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Genetics

ओरियोक्रोमिस एसपीपी से प्राप्त रोगजनक एस्चेरिचिया कोलाई स्ट्रेन का लक्षण वर्णन पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग करके खेतों

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

बेंचटॉप उपकरणों का उपयोग करके पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) रणनीतियों की व्यवहार्यता ने प्रयोगशाला सेटिंग में सार्वजनिक स्वास्थ्य प्रासंगिकता के प्रत्येक माइक्रोब की जीनोम पूछताछ को सरल बना दिया है। बैक्टीरियल डब्ल्यूजीएस के लिए वर्कफ़्लो का एक पद्धतिगत अनुकूलन वर्णित है और विश्लेषण के लिए एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन भी प्रस्तुत की गई है।

Abstract

एक्वाकल्चर दुनिया भर में सबसे तेजी से बढ़ते खाद्य उत्पादक क्षेत्रों में से एक है और तिलापिया (ओरियोक्रोमिस एसपीपी) खेती सुसंस्कृत प्रमुख मीठे पानी की मछली की किस्म का गठन करती है। क्योंकि जलीय कृषि प्रथाएं मानवजनित स्रोतों से प्राप्त माइक्रोबियल संदूषण के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं, इसलिए व्यापक एंटीबायोटिक उपयोग की आवश्यकता होती है, जिससे जलीय कृषि प्रणाली एंटीबायोटिक प्रतिरोधी और नैदानिक प्रासंगिकता के रोगजनक बैक्टीरिया जैसे एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) का एक महत्वपूर्ण स्रोत बन जाती है। यहां, एक रोगजनक ई कोलाई स्ट्रेन की रोगाणुरोधी प्रतिरोध, विषाणु और मोबिलोम विशेषताओं को, अंतर्देशीय खेती वाले ओरियोक्रोमिस एसपीपी से बरामद किया गया था, पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) और सिलिको विश्लेषण में स्पष्ट किया गया था। रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण (एएसटी) और डब्ल्यूजीएस किया गया था। इसके अलावा, फाइटोलैनेटिक समूह, सीरोटाइप, मल्टीलोकस अनुक्रम टाइपिंग (एमएलएसटी), अधिग्रहित रोगाणुरोधी प्रतिरोध, विषाणु, प्लास्मिड और प्रोफेज सामग्री को विभिन्न उपलब्ध वेब उपकरणों का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। ई कोलाई आइसोलेट ने केवल एम्पीसिलीन के लिए मध्यवर्ती संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया और डब्ल्यूजीएस-आधारित टाइपिंग द्वारा ओएनटी: एच 21-बी 1-एसटी 40 तनाव के रूप में विशेषता दी गई। यद्यपि केवल एक रोगाणुरोधी प्रतिरोध से संबंधित जीन [एमडीएफ (ए)] का पता लगाया गया था, एटिपिकल एंटरोपैथोजेनिक ई कोलाई (एपीईसी ) पैथोटाइप से कई विषाणु-संबद्ध जीन (वीएजी) की पहचान की गई थी। इसके अतिरिक्त, बड़े प्लास्मिड समूहों और 18 प्रोफेज से जुड़े क्षेत्रों से प्लास्मिड रिप्लिकॉन के कार्गो का पता लगाया गया था। अंत में, सिनालोआ, मेक्सिको में एक मछली फार्म से बरामद एक एईपीईसी आइसोलेट का डब्ल्यूजीएस लक्षण वर्णन, इसकी रोगजनक क्षमता और कच्चे एक्वाकल्चरल उत्पादों के सेवन के संभावित मानव स्वास्थ्य जोखिम में अंतर्दृष्टि की अनुमति देता है। पर्यावरणीय सूक्ष्मजीवों का अध्ययन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) तकनीकों का फायदा उठाना और स्वास्थ्य मुद्दों की उत्पत्ति कैसे होती है, यह जानने के लिए एक स्वास्थ्य ढांचे को अपनाना आवश्यक है।

Introduction

एक्वाकल्चर दुनिया भर में सबसे तेजी से बढ़ते खाद्य उत्पादक क्षेत्रों में से एक है, और इसकी उत्पादन प्रथाओं का उद्देश्य मानव उपभोग के लिए बढ़ती खाद्य मांग को पूरा करना है। वैश्विक जलीय कृषि उत्पादन 1997 में 34 मिलियन टन (एमटी) से तीन गुना बढ़कर 2017 में 112 मिलियन टन होगया है। उत्पादन के लगभग 75% में योगदान देने वाले मुख्य प्रजाति समूह, समुद्री शैवाल, कार्प, बाइवाल्व, कैटफ़िश और तिलापिया (ओरेओक्रोमिस एसपीपी) थे। 1. हालांकि, गहन मछली पालन के कारण माइक्रोबियल संस्थाओं के कारण होने वाली बीमारियों की उपस्थिति अपरिहार्य है, जिससे संभावित आर्थिक नुकसान होसकता है।

मछली पालन प्रथाओं में एंटीबायोटिक का उपयोग बैक्टीरिया के संक्रमण को रोकने और इलाज के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, उत्पादकता में मुख्य सीमित कारक 3,4। फिर भी, अवशिष्ट एंटीबायोटिक्स जलीय कृषि तलछट और पानी में जमा होते हैं, चयनात्मक दबाव डालते हैं और मछली से जुड़े और रहने वाले जीवाणुसमुदायों को संशोधित करते हैं 5,6,7,8। नतीजतन, जलीय कृषि वातावरण रोगाणुरोधी प्रतिरोध जीन (एआरजी) के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है, और आसपास के परिवेश में एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया (एआरबी) के आगे उद्भव और प्रसार के रूप में कार्य करताहै। आमतौर पर मछली पालन प्रथाओं को प्रभावित करने वाले जीवाणु रोगजनकों के अलावा, एंटरोबैक्टीरिया परिवार के सदस्यों का अक्सर सामना किया जाता है, जिसमें एंटरोबैक्टर एसपीपी, एस्चेरिचिया कोलाई, क्लेबसिएला एसपीपी और साल्मोनेला एसपीपी.10 के मानव रोगज़नक़ उपभेद शामिल हैं। ई कोलाई मछली पालन में मछली के भोजन और पानी से अलग सबसे आम सूक्ष्मजीव है 11,12,13,14,15।

ई कोलाई एक बहुमुखी ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो स्तनधारियों और पक्षियों के जठरांत्र संबंधी मार्ग में उनके आंतों के माइक्रोबायोटा के एक सदस्य के रूप में निवास करता है। हालांकि, ई कोलाई में मिट्टी, तलछट, भोजन और पानी सहित विभिन्न पर्यावरणीय स्थानों में उपनिवेश बनाने और बने रहने की अत्यधिकअनुकूली क्षमता होती है। क्षैतिज जीन स्थानांतरण (एचजीटी) घटना के माध्यम से जीन लाभ और हानि के कारण, ई कोलाई तेजी से एक अच्छी तरह से अनुकूलित एंटीबायोटिक प्रतिरोधी रोगज़नक़ में विकसित हुआ है, जो मनुष्योंऔर जानवरों में बीमारियों के व्यापक स्पेक्ट्रम का कारण बनने में सक्षम है। अलगाव उत्पत्ति के आधार पर, रोगजनक वेरिएंट को आंतों के रोगजनक ई कोलाई (InPEC) या अतिरिक्त आंतों के रोगजनक ई कोलाई (ExPEC) के रूप में परिभाषित किया गया है। इसके अलावा, InPEC और ExPEC को रोग अभिव्यक्ति, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, फेनोटाइपिक लक्षण, और विषाणु कारकों (VFs) 16,17,19 के अनुसार अच्छी तरह से परिभाषित पैथोटाइप में उपवर्गीकृत किया गया है।

रोगजनक ई कोलाई उपभेदों के लिए पारंपरिक संस्कृति और आणविक तकनीकों ने विभिन्न पैथोटाइप की तेजी से पहचान और पहचान की अनुमति दी है। हालांकि, वे समय लेने वाले, श्रमसाध्य हो सकते हैं, और अक्सर उच्च तकनीकी प्रशिक्षण की आवश्यकता होतीहै। इसके अलावा, ई कोलाई के सभी रोगजनक रूपों का विश्वसनीय अध्ययन करने के लिए उनकी आनुवंशिक पृष्ठभूमि की जटिलता के कारण किसी भी एक विधि का उपयोग नहीं किया जा सकता है। वर्तमान में, इन कमियों को उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण (एचटीएस) प्रौद्योगिकियों के आगमन के साथ दूर किया गया है। संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) दृष्टिकोण और जैव सूचना विज्ञान उपकरणों ने माइक्रोबियल डीएनए की खोज में किफायती और बड़े पैमाने पर सुधार किया है, जिससे एक ही रन में रोगाणुओं के गहन लक्षण वर्णन की सुविधा मिलती है, जिसमें निकटता से संबंधित रोगजनक वेरिएंट20,21,22 शामिल हैं। जैविक प्रश्नों के आधार पर, डेटा विश्लेषण करने के लिए कई जैव सूचना विज्ञान उपकरण, एल्गोरिदम और डेटाबेस का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि मुख्य लक्ष्य एआरजी, वीएफ और प्लास्मिड की उपस्थिति का आकलन करना है, तो रेसफाइंडर, वायरुलेंसफाइंडर और प्लास्मिडफाइंडर जैसे उपकरण, उनके संबंधित डेटाबेस के साथ, एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु हो सकता है। कैरिको एट अल .22 ने कच्चे डेटा प्रीप्रोसेसिंग से फाइटोलैनेटिक अनुमान तक, माइक्रोबियल डब्ल्यूजीएस विश्लेषण के लिए लागू विभिन्न जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर और संबंधित डेटाबेस का विस्तृत अवलोकन प्रदान किया।

कई अध्ययनों ने रोगाणुरोधी प्रतिरोध विशेषताओं, रोगजनक क्षमता और विभिन्न मूल 23,24,25,26 से प्राप्त ई कोलाई के नैदानिक रूप से प्रासंगिक वेरिएंट के उद्भव और विकासवादी संबंधों की ट्रैकिंग के बारे में जीनोम पूछताछ के लिए डब्ल्यूजीएस की व्यापक उपयोगिता का प्रदर्शन किया है। . डब्ल्यूजीएस ने रोगाणुरोधी के फेनोटाइपिक प्रतिरोध को अंतर्निहित आणविक तंत्र की पहचान को सक्षम किया है, जिसमें दुर्लभ या जटिल प्रतिरोध तंत्र शामिल हैं। यह अधिग्रहित एआरजी वेरिएंट, दवा-लक्ष्य जीन में नए उत्परिवर्तन, या प्रमोटरक्षेत्रों 27,28 का पता लगाने के माध्यम से है। इसके अलावा, डब्ल्यूजीएस एक जीवाणु तनाव29 के प्रतिरोध फेनोटाइप के बारे में पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना रोगाणुरोधी प्रतिरोध प्रोफाइल का अनुमान लगाने की क्षमता प्रदान करता है। वैकल्पिक रूप से, डब्ल्यूजीएस ने एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध और विषाणु दोनों विशेषताओं को ले जाने वाले मोबाइल आनुवंशिक तत्वों (एमजीई) के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है, जिसने मौजूदा रोगजनकों के जीवाणु जीनोम विकास को प्रेरित किया है। उदाहरण के लिए, 2011 में जर्मन ई कोलाई प्रकोप की जांच के दौरान डब्ल्यूजीएस के आवेदन के परिणामस्वरूप स्पष्ट रूप से उपन्यास ई कोलाई पैथोटाइप की अनूठी जीनोमिक विशेषताओं को उजागर किया गया; दिलचस्प बात यह है कि उन प्रकोप उपभेदों की उत्पत्ति एंटरोएग्रिगेटिव ई कोलाई (ईएईसी) समूह से हुई थी, जिसने एंटरोहेमोरेजिक ई कोलाई (ईएचईसी) पैथोटाइप30 से शिगा विष को एन्कोडिंग करने वाले प्रोफेज का अधिग्रहण किया था।

यह काम बेंचटॉप सीक्वेंसर का उपयोग करके बैक्टीरियल डब्ल्यूजीएस के लिए वर्कफ़्लो का एक पद्धतिगत अनुकूलन प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, परिणामी अनुक्रमों का विश्लेषण करने और सीमित या बिना जैव सूचना विज्ञान विशेषज्ञता वाले शोधकर्ताओं का समर्थन करने के लिए वेब-आधारित उपकरणों का उपयोग करके एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन प्रदान की जाती है। वर्णित विधियों ने एक रोगजनक ई कोलाई स्ट्रेन एसीएम 5 के रोगाणुरोधी प्रतिरोध, विषाणु और मोबिलोम विशेषताओं के स्पष्टीकरण की अनुमति दी, जो 2011 में सिनालोआ, मैक्सिको12 में अंतर्देशीय खेती वाले ओरियोक्रोमिस एसपीपी से अलग किया गया था।

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Protocol

नोट: ई कोलाई स्ट्रेन एसीएम 5 को फेकल कोलीफॉर्म (एफसी) निर्धारण12 के लिए मछली के नमूने को संसाधित और संवर्धन करके पुनर्प्राप्त किया गया था। मछली के नमूने के दौरान, मछली ने बीमारी, जीवाणु या फंगल संक्रमण के नैदानिक लक्षण नहीं दिखाए, और 22.3 डिग्री सेल्सियस का औसत तापमान प्रबल हुआ। अलगाव के बाद, ई कोलाई आइसोलेट को जैव रासायनिक परीक्षण के अधीन किया गया और क्रायोप्रोटेक्टिव एजेंट के रूप में डीएमएसओ (8% वी / वी) के साथ मस्तिष्क हृदय जलसेक (बीएचआई) शोरबा में क्रायोप्रिजर्व किया गया।

1. जमे हुए ई कोलाई एसीएम 5 स्टॉक कल्चर का पुनर्सक्रियन

  1. जमे हुए बैक्टीरियल स्टॉक से, ट्यूब खोलें और जमे हुए जीवाणु संस्कृति की सतह को खुरचने के लिए बाँझ लूप, पिपेट टिप या टूथपिक का उपयोग करें।
  2. बैक्टीरिया को लुरिया-बर्टानी (एलबी) एगर प्लेट पर रखें और 24 घंटे के लिए 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

2. जीवाणुरोधी संवेदनशीलता का निर्धारण

नोट: यहां वर्णित रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण नैदानिक और प्रयोगशाला मानक संस्थान (सीएलएसआई) दिशानिर्देशों (एम 02 एड 13: 2018) 31 के आधार पर डिस्क प्रसार विधि से मेल खाता है। ई कोलाई गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए एटीसीसी 25922 स्ट्रेन की आवश्यकता होती है।

  1. कॉलोनी निलंबन विधि द्वारा इनोकुलम की तैयारी
    1. चरण 1.2 में इनक्यूबेट की गई एलबी प्लेट से, एक या दो कॉलोनियों को म्यूलर-हिंटन (एमएच) आगर प्लेट पर ले जाएं और 18-24 घंटे के लिए 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एमएच आगर प्लेट पर ताजा उप-संवर्धित ई कोलाई आइसोलेट से दो या तीन कॉलोनियों को चुनने के लिए एक बाँझ लूप का उपयोग करें और उन्हें 3 एमएल बाँझ एमएच शोरबा या 0.85% (डब्ल्यू / वी) खारा घोल में फिर से निलंबित करें, एक समान जीवाणु निलंबन प्राप्त करने के लिए भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, बैक्टीरिया के निलंबन को 0.5 मैकफारलैंड मानक (लगभग 1-2 x 108 कोशिकाओं / एमएल के बराबर) के बराबर टर्बिडिटी में समायोजित करें। यदि बैक्टीरियल निलंबन बहुत हल्का या बहुत भारी है, तो उपयुक्त रूप से अधिक ई कोलाई कॉलोनियों या एमएच शोरबा जोड़ें। तैयारी के 15 मिनट के भीतर तैयार इनोकुलम का उपयोग करें।
  2. परीक्षण एगर प्लेटों का टीकाकरण
    1. समायोजित जीवाणु निलंबन में एक बाँझ कपास के फाहे को डुबोएं। स्वैब को कई बार घुमाएं और स्वैब से अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटाने के लिए ट्यूब की अंदर की दीवार पर मजबूती से दबाएं।
    2. पूरी आगर की सतह पर स्वैब 3x को घुमाकर एक एमएच एगर प्लेट को टीका लगाएं, हर बार प्लेट को 60 डिग्री घुमाएं। इनोकुलम के समान वितरण को सुनिश्चित करने के लिए आगर के रिम को भी स्वैब करें।
    3. नमी को वाष्पित करने की अनुमति देने के लिए पेट्री डिश ढक्कन को 3-5 मिनट के लिए छोड़ दें।
  3. टीका लगाए गए एगर प्लेटों पर रोगाणुरोधी डिस्क का अनुप्रयोग
    1. समान रूप से वितरित करें और पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक रोगाणुरोधी डिस्क ( सामग्री की तालिका देखें) को टीकाकृत आगर प्लेटों की सतह पर दबाएं। डिस्क अनुप्रयोग के बाद 15 मिनट के भीतर प्लेटों को उलट दें और 16-18 घंटे के लिए 35 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: क्रमशः 150 मिमी और 100 मिमी के पेट्री व्यंजनों में अधिकतम 12 और छह डिस्क का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. इनक्यूबेशन के बाद, वर्नियर कैलिपर का उपयोग करके निषेध आकार के क्षेत्र को मापें और सीएलएसआई ब्रेकपॉइंट मानदंड (एम 100 - तालिका 2 ए) 32 के अनुसार परिणामी व्यास की व्याख्या करें।

3. जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) निष्कर्षण और परिमाणीकरण

  1. जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण
    1. एलबी शोरबा के 5 एमएल में ताजा सुसंस्कृत ई कोलाई कॉलोनियों के एक लूप को फिर से निलंबित किया गया और 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर एक हिलने वाले इनक्यूबेटर (180 आरपीएम) में रात भर इनक्यूबेट किया गया।
    2. 5 मिनट के लिए 3,500 x g पर बैक्टीरियल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें।
    3. डीएनए निष्कर्षण किट दिशानिर्देशों के बाद जीडीएनए निकालें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    4. यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 एनएम (अनुपात: >1.8) और 260/230 एनएम (अनुपात: 2.0-2.2) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापकर जीडीएनए की शुद्धता की जांच करें। जीडीएनए अखंडता को सत्यापित करने के लिए 0.8% एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन करें।
  2. जीनोमिक डीएनए परिमाणीकरण
    नोट: प्रतिदीप्ति परख किट निर्माता द्वारा अनुमोदित केवल पतली दीवार, स्पष्ट, 0.5 एमएल पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. नमूने और परख मानकों के लिए आवश्यक संख्या में ट्यूब सेट करें। निर्माता के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए किट में प्रदान किए गए घटक ए और घटक बी को मिलाकर काम करने वाला परख समाधान तैयार करें।
    2. उपयुक्त ट्यूब में काम करने वाले समाधान के 190 μL और प्रत्येक मानक के 10 μL को जोड़कर परख मानकों को तैयार करें (दो मानकों की आवश्यकता होती है)।
    3. उपयुक्त ट्यूब में काम करने वाले समाधान के 198 μL और डीएनए नमूने के 2 μL जोड़ें। 5 सेकंड के लिए सभी ट्यूबों को भंवर करके सख्ती से मिलाएं। बुलबुले पैदा न करने के लिए सावधान रहें।
    4. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए सभी ट्यूबों को इनक्यूबेट करें, प्रकाश से सुरक्षित। फ्लोरोमीटर का उपयोग करके निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर सभी ट्यूबों की प्रतिदीप्ति को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    5. अनुक्रमण आगे बढ़ने के लिए जीडीएनए नमूना एकाग्रता को ठीक से समायोजित करें।

4. डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी

नोट: डीएनए लाइब्रेरी की तैयारी और अनुक्रमण निर्माता के दिशानिर्देशों और प्रोटोकॉल का पालन करते हुए किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। शुरुआती जीडीएनए एकाग्रता 4.0 एनजी है।

  1. टैगमेंटेशन, पीसीआर प्रवर्धन, और अनुक्रमण
    1. 0.2 एमएल ट्यूब में, 2.5 μL टैगमेंटेशन बफर और 2 μL इनपुट gDNA (2.0 ng/ पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं।
    2. १ μL प्रवर्धन बफर जोड़ें और पाइप द्वारा धीरे से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 280 x g पर स्पिन करें।
    3. नमूने को थर्मोसाइक्लर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और निम्नलिखित पीसीआर प्रोग्राम चलाएं: 5 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, फिर 10 डिग्री सेल्सियस पर रखें। जब नमूने 10 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाते हैं, तो प्रतिक्रिया को बेअसर करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    4. नमूना ट्यूबों में बफर को बेअसर करने का 1 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। 1 मिनट के लिए 280 x g पर स्पिन करें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. प्रत्येक इंडेक्स एडाप्टर (यानी, इंडेक्स i7 और i5) का 1.7 μL और इंडेक्सिंग पीसीआर मास्टर मिक्स का 3 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 280 x g पर स्पिन करें।
    6. नमूने को थर्मोसाइक्लर में रखें और निम्नानुसार दूसरी पीसीआर प्रतिक्रिया करें: 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 18 चक्र, 30 सेकंड के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, और 10 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो।
  2. प्रवर्धित पुस्तकालय की सफाई
    1. निर्माता के दिशानिर्देशों के आधार पर वाणिज्यिक चुंबकीय मोती समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) को भंवर करके मिलाएं।
    2. टैग किए गए/अनुक्रमित जीडीएनए नमूने को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और जीडीएनए नमूने के अंतिम आयतन के प्रत्येक μL के लिए 0.6 μL चुंबकीय मोती जोड़ें (≈13 μL)। पाइपिंग द्वारा धीरे-धीरे मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. नमूना ट्यूबों को चुंबकीय रैक पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें) 2 मिनट के लिए जब तक कि सतह पर तैरने वाला साफ न हो जाए। मोतियों को परेशान किए बिना सुपरनैटेंट को सावधानी से हटा दें और छोड़ दें।
    4. मिश्रण के बिना ताजा तैयार 80% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें। 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि एलुएट साफ न हो जाए और मोतियों को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें और त्याग दें।
    5. एक दूसरा वॉश स्टेप करें। मोतियों में 80% इथेनॉल का 200 μL जोड़ें और 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें। एलुएट साफ होने के बाद, सतह पर तैरने वाले को हटा दें और छोड़ दें और मोतियों को 10 मिनट के लिए हवा से सुखाएं।
    6. मोतियों में 10 mM tris बफर (pH 8) का 15 μL जोड़ें और पाइपिंग द्वारा धीरे से मिलाएं। कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। नमूना ट्यूबों को फिर से चुंबकीय रैक पर 2 मिनट के लिए रखें, जिससे सतह पर तैरने वाला साफ हो सके।
    7. नमूना ट्यूब से सुपरनैटेंट के 14 μL को एक नई 0.2 एमएल ट्यूब में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। यह साफ-सुथरी लाइब्रेरी है।
      नोट: इस बिंदु पर, साफ की गई लाइब्रेरी को 7 दिनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. लायब्रेरी सामान्यीकरण
    1. चरण 3.2.5 को छोड़कर, चरण 3.2 में वर्णित प्रतिदीप्ति परख द्वारा साफ-सुथरे पुस्तकालयों की मात्रा निर्धारित करने के लिए आगे बढ़ें।
    2. औसत टुकड़े के आकार को निर्धारित करने के लिए 1% अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन पर साफ-सुथरे पुस्तकालयों की कल्पना करें।
    3. निम्न समीकरण का उपयोग करके लायब्रेरी के दाढ़ता मान की गणना करें:
      Equation 1
    4. मोलरिटी मान का उपयोग करते हुए, 10 एनएम की शुरुआती एकाग्रता पर व्यक्तिगत पुस्तकालय को पतला करने के लिए रीसस्पेंशन बफर (आरएसबी) और साफ-अप पुस्तकालयों की उचित मात्रा की गणना करें।

5. लाइब्रेरी पूलिंग, डिनेचुरलाइजिंग और सीक्वेंसर की शुरुआत

  1. निर्माता के निर्देशों के बाद अभिकर्मक कारतूस को पिघलाएं। रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) से प्रवाह सेल निकालें और अनुक्रमण से पहले इसे कमरे के तापमान पर लाएं।
  2. प्रत्येक सामान्यीकृत पुस्तकालय (10 एनएम) के पूल 5 μL को कम-बाइंड 1.5 एमएल ट्यूब में। आरएसबी की उचित मात्रा के साथ 4 एनएम पर पूल किए गए पुस्तकालय को पतला करें।
  3. एक नई लो-बाइंड 1.5 एमएल ट्यूब में पूल की गई लाइब्रेरी (4 एनएम) के 5 μL और 0.2 N NaOH के 5 μL जोड़ें। संक्षेप में भंवर द्वारा मिलाएं, 1 मिनट के लिए 280 x g पर घूमें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ताकि पूल किए गए पुस्तकालय को एकल किस्में में विभाजित किया जा सके।
  4. धीरे-धीरे 10 μL विकृत पूल ्ड लाइब्रेरी और 990 μL प्रीचिल्ड हाइब्रिडाइजेशन बफर को पाइपिंग द्वारा मिलाएं और जब तक कि अनुक्रमक लोडिंग के लिए अंतिम कमजोर पड़ने तक बर्फ पर रखें। विकृत पूल लाइब्रेरी की एकाग्रता 20 पीएम है।
  5. नियंत्रण पुस्तकालय (10 एनएम) के 2 μL और न्यूक्लियस मुक्त पानी के 3 μL को मिलाकर 4 nM की एकाग्रता पर एक नियंत्रण पुस्तकालय ( सामग्री की तालिका देखें) को पिघलाएं और तैयार करें।
  6. नियंत्रण लाइब्रेरी (4 एनएम) के 5 μL और ताजा तैयार 0.2 N NaOH के 5 μL मिलाएं। संक्षेप में भंवर द्वारा मिलाएं, 1 मिनट के लिए 280 x g पर घूमें, और नियंत्रण पुस्तकालय को एकल किस्में में विभाजित करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. धीरे से 10 μL विकृत नियंत्रण पुस्तकालय और 990 μL प्रीचिल्ड संकरण बफर को पाइपिंग द्वारा मिलाएं और अनुक्रमक लोडिंग के लिए अंतिम कमजोर पड़ने तक बर्फ पर रखें। विकृत नियंत्रण पुस्तकालय की एकाग्रता 20 pM है।
  8. एक नई लो-बाइंड 1.5 एमएल ट्यूब में, 20 पीएम पर विकृत पूल लाइब्रेरी के 594 μL और 20 pM पर विकृत नियंत्रण लाइब्रेरी के 6 μL को मिलाएं। ठीक से मिलाएं।
  9. प्रीचिल्ड हाइब्रिडाइजेशन बफर का उपयोग करके 600 μL की मात्रा में अंतिम लाइब्रेरी मिश्रण (20 pM) को 1.2 pM की अंतिम लोडिंग एकाग्रता तक पतला करें।
  10. अभिकर्मक कारतूस पर अंतिम पुस्तकालय मिश्रण लोड करने से पहले, प्रवाह सेल में कुशल लोडिंग प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त थर्मल उपचार करें। 96 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए अंतिम पुस्तकालय मिश्रण को इनक्यूबेट करें। ट्यूब को मिश्रण करने के लिए उलटा करें, और ट्यूब को 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
  11. अभिकर्मक कारतूस पर डिजाइन किए गए जलाशय में अंतिम पुस्तकालय मिश्रण के 500 μL लोड करें। दिशानिर्देशों का पालन करते हुए अनुक्रमण शुरू करें। प्रवाह सेल और अभिकर्मक कारतूस लोड करें और अनुक्रमण रन सेट करें।

6. अनुक्रम डेटा विश्लेषण

नोट: सामान्य डब्ल्यूजीएस डेटा प्रीप्रोसेसिंग, सॉफ्टवेयर, पैरामीटर सेटिंग्स और ई कोलाई जीनोम के अनुक्रम विश्लेषण के आगे विवरण के लिए पूरक फ़ाइल 1 की जांच करें।

  1. अनुक्रमण डेटा सर्वर से कनेक्ट करें और FASTQ फ़ाइलें डाउनलोड करें।
  2. तीसरे पक्ष के सॉफ़्टवेयर के साथ कच्चे अनुक्रम डेटा की प्रारंभिक गुणवत्ता का मूल्यांकन करें। कच्चे अनुक्रमण डेटा से अवशेष एडाप्टर अनुक्रम, निम्न-गुणवत्ता वाले आधार (<क्यू 30), और लघु पठन (<50 बीपी) को हटा दें ( पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  3. तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके गुणवत्ता-जाँच किए गए अनुक्रमण डेटा को निरंतर या मचान-स्तर में इकट्ठा करें (पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  4. आरएएसटी सर्वर (https://rast.nmpdr.org/) को इकट्ठे जीनोम युक्त फास्टा फ़ाइल जमा करके जीनोम एनोटेशन करें।
  5. महामारी विज्ञान की विशेषताओं, एआरजी, वीएजी और प्लास्मिड की पहचान करने के लिए सेंटर फॉर जीनोम एपिडेमियोलॉजी (सीजीई) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) और क्लेर्मोनटाइपिंग (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) वेब प्लेटफार्मों पर एफएएसटीए फ़ाइल अपलोड करें (पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  6. प्रोफेज अनुक्रमों की पहचान करने के लिए PHASTER सर्वर पर FASTA फ़ाइल अपलोड करें (https://phaster.ca/).

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Representative Results

रोगाणुरोधी संवेदनशीलता डिस्क प्रसार विधि द्वारा निर्धारित की गई थी और छह अलग-अलग रोगाणुरोधी वर्गों में फैले 12 एंटीबायोटिक दवाओं के लिए सीएलएसआई ब्रेकपॉइंट मानदंडों द्वारा व्याख्या की गई थी, अर्थात्, एमिनोग्लाइकोसाइड्स, β-लैक्टम, फ्लोरोक्विनोलोन, नाइट्रोफ्यूरान, फेनिल और फोलेट मार्ग विरोधी। ई कोलाई एसीएम 5 ने एक β-लैक्टम दवा को छोड़कर सभी एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया। चार β-लैक्टम दवाओं का परीक्षण किया गया था: एम्पीसिलीन, कार्बेनिसिलिन, सेफलोथिन और सेफोटैक्सिम। इनमें से, एम्पीसिलीन के लिए 14 मिमी निषेध प्रभामंडल मापा गया था। इसलिए एम्पीसिलीन (अतिसंवेदनशील: ≥17 मिमी; मध्यवर्ती: 14-16 मिमी; प्रतिरोधी: ≤13 मिमी) 32 के लिए सीएलएसआई व्याख्यात्मक श्रेणियों के अनुसार, ई कोलाई एसीएम 5 एम्पीसिलीन के लिए एक मध्यवर्ती संवेदनशीलता दिखाता है।

ई कोलाई एसीएम 5 को बेंचटॉप सीक्वेंसर का उपयोग करके डब्ल्यूजीएस के अधीन किया गया था। इसलिए, डीएनए नमूना तैयार किया गया था, मल्टीप्लेक्स किया गया था, और वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए अनुक्रमित किया गया था। कुल मिलाकर, मिड-आउटपुट कॉन्फ़िगरेशन के साथ आयोजित अनुक्रमण रन ने 0.73% की त्रुटि दर के साथ 3.37 जीबी डेटा प्राप्त किया, और 89.71% आधारों ने Q3033 से ऊपर की गुणवत्ता हासिल की। विशेष रूप से, ई कोलाई एसीएम 5 के अनुक्रमण ने कुल 1,490,594 युग्मित अंत (पीई) रीडिंग उत्पन्न किए। इस अध्ययन से कच्चे अनुक्रम डेटा को जैव प्रौद्योगिकी सूचना के लिए राष्ट्रीय केंद्र (एनसीबीआई) में बायोप्रोजेक्ट संख्या पीआरजेएनए 715781 के तहत अनुक्रम रीड आर्काइव (एसआरए) डेटाबेस में जमा किया गया था।

प्रारंभिक गुणवत्ता जांच और फ़िल्टरिंग के बाद, 96.8% रीड को कच्चे अनुक्रमण डेटा से संरक्षित किया गया और 38 गुना कवरेज की गहराई के साथ मचानों में इकट्ठा किया गया। पाड़-स्तरीय जीनोम असेंबली ने 83 मचान (>300 बीपी), लंबाई में 5,272,433 बीपी और 50.61% जीसी सामग्री के साथ उत्पन्न किया। जीनोम एनोटेशन ने 5,633 एन्कोडेड विशेषताओं का खुलासा किया, जिनमें से 5,524 प्रोटीन-कोडिंग जीन (सीडीएस) हैं और 109 आरएनए से संबंधित अनुक्रम हैं (चित्रा 1)। इसके अतिरिक्त, जीनोम एनोटेशन ने सीडीएस को कार्यात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन के संग्रह में वर्गीकृत किया, जिसे सबसिस्टम कहा जाता है, विशेष रूप से कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, अमीनो एसिड और व्युत्पन्न चयापचय और झिल्ली परिवहन में कार्यात्मक भूमिका निभाने वाले (चित्रा 2)।

सिलिको टाइपिंग में ई कोलाई एसीएम 5 को ओएनटी: एच 21 सीरोटाइप को सौंपे गए ओ-नॉनटाइपेबल (ओएनटी) तनाव के रूप में भविष्यवाणी की गई थी। इसके अतिरिक्त, यह दिखाया गया कि यह फ़ाइलोग्रुप बी 1 और अनुक्रम प्रकार (एसटी) 40 से संबंधित है। व्यापक स्पेक्ट्रम के मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप के लिए एक एकल अधिग्रहित रोगाणुरोधी प्रतिरोध निर्धारक कोडिंग की पहचान की गई थी, अर्थात, एमडीएफ (ए) जीन (चित्रा 1)।

विषाणु लक्षणों के संबंध में, अध्ययन के तहत ई कोलाई जीनोम में कई वीएजी दिखाए गए, जिसमें गर्मी-स्थिर एंटरोटॉक्सिन (एस्टा), एक सीरम प्रतिरोध प्रोटीन (आईएसएस), और टाइप III स्राव प्रणाली (टी 3 एसएस) के लिए एन्कोडिंग जीन शामिल हैं। बंडल बनाने वाले पिली (बीएफपी) ऑपेरॉन और पेरएबीसी जीन क्लस्टर का सबूत नहीं दिया गया था। नतीजतन, अनुमानित विषाणु प्रोफ़ाइल के अनुसार, ई कोलाई एसीएम 5 को एपीईसी पैथोटाइप को सौंपा गया था।

डब्ल्यूजीएस विश्लेषण ने ई कोलाई जीनोम (यानी, इंकएफ और इंकआई प्लास्मिड समूहों) में विभिन्न असंगति (इंक) समूहों से संबंधित दो कथित बड़े प्लास्मिड का भी खुलासा किया। हालांकि, दोनों में एआरजी और वीएजी की कमी थी। इसके अलावा, 18 प्रोफेज से जुड़े क्षेत्रों की पहचान की गई थी; हालांकि, प्लास्मिड के विपरीत, वे वीएजी को परेशान करते हैं, जिसमें आईएसएस जीन, लोहे / मैंगनीज ट्रांसपोर्टर के लिए सिटाबसीडी ऑपेरॉन एन्कोडिंग और कुछ टी 3 एसएस प्रभावक प्रोटीन शामिल हैं (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्रा 1: ई कोलाई एसीएम 5 के मसौदा जीनोम का परिपत्र मानचित्र। सबसे बाहरी से सबसे भीतरी मंडलों तक डेटा को निम्नानुसार घोषित और रंगीन किया जाता है। सर्कल 1: आधार जोड़े में जीनोम आकार पैमाने। सर्कल 2 और 3: एनोटेटेड सीडीएस क्रमशः आगे (नीले) और रिवर्स (लाल) डीएनए स्ट्रैंड पर स्थानांतरित होते हैं। सर्कल 4 और 5: राइबोसोमल आरएनए (काला) और ट्रांसफर आरएनए (हरा), क्रमशः। सर्कल 6: ड्राफ्ट जीनोम (ग्रे) के 83 मचान। सर्कल 7: एनोटेटेड विशेषताएं: रोगाणुरोधी प्रतिरोध निर्धारक (लाल), विषाणु से जुड़े जीन (बैंगनी), और प्रोफेज क्षेत्र (एक्वा)। वृत्त 8: %GC सामग्री (काला). सर्कल 9: जीसी तिरछा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एपीईसी स्ट्रेन एसीएम 5 का उपप्रणाली वितरण। विश्लेषण आरएएसटी सीड एनोटेशन पर आधारित है। पाई चार्ट सेलुलर प्रक्रिया द्वारा उपप्रणालियों को व्यवस्थित करता है, और संबंधित सेलुलर प्रक्रिया में शामिल प्रोटीन-कोडिंग जीन को पेरेंटेसिस में इंगित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फाइल 1. डब्ल्यूजीएस डेटा प्रीप्रोसेसिंग, सॉफ्टवेयर, पैरामीटर सेटिंग्स और ई कोलाई एसीएम 5 जीनोम के अनुक्रम विश्लेषण का विवरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह अध्ययन एक बेंचटॉप सीक्वेंसर का उपयोग करके बैक्टीरियल डब्ल्यूजीएस वर्कफ़्लो का अनुकूलन प्रस्तुत करता है और रोगजनक ई कोलाई संस्करण के जीनोमिक लक्षण वर्णन के लिए एक पाइपलाइन प्रदान करता है। उपयोग किए गए अनुक्रमण मंच के आधार पर, गीली प्रयोगशाला प्रक्रियाओं (जीवाणु संवर्धन, जीडीएनए निष्कर्षण, पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण) और अनुक्रम विश्लेषण के लिए टर्नअराउंड टाइम (टीएटी) अलग-अलग हो सकते हैं, खासकर अगर धीमी गति से बढ़ने वाले बैक्टीरिया का अध्ययन किया जाता है। ऊपर वर्णित डब्ल्यूजीएस के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, टीएटी 4 दिनों के भीतर था, जो वर्तमान में साहित्य (<5 दिन) 34 के बराबर है।

ई कोलाई एसीएम 5 के जीनोम अनुक्रमण के लिए कवरेज की सैद्धांतिक गहराई की गणना 30x पर की गई थी। बहरहाल, अनुक्रमण ने 38x गहराई पर जीनोम असेंबली के लिए अनुभवजन्य डेटा उत्पन्न किया। जैसा कि पहले सिफारिश की गई थी, यह पूरे जीनोम प्रतिनिधित्व को प्राप्त करने और ई कोलाई एसीएम 5 की रोगाणुरोधी प्रतिरोध, विषाणु और मोबिलोम विशेषताओं के बारे में डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण का पालन करने के लिए पर्याप्त था। रोगाणुरोधी प्रतिरोध का सम्मान करते हुए, केवल अधिग्रहित निर्धारकों की जांच की गई थी। ई कोलाई एसीएम 5 एक एम्पीसिलीन प्रतिरोधी आइसोलेट है, लेकिन केवल एमडीएफए मल्टीड्रग एफ्लक्स पंप एन्कोडिंग जीन देखा गया था। हालांकि, यह β-लैक्टम36 के प्रतिरोध को प्रदान नहीं करता है, और β-लैक्टम प्रतिरोध में शामिल किसी अन्य अधिग्रहित निर्धारक की पहचान नहीं की गई थी। इसलिए, यह संभावना है कि अन्य आणविक तंत्रों का एक संयोजन, जैसे कि कोशिका झिल्ली पारगम्यता में कमी और अलग-अलग एफ्लक्स पंप सिस्टम की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति, देखे गए एम्पीसिलीन प्रतिरोध37 को अंतर्निहित करती है।

विषाणु लक्षणों के संबंध में, इंटिमिन-एन्कोडिंग जीन (ईएई) की एकमात्र उपस्थिति एपीईसी उपभेदों का हॉलमार्क आनुवंशिक मार्कर है। एपीईसी पैथोटाइप आंतों के रोगजनक ई कोलाई स्ट्रेन का एक उप-समूह है, जो एंटरोसाइट एफफेसमेंट (एलईई) रोगजनकता द्वीप का स्थान ले जाता है, जहां एक टी 3 एसएस और संबंधित प्रभावक / ट्रांसलोकेटर प्रोटीन एन्कोड किए जाते हैं, जिसमें सीआईएफ, एस्पा / बी / डी, ईएसपीएफ, इंटिमिन और ट्रांसलोकेटेड इंटिमिन रिसेप्टर (टीआईआर) शामिल हैं। टी 3 एसएस और इसके प्रभावकों के बीच परस्पर क्रिया सीधे विशिष्ट एंटरोपैथोजेनिक ई कोलाई (ईपीईसी) और ईएचईसी द्वारा आंतों के उपकला कोशिकाओं पर संलग्न और एफेज़िंग (ए / ई) घावों को बढ़ावा देने की क्षमता में शामिल है, दोनों पैथोटाइप जिन्हें मानव खाद्य जनित बीमारी प्रेरक एजेंट17,19 के रूप में जाना जाता है। एस्टा जीन ईस्ट 1 नामक एक गर्मी प्रतिरोधी एंटरोटॉक्सिन को एन्कोड करता है, और हालांकि इसे पहली बार पहचाना गया था और ईएईसी उपभेदों के साथ जोड़ा गया था, ईस्ट 1 विष व्यापक रूप से ई कोलाई पैथोटाइप38 के बीच वितरित किया जाता है। यहां, डब्ल्यूजीएस ने प्रदर्शित किया कि ई कोलाई एसीएम 5 में एस्टा जीन है, और इस तथ्य के बावजूद कि ईस्ट 1-उत्पादक ई कोलाई आइसोलेट्स मनुष्यों और जानवरों में दस्त की बीमारी से जुड़े हुए हैं, दस्त को प्राप्त करने में इसकी रोगजनकभूमिका विवादास्पद बनी हुई है।

इस पद्धतिगत दृष्टिकोण की प्रमुख सीमा को स्वीकार किया जाना चाहिए; प्रारंभिक निरंतर-स्तरीय असेंबली के परिणामस्वरूप एक खंडित मसौदा जीनोम हुआ, और इसलिए इसे एक निकट संदर्भ जीनोम के खिलाफ मचान के अधीन किया गया। कार्यान्वित अनुक्रमण पठन लंबाई विन्यास (2 x 150 बीपी) और ई कोलाई के जीनोम में विशाल, दोहराए जाने वाले तत्वों की उपस्थिति खंडित निरंतर-स्तरीय असेंबली के लिए सबसे अधिक अनुमानित स्पष्टीकरण हैं। शॉर्ट-रीड डेटासेट सही ढंग से हल नहीं कर सकते हैं, और इसलिए बड़े दोहराव वाले तत्वों का पुनर्निर्माण करते हैं, जिससे असेंबली प्रक्रिया के दौरान संभावित गलत संयोजन और कई ब्रेकपॉइंट होते हैं। इसलिए, लंबे समय तक पढ़ने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के कार्यान्वयन से इन सीमाओं पर काबू पाने और बंद जीनोम प्राप्त करने में सहायतामिलेगी।

पूरे डब्ल्यूजीएस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदमों पर विचार किया जाना चाहिए। उच्च गुणवत्ता वाले जीडीएनए उच्च गुणवत्ता वाले अनुक्रमण डेटा को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक पहली चेकपॉइंट है। दूसरे, पुस्तकालय की तैयारी में, टैगमेंटेशन प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त सावधानी बरतनी चाहिए, विशेष रूप से कई नमूनों को संभालने और इंडेक्स प्राइमरों को जोड़ने में, क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए, और इनक्यूबेशन समय को नियंत्रित करने में, डीएनए नमूनों को ठीक से विभाजित करने के लिए। इसके अलावा, किसी भी पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए परिमाणीकरण और सामान्यीकरण कदम आवश्यक हैं जो डीएनए पुस्तकालय अंतिम अनुक्रमण डेटा में पेश कर सकते हैं, क्योंकि पूल किए गए पुस्तकालय में एक गलत इक्विमोलर अनुपात प्रति नमूने पढ़ने की संख्या में काफी असमान वितरण का पक्ष ले सकता है। यहां प्रस्तुत विधि सीधी है और मुख्य रूप से, डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट में निहित अभिकर्मकों के इष्टतम उपयोग के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प का प्रतिनिधित्व करती है। ऊपर वर्णित डब्ल्यूजीएस के लिए प्रोटोकॉल न केवल ई कोलाई जीनोम अनुक्रमण पर लागू किया गया है, बल्कि अन्य असंबंधित जीवाणु प्रजातियों जैसे विब्रियो पैराहेमोलिटिकस41 पर भी लागू किया गया है। संयुक्त राष्ट्र के खाद्य और कृषि संगठन (एफएओ) और विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, एनजीएस पद्धतियां सूक्ष्मजीवों और रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) की तेजी से पहचान और लक्षण वर्णन प्रदान करके खाद्य सुरक्षा में एक निर्धारित भूमिका निभा सकती हैं जोपहले संभव नहीं थी। इसलिए, ये पद्धतियां न केवल नैदानिक संदर्भ में बल्कि खाद्यजनित रोगजनकों के जोखिम मूल्यांकन में भी रोगजनकों की निगरानी और स्रोत ट्रैकिंग के लिए एक उपकरण का गठन करती हैं,जो इन सूक्ष्मजीवों के पारिस्थितिक और शारीरिक गुणों में अंतर्दृष्टि का खुलासा करती हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

जोस एंटोनियो मागना-लिजारागा [संख्या 481143] को प्रदान की गई डॉक्टरेट छात्रवृत्ति के लिए मेक्सिको के नेशनल काउंसिल ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी (स्पेनिश में इसके संक्षिप्त नाम से कोनासाइट)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

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जेनेटिक्स अंक 190 पूरे जीनोम अनुक्रमण एस्चेरिचिया कोलाई एपीईसी रोगाणुरोधी प्रतिरोध जलीय कृषि ओरेओक्रोमिस एसपीपी।

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

<em>ओरियोक्रोमिस</em> एसपीपी से प्राप्त रोगजनक <em>एस्चेरिचिया कोलाई</em> स्ट्रेन का लक्षण वर्णन पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग करके खेतों
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Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

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