Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Характеристика патогенного штамма Escherichia coli , полученного из Oreochromis spp. Фермы с использованием секвенирования всего генома

Published: December 23, 2022 doi: 10.3791/64404
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

ERRATUM NOTICE

Summary

Осуществимость стратегий секвенирования всего генома (WGS) с использованием настольных инструментов упростила опрос генома каждого микроба, имеющего отношение к общественному здравоохранению в лабораторных условиях. Описана методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS и представлен конвейер биоинформатики для анализа.

Abstract

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, а выращивание тилапии (Oreochromis spp.) представляет собой основной культивируемый сорт пресноводных рыб. Поскольку практика аквакультуры восприимчива к микробному загрязнению, полученному из антропогенных источников, необходимо широкое использование антибиотиков, что приводит к тому, что системы аквакультуры становятся важным источником устойчивых к антибиотикам и патогенных бактерий, имеющих клиническое значение, таких как Escherichia coli (E. coli). Здесь устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli , извлеченного из внутреннего выращивания Oreochromis spp., были выяснены с помощью секвенирования всего генома (WGS) и анализа in silico . Было проведено тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (AST) и WGS. Кроме того, филогенетическая группа, серотип, типирование многолокусных последовательностей (MLST), приобретенная устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность, содержание плазмиды и профагов были определены с использованием различных доступных веб-инструментов. Изолят E. coli проявлял только промежуточную восприимчивость к ампициллину и характеризовался как штамм ONT:H21-B1-ST40 путем типирования на основе WGS. Хотя был обнаружен только один ген, связанный с устойчивостью к противомикробным препаратам [mdf(A)], было идентифицировано несколько вирулентно-ассоциированных генов (VAG) из атипичного энтеропатогенного патотипа E. coli (aEPEC). Кроме того, был обнаружен груз плазмидных репликонов из крупных плазмидных групп и 18 профаго-ассоциированных областей. В заключение, характеристика WGS изолята aEPEC, извлеченного с рыбной фермы в Синалоа, Мексика, позволяет понять его патогенный потенциал и возможный риск для здоровья человека, связанный с потреблением сырых аквакультурных продуктов. Необходимо использовать методы секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения микроорганизмов окружающей среды и принять единую систему здравоохранения, чтобы узнать, как возникают проблемы со здоровьем.

Introduction

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, и ее производственная практика предназначена для удовлетворения растущего спроса на продовольствие для потребления человеком. Мировое производство аквакультуры утроилось с 34 миллионов тонн в 1997 году до 112 тонн в 2017году1. Основными группами видов, на которые приходилось почти 75% производства, были морские водоросли, карпы, двустворчатые моллюски, сом и тилапия (Oreochromis spp.) 1. Однако появление заболеваний, вызванных микробными образованиями, неизбежно из-за интенсивного рыбоводства, что приводит к потенциальным экономическим потерям2.

Использование антибиотиков в рыбоводстве хорошо известно профилактикой и лечением бактериальных инфекций, что является основным ограничивающим фактором продуктивности 3,4. Тем не менее, остаточные антибиотики накапливаются в отложениях аквакультуры и воде, оказывая селективное давление и модифицируя связанные с рыбой и проживающие бактериальные сообщества 5,6,7,8. Следовательно, среда аквакультуры служит резервуаром для генов устойчивости к противомикробным препаратам (ARG) и дальнейшего появления и распространения устойчивых к антибиотикам бактерий (ARB) в окружающей среде9. В дополнение к бактериальным патогенам, обычно наблюдаемым, влияющим на методы рыбоводства, часто встречаются члены семейства Enterobacteriaceae, включая штаммы патогенов человека Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. и Salmonella spp.10. Кишечная палочка является наиболее распространенным микроорганизмом, выделенным из рыбной муки и воды в рыбоводстве 11,12,13,14,15.

Кишечная палочка является универсальной грамотрицательной бактерией, населяющей желудочно-кишечный тракт млекопитающих и птиц как комменсальный член их кишечной микробиоты. Тем не менее, e. coli обладает высокой адаптивной способностью колонизировать и сохраняться в различных экологических нишах, включая почву, отложения, пищу и воду16. Из-за усиления и потери генов в результате явления горизонтального переноса генов (HGT) e. coli быстро превратилась в хорошо адаптированный устойчивый к антибиотикам патоген, способный вызывать широкий спектр заболеваний у людей и животных17,18. Исходя из происхождения выделения, патогенные варианты определяются как кишечная патогенная Кишечная палочка (InPEC) или внекишечная патогенная E. coli (ExPEC). Кроме того, InPEC и ExPEC подразделяются на четко определенные патотипы в соответствии с проявлением заболевания, генетическим фоном, фенотипическими признаками и факторами вирулентности (VFs)16,17,19.

Традиционная культура и молекулярные методы для патогенных штаммов E. coli позволили быстро обнаружить и идентифицировать различные патотипы. Однако они могут быть трудоемкими, трудоемкими и часто требуют высокой технической подготовки19. Кроме того, ни один метод не может быть использован для достоверного изучения всех патогенных вариантов кишечной палочки из-за сложности их генетического фона. В настоящее время эти недостатки были преодолены с появлением технологий высокопроизводительного секвенирования (HTS). Подходы к секвенированию всего генома (WGS) и биоинформационные инструменты улучшили исследование микробной ДНК по доступной цене и в больших масштабах, облегчая углубленную характеристику микробов за один прогон, включая тесно связанные патогенные варианты 20,21,22. В зависимости от биологических вопросов для выполнения анализа данных можно использовать несколько инструментов, алгоритмов и баз данных биоинформатики. Например, если основной целью является оценка наличия ARG, VF и плазмид, такие инструменты, как ResFinder, VirulenceFinder и PlasmidFinder, вместе с связанными с ними базами данных, могут быть хорошей отправной точкой. Carriço et al.22 представили подробный обзор различных программ биоинформатики и связанных с ними баз данных, применяемых для анализа микробных WGS, от предварительной обработки необработанных данных до филогенетического вывода.

Несколько исследований продемонстрировали широкую полезность WGS для опроса генома в отношении признаков устойчивости к противомикробным препаратам, патогенного потенциала и отслеживания возникновения и эволюционных отношений клинически значимых вариантов E. coli, полученных из различных источников 23,24,25,26 . WGS позволила идентифицировать молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипической устойчивости к противомикробным препаратам, включая редкие или сложные механизмы резистентности. Это происходит путем обнаружения приобретенных вариантов ARG, новых мутаций в генах-мишенях лекарств или промоторных областях27,28. Кроме того, WGS предлагает потенциал для вывода профилей устойчивости к противомикробным препаратам, не требуя предварительных знаний о фенотипе резистентности бактериального штамма29. В качестве альтернативы, WGS позволила охарактеризовать мобильные генетические элементы (MME), несущие как устойчивость к противомикробным препаратам, так и признаки вирулентности, что привело к эволюции бактериального генома существующих патогенов. Например, применение WGS во время расследования вспышки кишечной палочки в Германии в 2011 году привело к раскрытию уникальных геномных особенностей явно нового патотипа E. coli; Интересно, что эти штаммы вспышки произошли из группы энтерогрегации E. coli (EAEC), которая приобрела профаг, кодирующий токсин Шига, из энтерогеморрагического патотипа E. coli (EHEC)30.

В данной работе представлена методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS с использованием настольного секвенсора. Кроме того, конвейер биоинформатики предоставляется с использованием веб-инструментов для анализа полученных последовательностей и дальнейшей поддержки исследователей с ограниченным опытом или вообще без опыта в области биоинформатики. Описанные методы позволили выяснить антимикробную устойчивость, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli ACM5, выделенного в 2011 году из внутреннего выращивания Oreochromis spp. в Синалоа, Мексика12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм E. coli ACM5 был извлечен путем обработки и культивирования образца рыбы для определения фекальной кишечной палочки (FC)12. Во время отбора проб рыбы у рыбы не было клинических признаков заболевания, бактериальной или грибковой инфекции, и преобладала средняя температура 22,3 ° C. После выделения изолят E. coli подвергали биохимическому тестированию и криоконсервировали в отваре для инфузии сердца мозга (BHI) с ДМСО (8% v/v) в качестве криопротекторного средства.

1. Реактивация замороженной культуры E. coli ACM5

  1. Из замороженного бактериального бульона откройте трубку и используйте стерильную петлю, кончик пипетки или зубочистку, чтобы соскоблить поверхность замороженной бактериальной культуры.
  2. Нанесите бактерии на агаровую пластину Luria-Bertani (LB) и инкубируйте при 37 ± 2 °C в течение 24 ч.

2. Определение антибактериальной восприимчивости

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанное здесь тестирование чувствительности к противомикробным препаратам соответствует методу диффузии диска, основанному на руководящих принципах Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI) (M02 Ed13: 2018)31. Кишечная палочка Штамм ATCC 25922 необходим для контроля качества.

  1. Приготовление инокулята методом колониальной суспензии
    1. Из пластины LB, инкубированной на стадии 1.2, проведите одну или две колонии на агаровую пластину Мюллера-Хинтона (MH) и инкубируйте при 37 ± 2 °C в течение 18-24 ч.
    2. Используйте стерильную петлю, чтобы выбрать две или три колонии из свежевыращенного изолята E. coli на агаровой пластине MH и повторно суспендировать их в 3 мл стерильного бульона MH или 0,85% (мас./об.) физиологического раствора, тщательно перемешивая путем вихря для получения однородной бактериальной суспензии.
    3. Используя УФ-видимый спектрофотометр (см. Таблицу материалов), отрегулируйте бактериальную суспензию до мутности, сопоставимой со стандартом 0,5 Макфарланда (что эквивалентно примерно 1-2 х 108 клеток / мл). Если бактериальная суспензия слишком легкая или слишком тяжелая, добавьте больше колоний E. coli или бульона MH в зависимости от обстоятельств. Используйте приготовленный инокулятор в течение 15 мин после приготовления.
  2. Инокуляция тестовых агаровых пластин
    1. Окуните стерильный ватный тампон в скорректированную бактериальную суспензию. Поверните тампон несколько раз и плотно прижмите его к внутренней стенке трубки, чтобы удалить лишнюю жидкость из тампона.
    2. Инокулируйте агаровую пластину MH, распределив тампон 3x по всей поверхности агара, каждый раз поворачивая пластину на 60°. Смажьте также ободок агара, чтобы обеспечить равномерное распределение инокулята.
    3. Оставьте крышку чашки Петри открытой на 3-5 минут, чтобы влага испарилась.
  3. Нанесение антимикробного диска на инокулированные агаровые пластины
    1. Равномерно распределите и прижмите каждый антимикробный диск (см. Таблицу материалов) к поверхности привитых агаровых пластин, чтобы обеспечить полный контакт. Инвертировать пластины в течение 15 мин после нанесения на диск и инкубировать при 35 ± 2 °C в течение 16-18 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум 12 и шесть дисков должны использоваться в чашках Петри диаметром 150 мм и 100 мм соответственно.
  4. После инкубации измерьте зону размеров ингибирования с помощью суппорта Вернье и интерпретируйте полученные диаметры в соответствии с критериями точки останова CLSI (M100 - таблица 2A)32.

3. Экстракция и количественная оценка геномной ДНК (гДНК)

  1. Геномная экстракция ДНК
    1. Повторно суспендировать петлю свежевыращенных колоний кишечной палочки в 5 мл бульона LB и инкубировать в течение ночи в встряхивающем инкубаторе (180 об/мин) при 37 ± 2 °C.
    2. Центрифугируйте бактериальную суспензию при 3 500 х г в течение 5 мин и осторожно выбросьте супернатант.
    3. Экстрагируйте гДНК в соответствии с рекомендациями по набору для экстракции ДНК (см. Таблицу материалов).
    4. Проверьте чистоту гДНК, измерив оптическую плотность при 260/280 нм (соотношение: >1,8) и 260/230 нм (отношение: 2,0-2,2) с помощью УФ-видимого спектрофотометра. Выполните электрофорез 0,8% агарозного геля для проверки целостности гДНК.
  2. Количественная оценка геномной ДНК
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только тонкостенные прозрачные ПЦР-трубки объемом 0,5 мл, одобренные производителем флуоресцентного набора для анализа (см. Таблицу материалов).
    1. Установите необходимое количество пробирок для образцов и стандартов анализа. Подготовьте рабочий раствор для анализа, смешивая компонент А и компонент В, поставляемые в комплекте, следуя рекомендациям производителя.
    2. Подготовьте стандарты анализа, добавив 190 мкл рабочего раствора и 10 мкл каждого стандарта в соответствующую трубку (требуется два стандарта).
    3. Добавьте 198 мкл рабочего раствора и 2 мкл образца ДНК в соответствующую пробирку. Энергично перемешайте, вихря все трубки в течение 5 с. Будьте осторожны, чтобы не создавать пузырьки.
    4. Инкубировать все трубки в течение 2 мин при комнатной температуре, защищенной от света. Измерьте флуоресценцию всех трубок на основе рекомендаций производителя с помощью флуорометра (см. Таблицу материалов).
    5. Правильно отрегулируйте концентрацию образца гДНК для продолжения секвенирования.

4. Подготовка библиотеки ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка и секвенирование библиотеки ДНК осуществлялись в соответствии с руководящими принципами и протоколами производителя (см. Таблицу материалов). Начальная концентрация гДНК составляет 4,0 нг.

  1. Маркировка, ПЦР-амплификация и индексация
    1. В пробирку объемом 0,2 мл добавьте 2,5 мкл буфера тегментации и 2 мкл входной гДНК (2,0 нг/мкл). Аккуратно перемешайте путем пипетки.
    2. Добавьте 1 мкл буфера амплификации и аккуратно перемешайте путем пипетирования. Открутите при 280 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите образцы в термоциклер (см. Таблицу материалов) и запустите следующую программу ПЦР: 55 °C в течение 5 мин, затем подержите при 10 °C. Когда образцы достигнут 10 °C, немедленно приступайте к нейтрализации реакции.
    4. Добавьте 1 мкл нейтрализующего буфера в пробирки для образцов и аккуратно перемешайте путем пипетки. Открутите при 280 х г в течение 1 мин и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
    5. Добавьте 1,7 мкл каждого индексного адаптера (т.е. индексов i7 и i5) и 3 мкл индексирующей основной смеси ПЦР. Аккуратно перемешайте путем пипетки. Открутите при 280 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    6. Поместите образцы в термоциклер и выполните вторую реакцию ПЦР следующим образом: 72 °C в течение 3 мин, 95 °C в течение 30 с, 18 циклов 95 °C в течение 10 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 5 мин и держите при 10 °C.
  2. Усиленная очистка библиотеки
    1. Смешивание путем вихря коммерческого раствора магнитных шариков (см. Таблицу материалов) на основе рекомендаций производителя.
    2. Перенесите маркированный/индексированный образец гДНК в новую пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 0,6 мкл магнитных шариков на каждый мкл конечного объема образца гДНК (≈13 мкл). Аккуратно перемешайте путем пипетки и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Поместите пробоины на магнитную стойку (см. Таблицу материалов) на 2 мин до очистки супернатанта. Аккуратно удалите и выбросьте супернатант, не потревожив бусины.
    4. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола без смешивания. Насиживайте в течение 30 с, пока элюат не очистится, аккуратно удалите и выбросьте супернатант, не нарушая бусины.
    5. Выполните второй шаг стирки. Добавьте 200 мкл 80% этанола в шарики и инкубируйте в течение 30 с. После того, как элюат очистится, удалите и выбросьте супернатант и высушите бусины на воздухе в течение 10 минут.
    6. Добавьте к шарикам 15 мкл 10 мМ трис-буфера (рН 8) и аккуратно перемешайте путем пипетки. Инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре. Снова поместите пробирки для образцов на магнитную стойку на 2 мин, чтобы супернатант очистился.
    7. Осторожно перенесите 14 мкл супернатанта из пробирки в новую пробирку объемом 0,2 мл. Это очищенная библиотека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе очищенная библиотека может храниться при -20 °C в течение 7 дней.
  3. Нормализация библиотек
    1. Приступайте к количественной оценке очищенных библиотек с помощью флуоресцентного анализа, как описано на этапе 3.2, за исключением этапа 3.2.5.
    2. Визуализируйте очищенные библиотеки на электрофорезе 1% агарозного геля для определения средних размеров фрагментов.
    3. Вычислите значение молярности библиотеки, используя следующее уравнение:
      Equation 1
    4. Используя значение молярности, рассчитайте соответствующие объемы буфера повторного суспензии (RSB) и очищенных библиотек для разбавления отдельной библиотеки при начальной концентрации 10 нМ.

5. Объединение библиотек, денатурализация и инициализация секвенсора

  1. Разморозьте картридж с реагентами в соответствии с указаниями производителя. Извлеките проточную ячейку из холодильника (4 °C) и доведите ее до комнатной температуры перед секвенированием.
  2. Пул 5 мкл каждой нормализованной библиотеки (10 нМ) в трубку с низким связыванием 1,5 мл. Разбавьте объединенную библиотеку на 4 нМ с соответствующим объемом RSB.
  3. Добавьте 5 мкл объединенной библиотеки (4 нМ) и 5 мкл 0,2 Н NaOH в новую трубку с низким связыванием 1,5 мл. Кратковременно перемешайте путем вихря, открутите при 280 х г в течение 1 мин и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать объединенную библиотеку на отдельные нити.
  4. Аккуратно смешайте 10 мкл денатурированной объединенной библиотеки и 990 мкл предварительно охлажденного гибридизационного буфера путем пипетирования и поместите на лед до тех пор, пока не будет выполнено окончательное разбавление для загрузки секвенсора. Концентрация денатурированной объединенной библиотеки составляет 20 пМ.
  5. Разморозить и подготовить контрольную библиотеку (см. Таблицу материалов) в концентрации 4 нМ путем смешивания 2 мкл контрольной библиотеки (10 нМ) и 3 мкл безнуклеазной воды.
  6. Смешайте 5 мкл контрольной библиотеки (4 нМ) и 5 мкл свежеприготовленного 0,2 Н NaOH. Кратковременно перемешайте путем вихря, открутите при 280 х г в течение 1 мин и инкубируйте в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать контрольную библиотеку на отдельные нити.
  7. Аккуратно смешайте 10 мкл денатурированной контрольной библиотеки и 990 мкл предварительно охлажденного буфера гибридизации путем пипетирования и поместите на лед до окончательного разбавления для загрузки секвенсора. Концентрация денатурированной контрольной библиотеки составляет 20 пМ.
  8. В новой трубке с низким уровнем связывания 1,5 мл объедините 594 мкл денатурированной объединенной библиотеки при 20 пМ и 6 мкл денатурированной контрольной библиотеки при 20 пМ. Правильно перемешать.
  9. Разбавляют конечную библиотечную смесь (20 пМ) до конечной нагрузочной концентрации 1,2 пМ в объеме 600 мкл с помощью предварительно охлажденного буфера гибридизации.
  10. Перед загрузкой окончательной библиотечной смеси на картридж с реагентами выполните дополнительную термическую предварительную обработку для достижения эффективной загрузки в проточную ячейку. Инкубируйте окончательную библиотечную смесь в течение 2 мин при 96 °C. Переверните трубку, чтобы перемешать, и поместите трубку на лед на 5 минут.
  11. Загрузите 500 мкл конечной библиотечной смеси в проектируемый резервуар на реагентном картридже. Инициируйте виртуализацию в соответствии с рекомендациями. Загрузите проточную ячейку и картридж реагента и настройте цикл последовательности.

6. Анализ данных последовательности

ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте Дополнительный файл 1 для дальнейшего описания общей предварительной обработки данных WGS, программного обеспечения, настроек параметров и анализа последовательностей генома E. coli .

  1. Подключитесь к серверу данных виртуализации и загрузите файлы FASTQ.
  2. Оцените исходное качество необработанных данных последовательностей с помощью стороннего программного обеспечения. Удалите остаточные последовательности адаптеров, низкокачественные базы (Дополнительный файл 1).
  3. Соберите данные секвенирования, проверенные на качество, на смежный уровень или на уровне шаблона с помощью стороннего программного обеспечения (см. Дополнительный файл 1).
  4. Выполните аннотацию генома, отправив файл FASTA, содержащий собранный геном, на сервер RAST (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Загрузите файл FASTA в веб-платформы Центра геномной эпидемиологии (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) и ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) для идентификации эпидемиологических особенностей, ARG, VAG и плазмид (см. Дополнительный файл 1).
  6. Загрузите файл FASTA на сервер PHASTER для идентификации последовательностей профагов (https://phaster.ca/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Антимикробную восприимчивость определяли методом дисковой диффузии и интерпретировали по критериям точки разрыва CLSI для 12 антибиотиков, охватывающих шесть различных классов противомикробных препаратов, то есть аминогликозиды, β-лактамы, фторхинолоны, нитрофураны, фениколы и антагонисты фолатных путей. E. coli ACM5 проявлял чувствительность ко всем антибиотикам, за исключением одного β-лактамного препарата. Были протестированы четыре β-лактамных препарата: ампициллин, карбенициллин, цефалотин и цефотаксим. Среди них был измерен гало ингибирования 14 мм для ампициллина. Таким образом, согласно интерпретационным категориям CLSI для ампициллина (восприимчивый: ≥17 мм; промежуточный: 14-16 мм; резистентный: ≤13 мм) 32, E. coli ACM5 показывает промежуточную восприимчивость к ампициллину.

E. coli ACM5 подвергался WGS с использованием настольного секвенсора. Поэтому образец ДНК был подготовлен, мультиплексирован и секвенирован в соответствии с описанным протоколом. В целом, последовательный запуск, проведенный с конфигурацией среднего выхода, дал 3,37 Гб данных с частотой ошибок 0,73%, а 89,71% баз набрали качество выше Q3033. В частности, секвенирование E. coli ACM5 произвело в общей сложности 1 490 594 парных конечных (PE) считывания. Необработанные данные о последовательностях этого исследования были депонированы в базе данных архива последовательностей (SRA) в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) под номером BioProject PRJNA715781.

После первоначальной проверки качества и фильтрации 96,8% показаний были сохранены из необработанных данных секвенирования и собраны в строительные леса с глубиной покрытия 38x. Сборка генома на уровне каркаса генерировала 83 каркаса (>300 bp), длиной 5 272 433 bp и содержанием GC 50,61%. Аннотация генома выявила 5 633 закодированных признака, из которых 5 524 являются генами, кодирующими белки (CDS), а 109 - последовательностями, связанными с РНК (рисунок 1). Кроме того, аннотация генома группировала CDS в коллекции функционально связанных белков, называемых подсистемами, особенно тех, которые играют функциональную роль в углеводах, белках, аминокислотах и производных метаболизме, а также мембранном транспорте (рисунок 2).

Типирование in silico предсказало E. coli ACM5 как O-нетипируемый (ONT) штамм, назначенный серотипу ONT: H21. Кроме того, было показано, что он принадлежит к филогруппе B1 и типу последовательности (ST) 40. Был идентифицирован один приобретенный детерминант устойчивости к противомикробным препаратам, кодирующий мультилекарственный эффлюксный насос широкого спектра действия, то есть ген mdf(A) (рисунок 1).

Что касается признаков вирулентности, несколько VAG, представленных в исследуемом геноме E. coli , включая гены, кодирующие термостабильный энтеротоксин (astA), белок сывороточной резистентности (iss) и систему секреции типа III (T3SS) вместе с его секретируемыми эффекторными белками (рисунок 1). Пучкообразующий пили (BFP) оперон и кластер генов perABC не были доказаны. Следовательно, согласно предсказанному профилю вирулентности, E. coli ACM5 был отнесен к патотипу aEPEC.

Анализ WGS также выявил две предполагаемые крупные плазмиды, принадлежащие к различным группам несовместимости (Inc) в геноме E. coli (т.е. группам плазмид IncF и IncI). Однако обоим не хватало ARG и VAG. Кроме того, было выявлено 18 областей, связанных с профагом; однако, в отличие от плазмид, они содержат VAG, включая ген ISS , оперон sitABCD , кодирующий транспортер железа / марганца, и несколько эффекторных белков T3SS (рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Круговая карта проекта генома E. coli ACM5. Данные от самых внешних до самых внутренних кругов объявляются и окрашиваются следующим образом. Круг 1: Шкала размера генома в парах оснований. Круги 2 и 3: Аннотированные CDS, транскрибированные на передней (синей) и обратной (красной) нити ДНК соответственно. Круги 4 и 5: рибосомные РНК (черные) и трансферные РНК (зеленые) соответственно. Круг 6: 83 каркаса чернового генома (серый). Круг 7: Аннотированные признаки: детерминанты устойчивости к противомикробным препаратам (красный), гены, ассоциированные с вирулентностью (фиолетовый) и области профагов (аква). Круг 8: %содержание GC (черный). Круг 9: Перекос GC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подсистемное распределение штамма aEPEC ACM5. Анализ основан на аннотации RAST SEED. Круговая диаграмма организует подсистемы по клеточному процессу, а кодирующие белок гены, участвующие в соответствующем клеточном процессе, указаны в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1. Описание предварительной обработки данных WGS, программного обеспечения, настроек параметров и анализа последовательностей генома E. coli ACM5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании представлена адаптация рабочего процесса бактериальной WGS с использованием настольного секвенсора и конвейера для геномной характеристики патогенного варианта E. coli . В зависимости от используемой платформы секвенирования время выполнения (TATs) для влажных лабораторных процедур (культивирование бактерий, экстракция гДНК, подготовка библиотеки и секвенирование) и анализа последовательностей может варьироваться, особенно если изучаются медленно растущие бактерии. Следуя протоколу для WGS, описанному выше, ТАТ был в течение 4 дней, что сопоставимо с тем, что в настоящее время говорится в литературе (<5 дней) 34.

Теоретическая глубина охвата секвенирования генома E. coli ACM5 была рассчитана на уровне 30x. Тем не менее, секвенирование дало эмпирические данные для сборки генома на глубине 38x. Как было рекомендовано ранее35, этого было достаточно, чтобы получить представление всего генома и продолжить анализ данных относительно устойчивости к противомикробным препаратам, вирулентности и мобиломных особенностей E. coli ACM5. В отношении устойчивости к противомикробным препаратам исследовались только приобретенные детерминанты. Кишечная палочка ACM5 является ампициллин-устойчивым изолятом, но наблюдался только ген мультилекарственного эффлюксного насоса MdfA, кодирующий. Однако это не дает устойчивости к β-лактамам36, и не было выявлено никакого другого приобретенного детерминанта, участвующего в резистентности к β-лактам. Следовательно, вполне вероятно, что комбинация других молекулярных механизмов, таких как снижение проницаемости клеточных мембран и повышенная экспрессия различных насосных систем эффлюкса, лежит в основе наблюдаемого сопротивления ампициллина37.

Что касается признаков вирулентности, единственное присутствие гена, кодирующего интимин (eae), является отличительным генетическим маркером штаммов aEPEC. Патотип aEPEC представляет собой подмножество кишечного патогенного штамма E. coli, несущего локус острова патогенности энтероцитарного стирания (LEE), где кодируются T3SS и связанные с ним эффекторные / транслокаторные белки, включая Cif, EspA / B / D, EspF, intimin и транслоцированный рецептор интимина (Tir). Взаимодействие между T3SS и его эффекторами непосредственно связано со способностью способствовать прикреплению и стиранию (A / E) поражений на эпителиальных клетках кишечника типичными энтеропатогенными E. coli (EPEC) и EHEC, оба патотипа, известные как возбудители болезней пищевого происхождения человека17,19. Ген astA кодирует термостойкий энтеротоксин под названием EAST1, и хотя он был впервые признан и связан со штаммами ЕАЭС, токсин EAST1 широко распространен среди патотипов E. coli 38. Здесь WGS продемонстрировала, что E. coli ACM5 обладает геном astA, и, несмотря на то, что изоляты E. coli, продуцирующие EAST1, были связаны с диарейными заболеваниями у людей и животных, его патогенная роль в возникновении диареи остается спорной39.

Следует признать ключевое ограничение такого методологического подхода; первоначальная сборка на уровне контига привела к фрагментированному проекту генома и, следовательно, была подвергнута дальнейшему формированию лесов против более близкого эталонного генома. Реализованная конфигурация длины чтения секвенирования (2 x 150 bp) и наличие обширных, повторяющихся элементов по всему геному E. coli являются наиболее вероятными объяснениями фрагментированной сборки контиг-уровня. Наборы данных с коротким чтением не могут правильно разрешать и, следовательно, реконструировать большие повторяющиеся элементы, вызывая потенциальные ошибки сборки и несколько точек останова в процессе сборки. Следовательно, внедрение технологий длительного секвенирования поможет преодолеть эти ограничения и получить закрытые геномы40.

В рамках протокола WGS необходимо рассмотреть несколько важнейших этапов. Высококачественная гДНК является первой контрольной точкой, необходимой для обеспечения высококачественной последовательности данных. Во-вторых, при подготовке библиотеки необходимо проявлять особую осторожность в процессе маркировки, особенно при обработке нескольких образцов и добавлении индексных праймеров, чтобы избежать перекрестного загрязнения, и при контроле времени инкубации, чтобы правильно фрагментировать образцы ДНК. Кроме того, шаги количественной оценки и нормализации необходимы для устранения любых предубеждений, которые библиотеки ДНК могут внести в окончательные данные секвенирования, поскольку неправильное эквимолярное соотношение в объединенной библиотеке может способствовать существенно неравному распределению числа считываний на выборку. Метод, представленный здесь, прост и представляет собой экономически эффективную альтернативу, главным образом, для оптимального использования реагентов, содержащихся в наборах для подготовки библиотеки ДНК. Протокол для WGS, описанный выше, был применен не только к секвенированию генома E. coli , но и к другим несвязанным видам бактерий, таким как Vibrio parahaemolyticus41. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (ФАО) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), методологии NGS могут играть определяющую роль в безопасности пищевых продуктов, обеспечивая быструю идентификацию и характеристику микроорганизмов и устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) с точностью, которая ранее была невозможна42. Таким образом, эти методологии представляют собой инструмент для эпиднадзора и отслеживания источников патогенов не только в клиническом контексте, но и в оценке риска патогенов пищевого происхождения, раскрывая понимание экологических и физиологических свойств этих микроорганизмов43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Национальному совету по науке и технике Мексики (CONACyT по его аббревиатуре на испанском языке) за докторскую стипендию, присужденную Хосе Антонио Маганья-Лисарраге [No 481143].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accublock Mini digital dry bath Labnet D0100 Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63881 Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11 DeNovix Inc. UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes Eppendorf 0030108418 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet Invitrogen, Thermo Fisher Scientific 12321D Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D. Diagnostic reseach (Mexico) PT-35 Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) Illumina FC-420-1004 Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2x150)
MiniSeq System Instrument Illumina SY-420-1001 Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge Eppendorf 5452000816 Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1024 Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2 Illumina FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 Index set A, B, C, D
PhiX Control v3 Illumina FC-110-3001 DNA library control for sequencing
Precision waterbath LabCare America 51221081 Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q33231 Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32866 Fluorometer used for fluorescence assay 
Qubit Assay tubes Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Q32856 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay 
SimpliAmp Thermal Cycler Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific A24811 Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis Thermo 335900 Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit Zymo Research Inc. D4300 Kit for genomic DNA extraction (50 preps)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Tags

Генетика выпуск 190 секвенирование всего генома Escherichia coli aEPEC устойчивость к противомикробным препаратам аквакультура Oreochromis spp.

Erratum

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 02/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Характеристика патогенного <em>штамма Escherichia coli</em> , полученного из <em>Oreochromis</em> spp. Фермы с использованием секвенирования всего генома
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Magaña-Lizárraga, J. A.,… More

Magaña-Lizárraga, J. A., Gómez-Gil, B., Enciso-Ibarra, J., Báez-Flores, M. E. Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. J. Vis. Exp. (190), e64404, doi:10.3791/64404 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter