genoomrepresentatie te krijgen en downstream data-analyse te volgen met betrekking tot de antimicrobiële resistentie, virulentie en mobiloomkenmerken van E. coli ACM5. Met inachtneming van antimicrobiële resistentie werden alleen de verworven determinanten onderzocht. E. coli ACM5 is een ampicilline-resistent isolaat, maar alleen het MdfA multidrug efflux pompcoderingsgen werd waargenomen. Dit verleent echter geen resistentie tegen β-lactams36, en er werd geen andere verworven determinant geïdentificeerd die betrokken is bij β-lactamresistentie. Daarom is het waarschijnlijk dat een combinatie van andere moleculaire mechanismen, zoals verminderde celmembraandoorlaatbaarheid en verhoogde expressie van verschillende effluxpompsystemen, ten grondslag ligt aan de waargenomen ampicillineresistentie37.

Wat virulentiekenmerken betreft, is de enige aanwezigheid van het intimin-coderende gen (eae) de kenmerkende genetische marker van aEPEC-stammen. Het aEPEC-pathotype is een subset van intestinale pathogene E. coli-stam die de locus of enterocyte effacement (LEE) pathogeniciteitseiland draagt, waar een T3SS en geassocieerde effector / translocatoreiwitten worden gecodeerd, waaronder Cif, EspA / B / D, EspF, intimin en de getransloceerde intiminreceptor (Tir). Het samenspel tussen T3SS en zijn effectoren is direct betrokken bij het vermogen om de hechtende en effacing (A / E) laesies op intestinale epitheelcellen te bevorderen door typische enteropathogene E. coli (EPEC) en EHEC, beide pathotypen die bekend staan als door mensen overgedragen ziektenveroorzakers17,19. Het astA-gen codeert voor een hittebestendig enterotoxine genaamd EAST1, en hoewel het voor het eerst werd herkend en geassocieerd met EGA-stammen, is het EAST1-toxine wijd verspreid onder E. coli-pathotypen38. Hier toonde WGS aan dat E. coli ACM5 het astA-gen bezit, en ondanks het feit dat EAST1-producerende E. coli-isolaten in verband zijn gebracht met diarreeziekte bij mens en dier, blijft de pathogene rol ervan bij het opwekken van diarree controversieel39.

De belangrijkste beperking van deze methodologische benadering moet worden erkend; de initiële assemblage op contigniveau resulteerde in een gefragmenteerd trekgenoom en werd daarom verder onderworpen aan steigers tegen een dichterbij referentiegenoom. De geïmplementeerde sequencing leeslengte configuratie (2 x 150 bp) en de aanwezigheid van enorme, repetitieve elementen in het genoom van E. coli zijn de meest vermoedelijke verklaringen voor de gefragmenteerde contig-level assemblage. Kortgelezen datasets kunnen niet correct oplossen en reconstrueren daarom grote repetitieve elementen, waardoor potentiële misassemblages en verschillende breekpunten tijdens het assemblageproces ontstaan. Daarom zou de implementatie van long-read sequencing-technologieën helpen bij het overwinnen van deze beperkingen en het verkrijgen van gesloten genomen40.

Verschillende kritieke stappen moeten worden overwogen in het WGS-protocol. Hoogwaardige gDNA is het eerste controlepunt dat nodig is om hoogwaardige sequencinggegevens te garanderen. Ten tweede moet bij de voorbereiding van de bibliotheek extra voorzichtigheid worden betracht tijdens het tagmentatieproces, vooral bij de behandeling van meerdere monsters en de toevoeging van indexprimers, om kruisbesmetting te voorkomen en bij het beheersen van de incubatietijd, om de DNA-monsters goed te fragmenteren. Bovendien zijn kwantificerings- en normalisatiestappen essentieel om eventuele vertekeningen te elimineren die DNA-bibliotheken in de uiteindelijke sequencinggegevens zouden kunnen introduceren, omdat een onjuiste equimolaire verhouding in de gepoolde bibliotheek een aanzienlijk ongelijke verdeling in het aantal reads per monster kan bevorderen. De hier gepresenteerde methode is eenvoudig en vormt een kosteneffectief alternatief, voornamelijk voor het optimale gebruik van de reagentia in de voorbereidingskits van de DNA-bibliotheek. Het hierboven beschreven protocol voor WGS is niet alleen toegepast op E. coli-genoomsequencing , maar ook op andere niet-verwante bacteriesoorten zoals Vibrio parahaemolyticus41. Volgens de Voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties (FAO) en de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) kunnen NGS-methodologieën een bepalende rol spelen in de voedselveiligheid door snelle identificatie en karakterisering van micro-organismen en antimicrobiële resistentie (AMR) te bieden met een nauwkeurigheid die voorheen niet mogelijk was42. Daarom vormen deze methodologieën een instrument voor surveillance en brontracering van pathogenen, niet alleen in de klinische context, maar ook in de risicobeoordeling van door voedsel overgedragen pathogenen, waardoor inzichten in de ecologische en fysiologische eigenschappen van deze micro-organismen worden onthuld43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Aan de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie van Mexico (CONACyT door zijn acroniem in het Spaans) voor de doctoraatsbeurs toegekend aan José Antonio Magaña-Lizárraga [nr. 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Tags

Genetica whole-genome sequencing Escherichia coli aEPEC antimicrobiële resistentie aquacultuur Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Karakterisering van een pathogene <em>Escherichia coli-stam</em> afgeleid van <em>Oreochromis</em> spp. Boerderijen met behulp van whole-genome sequencing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter