Summary
For rationelt at designe effektive adjuvanser udviklede vi poly-mælkesyre-co-glykolsyre-nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE). PNPE havde unik blødhed og en hydrofob grænseflade til potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med højt indhold, hvilket forbedrede leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpræsenterende celler og inducerede effektiv internalisering af antigener.
Abstract
Den cellulære affinitet af mikro- / nanopartikler er forudsætningen for cellulær genkendelse, cellulær optagelse og aktivering, som er afgørende for lægemiddelafgivelse og immunrespons. Den nuværende undersøgelse stammer fra den observation, at virkningerne af ladning, størrelse og form af faste partikler på celleaffinitet normalt overvejes, men vi indser sjældent den væsentlige rolle, som blødhed, dynamisk omstruktureringsfænomen og kompleks grænsefladeinteraktion spiller i cellulær affinitet. Her udviklede vi poly-mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA) nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE), der overvandt manglerne ved stive former og simulerede patogenernes fleksibilitet og fluiditet. En metode blev oprettet for at teste affiniteten af PNPE til celleoverflader og uddybe den efterfølgende internalisering af immunceller. Finiteten af PNPE til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er) - erstatningen for knoglemarvsdendritiske celler (BMDC'er) - blev bestemt ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D), som muliggjorde realtidsovervågning af celleemulsionsadhæsion. Efterfølgende blev PNPE brugt til at levere antigenet (ovalbumin, OVA), og optagelsen af antigenerne af BMDC'er blev observeret ved anvendelse af konfokal laserscanningsmikroskop (CLSM). Repræsentative resultater viste, at PNPE straks reducerede frekvensen (ΔF), når den stødte på bEV'erne, hvilket indikerer hurtig vedhæftning og høj affinitet af PNPE til BMDC'erne. PNPE viste signifikant stærkere binding til cellemembranen end PLGA-mikropartikler (PMP'er) og AddaVax-adjuvans (betegnet som overfladeaktivt stabiliseret nanoemulsion [SSE]). På grund af den forbedrede cellulære affinitet til immunocytterne gennem dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner blev antigenoptagelsen efterfølgende øget sammenlignet med PMP'er og SSE. Denne protokol giver indsigt i design af nye formuleringer med høj celleaffinitet og effektiv antigeninternalisering, hvilket giver en platform for udvikling af effektive vacciner.
Introduction
For at bekæmpe epidemiske, kroniske og smitsomme sygdomme er det bydende nødvendigt at udvikle effektive adjuvanser til profylaktiske og terapeutiske vaccinationer 1,2. Ideelt set bør adjuvanserne have fremragende sikkerhed og immunaktivering 3,4,5. Effektiv optagelse og proces af antigener af antigenpræsenterende celler (APC'er) menes at være et væsentligt stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering af immunresponset 6,7,8. Derfor er det effektive strategier til at forbedre effektiviteten af vacciner at få en klar forståelse af mekanismen for interaktion mellem immunceller og antigener og designe adjuvanser til at forbedre internaliseringen.
Mikro-/nanopartikler med unikke egenskaber er tidligere blevet undersøgt som antigenafgivelsessystemer til at formidle den cellulære optagelse af antigener og den cellulære interaktion med patogenassocierede molekylære mønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynder leveringssystemer at interagere med den ekstracellulære matrix og cellemembran, hvilket førte til internalisering og efterfølgende cellulære reaktioner11,12. Tidligere undersøgelser har vist, at internalisering af partikler finder sted gennem cellemembran-partikeladhæsion13, efterfulgt af fleksibel deformation af cellemembranen og diffusion af receptoren til overflademembranen14,15. Under disse omstændigheder afhænger leveringssystemets egenskaber af tilhørsforholdet til APC, som efterfølgende påvirker optagelsesmængden16,17.
For at få indsigt i designet af leveringssystemet til forbedret immunrespons har omfattende bestræbelser været fokuseret på undersøgelsen af forholdet mellem partiklernes egenskaber og cellulær optagelse. Den foreliggende undersøgelse stammer fra den observation, at faste mikro-/nanopartikler med forskellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lys, mens fluiditetens rolle i antigeninternalisering sjældent undersøges18,19. Faktisk viste de bløde partikler under vedhæftning dynamiske krumningsændringer og laterale diffusioner for at øge kontaktområdet for multivalente interaktioner, som næppe kan replikeres af de faste partikler20,21. Derudover er cellemembraner phospholipid dobbeltlag (sphingolipider eller kolesterol) på optagelsesstedet, og hydrofobe stoffer kan ændre den konformationelle entropi af lipider, hvilket reducerer mængden af energi, der kræves til cellulær optagelse22,23. Således kan forstærkning af mobilitet og fremme af hydrofobicitet af leveringssystemet være en effektiv strategi til styrkelse af antigeninternalisering for at forbedre immunresponset.
Pickeringemulsion, stabiliseret af faste partikler samlet ved grænsefladen mellem to ublandbare væsker, er blevet anvendt i vid udstrækning i det biologiske felt24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partikler på olie/ vand-grænsefladen formuleringen af strukturer på flere niveauer, som fremmer multi-level leveringssystem-cellulære interaktioner og yderligere inducerer multifunktionelle fysiokemiske egenskaber i lægemiddelafgivelse. På grund af deres deformerbarhed og laterale mobilitet forventedes pickeringemulsioner at komme ind i multivalent cellulær interaktion med immunocytterne og blive genkendt af membranproteinerne26. Da olieholdige micellekerner i Pickering-emulsioner ikke er helt dækket af faste partikler, har Pickering-emulsioner desuden huller af forskellig størrelse mellem partikler på olie/vand-grænsefladen, hvilket forårsager højere hydrofobicitet. Det er således afgørende at undersøge affiniteten af Pickering-emulsioner til APC'er og uddybe den efterfølgende internalisering for at udvikle effektive adjuvanser.
Baseret på disse overvejelser konstruerede vi en PLGA nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion (PNPE) som et fluiditetsvaccineleveringssystem, der også hjalp med at få værdifuld indsigt i PNPE's affinitet til BMDC'er og cellulær internalisering. Realtidsadhæsionen af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er; en erstatning af BMDC'er) til PNPE blev overvåget via en etiketfri metode ved hjælp af en kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D). Efter karakterisering af PNPE's affinitet til BMDC'er blev konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) brugt til at bestemme antigenoptagelsen. Resultatet indikerede den højere affinitet af PNPE til BMDC'er og den effektive internalisering af antigenet. Vi forventede, at PNPE ville udvise højere affinitet til APC'er, hvilket bedre kan stimulere internaliseringen af antigener for at forbedre immunresponserne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet i denne protokol er godkendt af Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences. Alle dyreforsøg blev udført i nøje overensstemmelse med reglerne for pleje og brug af forsøgsdyr og retningslinjer for etisk gennemgang af dyr (Kina, GB / T35892-2018).
1. Forberedelse og karakterisering af PLGA nanopartikler
- Fremstilling af PLGA nanopartikler (PNP'er)
- Der tilsættes 0,5 g polyvinylalkohol (PVA) til 120 ml deioniseret vand ved 90 °C og omrøres, indtil det er helt opløst, for at forberede PVA-opløsningen. Opløsningen opbevares i køleskabet (4 °C) efter afkøling til stuetemperatur.
- Tilsæt 100 mg PLGA til 10 ml acetone og ethanolblanding (forholdet 4: 1) for at tjene som oliefase.
- Anbring 20 ml PVA vandig opløsning under røghætten og omrør magnetisk ved 400 o / min. Tilsæt 5 ml oliefase i PVA-opløsningen dråbe for dråbe ved hjælp af en sprøjtepumpe. Rør derefter blandingen i røghætten, indtil de organiske opløsningsmidler fordamper fuldstændigt.
BEMÆRK: Med stigningen i koncentrationen af partiklerne i oliefasen bliver vandfaseopløsningen gradvist til en klar og gennemsigtig lys blålig-hvid eller mælkehvid. - Efter fordampning af organiske opløsningsmidler (2-3 timer) centrifugeres blandingen ved 15.000 x g. Vask tre eller flere gange, indtil det endelige vaskevand er klart og gennemsigtigt.
BEMÆRK: Formålet med dette trin er hovedsageligt at vaske den resterende PVA af på partikeloverfladen for at forhindre, at den påvirker Pickering-emulsionspræparatet. - Suspenderede de vaskede PNP'er igen i 2 ml deioniseret vand og frys blandingen ved -80 °C i 24 timer. Frys-tør derefter partiklerne i en frysemiddel i 48-72 timer. De forberedte PNP'er er hvide flokke.
- Karakterisering af PNP'er
- For at karakterisere størrelsen og zetapotentialet for PNP'er tilsættes 10 μL PNP'er i 1 ml deioniseret vand for at opnå fortyndingsopløsning og overføre fortyndingsopløsningen til en DTS1070-celle. Tænd for computeren og dls (dynamic light scattering analyzer), og placer derefter DTS1070-cellen i DLS-systemet.
- Klik på Zeta Size Software og opret en ny målefil for at oprette bestemmelsesproceduren. Start derefter bestemmelsesproceduren for at opnå partikelstørrelsen og zeta-potentialefordelingen.
- For at observere PNPs-morfologien fordeles 0,1 ml PNPs-opløsningen jævnt (fortyndet 40 gange) på et 5 cm x 5 cm stanniolark og lad vandet fordampe naturligt i en godt ventileret røghætte natten over.
- Skær en lille del af stanniol ud og fastgør den på prøvebordet med ledende tape. Sprøjt det med guld ved en strøm på 10 mA i 120 s. Derefter observeres prøvens overflademorfologi ved hjælp af scanningselektronmikroskopi (SEM).
2. Forberedelse og karakterisering af PNPE
- For at forberede PNPE tilsættes frysetørrede PNP'er til deioniseret vand i en koncentration på 4 mg / ml (den vandige fase) og tilsættes derefter squalen som oliefasen. Forbered PNPE via et-trins sonikering i 5 minutter ved 100 W i en vandbad sonikator. Olie-vand-faseforholdet er 1:9.
- Karakterisering af den forberedte PNPE
- Åbn Mastersizer 2000-softwaren og laseren i rækkefølge. Klik på Mål for at åbne det forudindstillede program og indstille eksempelnavnet. Klik på Start for at begynde at måle baggrunden for prøven, og tilføj derefter 1 ml PNPE ved hjælp af en dråber til prøvetanken på laserpartikelstørrelsesanalysatoren for at måle emulsionens partikelstørrelse tre gange parallelt.
- Fortynd 20 μL PNPE i 1 ml deioniseret vand. Slip 20 μL af emulsionen på diaset. Overhold emulsionens morfologi og homogenitet ved hjælp af optisk mikroskopi ved 40x forstørrelse og få fotografier.
- Effektivitet ved indlæsning af antigen
- Opløs 200 μg ovalbumin (OVA) i 500 ml deioniseret vand. Bland det derefter med 500 ml forberedt PNPE og ryst i 1 time ved stuetemperatur. Det flydende antigen fjernes ved centrifugering ved 5000 x g i 20 min.
- Bestem de flydende antigenkoncentrationer ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA) assays27. Formlen til beregning af antigenbelastningseffektiviteten er som følger:
Effektivitet ved indlæsning af antigen =
Brug den samme metode til at bestemme antigenbelastningseffektiviteten for den SSE, der bruges som kontrolgruppe.
- Stabilitet af PNPE
- 6 ml af den tilberedte PNPE opdeles i seks lige store portioner, og der opbevares tre dele hver ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Fortynd 20 μL lagret PNPE i 1 ml deioniseret vand (1:50) på dag 0, 3 og 6. Mål derefter størrelsen og zetapotentialet af PNPE-lageropløsningerne, der opbevares ved forskellige temperaturer.
BEMÆRK: De forskellige opbevaringstemperaturer er indstillet til at sammenligne effekten af forskellige temperaturer på stabiliteten af PNPE, hvilket kan optimere opbevaringsforholdene for høj stabilitet og lang holdbarhed.
- 6 ml af den tilberedte PNPE opdeles i seks lige store portioner, og der opbevares tre dele hver ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Fortynd 20 μL lagret PNPE i 1 ml deioniseret vand (1:50) på dag 0, 3 og 6. Mål derefter størrelsen og zetapotentialet af PNPE-lageropløsningerne, der opbevares ved forskellige temperaturer.
- Fremstilling af PLGA-mikropartikler (PMP'er)
- Opløs 500 mg PLGA i 5 ml dichlormethan som oliefase, og hæld derefter i 50 ml ekstern vandig fase indeholdende 1,5% PVA for at opnå olie/vand-blandingen. Homogeniser blandingen ved 3000 o / min i 1 minut ved hjælp af en homogenisator for at opnå grove emulsioner.
- Oprethold ensartetheden af PLGA-partikelstørrelse af mikrosfærer (bestemt af grovemulsioner) ved membranemulgering. Installer en 5,2 μm membran i membranrøret. Juster trykket til 800 kPa og hold det stabilt.
- Åbn udstødningsventilen og fødeventilen, og efter tilsætning af grovemulsionerne til prøvetanken skal du lukke udstødningsventilen og fødeventilen, åbne udløbsventilen og indløbsventilen og tage efterfilmemulsionen i et 200 ml bægerglas. Gentag processen tre gange for at opnå præ-dobbelt emulsioner.
- Rør præ-dobbeltemulsionerne for at fordampe dichlormethan ved stuetemperatur for at helbrede mikrosfærerne. Mikrosfærerne vaskes med deioniseret vand ved 7741 x g i 3 minutter fem gange. Forfrys i en fryser ved -80 °C og til sidst frysetørres for at få tørrede mikrosfærer.
- Karakterisering af PMP'er
- Åbn Mastersizer 2000-softwaren og laseren i rækkefølge. Klik på Mål for at åbne det forudindstillede program og indstille eksempelnavnet. Klik på Start for at begynde at måle baggrunden for prøven. Derefter tilsættes 1 ml PMP'er til prøven og tilføjer tanken til laserpartikelstørrelsesanalysatoren med en dråber og måler mikropartiklernes partikelstørrelse tre gange parallelt.
- Analyse af blødhed
BEMÆRK: PNPE blev belagt på SiO2-sensoren for at måle blødheden.- Rengør SiO 2 kvartssensorchippen ved UV-ozonbehandling i 10 minutter, skyl to gange med 5 ml ethanol (75% v/v), og tør med N2. Installer den tomme SiO2 kvartssensorchip i flowcellen.
- Tænd for computeren, og aktiver temperaturreguleringen nederst til højre i softwaren for at sikre, at den indstillede temperatur er ca. 1 °C under stuetemperatur.
- Klik på knappen Anskaffelse i værktøjslinjen, og vælg Opsætningsmåling for at søge efter chippens 1, 3, 5, 7, 9 og 11 oktaver i den anvendte kanal. Klik på knappen Anskaffelse på værktøjslinjen, og vælg Start måling.
- Ret den oprindelige plan med luft, og når den oprindelige plan er afbalanceret, skal du vælge Stop og gemme filen som en tom fil.
- Rengør chippen og centrifugering 10 μg/ml PNPE på chippen. Tænd kort spin coateren og indstil driftsparameteren. Tilslut N2-røret til spincoateren, juster fraktioneringen af gascylinderen til 0,4 kPa, og læg den rene chip på spincoaterens sugekop. Tilsæt 100 μL PNPE dråbevis til midten af SiO2-sensoren , og luk topdækslet på spincoateren for at fuldføre belægningen.
- Installer den PNPE-belagte chip i flowcellen. Gentag trin 2.7.3-2.7.4, og gem filen som PNPE. Åbn både de tomme filer og PNPE-filerne, og klik på knappen Stitch for at få de relaterede data om spredning (ΔD).
3. Isoler og kultur BMDC'er 28
BEMÆRK: Sørg for, at alle reagenser og prøver placeres på is, da dette har en positiv effekt på celleaktiviteten. For at opretholde sterilitet skal du udføre alle trin på en ultraren bænk ved hjælp af sterile redskaber.
- Afliv C57BL/6 (hunmus, 6-8 uger gamle) via CO 2 -indånding og blød dem i ethanol 70% (v/v) til en kort sterilisering.
- Efter iblødsætning i 3-5 min, overfør musene til en super ren bænk. Fjern benmuskler ved hjælp af saks i rustfrit stål for at udsætte lårbenet og skinnebenet, og adskil derefter lårbenet og skinnebenet.
- Fyld en petriskål med 70% (v / v) ethanol og blød de rene knogler i den i 5-10 s for at fuldføre ekstern sterilisering. Rengør alle knoglerne og læg dem i et sterilt rør med is omkring dem.
- Trim lårbenet og skinnebenet tæt på leddet ved hjælp af en saks. Indsæt sprøjtenålen i knoglen for at skylle knoglemarven ud i et centrifugerør ved hjælp af forkølet RPMI-medium (1640).
- Skyl to eller tre gange, indtil knoglen er helt hvid. Pipetter knoglemarven flere gange for at adskille alle klumper. Filtrer cellerne i et 15 ml centrifugerør ved hjælp af en sigte med en diameter på 40 μm.
- Centrifuge ved 4 °C og 500 x g i 5 min. Kassér supernatanten og tilsæt 2 ml erythrocytlysat til sedimentet i 4 minutter.
- Efter vask to eller tre gange suspenderes cellerne igen i 2 ml komplet medium (1 % penicillin-streptomycin, 10 % føtalt bovint serum, 20 ng/ml IL-4 og 10 ng/ml GM-CSF). Derefter fortyndes 10 μL celler i 1 ml PBS, og chippen fra den håndholdte automatiserede celletæller indsættes i cellefortyndingen til celletælling. Endelig frøceller med en massefylde på 1 x 106 celler/ml i en 10 mm kulturskål med et komplet medium.
- Dyrkning af cellerne i en celleinkubator med 5 % CO2 ved 37 °C. Skift mediet hver 2. dag. På dag 7 overføres cellerne til 50 ml rør og centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter for at opsamle cellerne.
4. Fremstilling af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er)
- Saml mini-ekstruderen i rækkefølge i henhold til producentens anvisninger. Sørg for, at sprøjtehuset ikke er revnet, før du bruger det. Sørg for, at alle O-ringe er i god stand før hvert eksperiment, og udskift slidte eller beskadigede straks. Slidte eller beskadigede O-ringe kan forårsage pludselig trykudløsning, når ekstruderen betjenes.
- Aspirer BMDC'erne gentagne gange og overfør dem til et centrifugerør. Cellerne høstes ved centrifugering ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Tryk på cellesuspensionerne gennem 10 μm, 5 μm og 1 μm polycarbonatmembraner i 30 passager ved hjælp af mini-ekstruderen29.
BEMÆRK: For at muliggøre bEV-størrelse ensartethed blev BMDC-suspensionerne skubbet gennem 10 μm, 5 μm og 1 μm polycarbonatmembraner til 30 passager. Derudover skal du under drift sørge for at anvende kraft jævnt og opretholde kraftretningen langs sprøjtens akse. - Centrifuger de samlede supernatanter i 5 minutter ved 1000 x g og 4 °C for at fjerne cellerne. Supernatanten opsamles og centrifugerer den ved 3000 x g i 5 minutter ved 4 °C for at fjerne de resterende celler og cellerester.
- Supernatanten opsamles og centrifugerer den ved 100.000 x g i 90 minutter ved 4 °C. Kassér supernatant og suspender bEV'erne igen i 2 ml HEPES-bufferet saltvand (HBS). Rens bEV'erne via filtrering gennem en 0,45 μm membran, og opbevar de rensede bEV'er ved -80 °C.
5. bEV'er overholder PNPE
BEMÆRK: SiO2-sensoren blev modificeret via spin-coating-metoden.
- SiO2 sensor modificeret med poly-L-lysin (PLL).
- Rengør SiO 2 kvartssensorchippen ved hjælp af UV-ozonbehandling i 10 minutter, skyl to gange med ethanol og tør med N2.
- Tænd for spincoateren ved at trykke på tænd / sluk-knappen , tryk på kontrolknappen , og indstil belægningstid og hastighed. Den indledende rotationshastighed er 400 o / min, hvilket øges støt til 5000 o / min.
- Tilslut N2-røret til spincoateren, og juster fraktioneringen af gascylinderen til 0,4 kPa. Placer den rene chip på spincoaterens sugekop. Tilføj 100 μL PLL dråbevis til midten af SiO 2-sensoren, og luk topdækslet på spincoateren.
- Tryk på Start-knappen for at begynde at belægge prøven og stoppe maskinen, når den er færdig. Sluk for vakuumpumpen, sluk for tænd / sluk - og kontrolknapperne , og fjern den PLL-modificerede SiO2-sensor .
BEMÆRK: Før du trykker på Start, skal du sørge for, at belægningstiden og hastigheden er indstillet. Sørg desuden for, at SiO2-sensoren er placeret i midten af sugekoppen. Sørg for, at låget er lukket, før du kører processen for at forhindre ulykker.
- Bestemmelse af vedhæftning af bEV'er til PNPE
- Tænd for computeren, den elektroniske enhed, peristaltikpumpen, og aktiver temperaturreguleringen nederst til højre i softwaren for at sikre, at den indstillede temperatur er ca. 1 °C under stuetemperatur.
- Placer de PLL-modificerede SiO 2-sensorer i flowcellen i henhold til betjeningsvejledningen, og tilslut målelinjen mellem flowcellen og flowpumpen. Placer flowcellen inde i flowmodulsystemet, og skyl dem med ultrarent vand, inden eksperimenterne påbegyndes.
- Klik på værktøjslinjen Anskaffelse , og vælg Opsætningsmåling for at søge efter 1, 3, 5, 7, 9 og 11 oktaver af chippen i den anvendte kanal. For at rette grundlinjen skal du klikke på Start måling for at lade luft komme ind i flowmodulet, indtil luftbasislinjen er glat. Derefter strømmer deioniseret vand i 10-15 minutter for at muliggøre opløsningens basislinjeligevægt igen.
- Pump den forberedte PNPE-opløsning ind i flowmodulet med en strømningshastighed på 50 μL/min for at opnå ligevægtsadsorption på SiO2-sensoren .
BEMÆRK: ΔF ændres ikke længere, når PNPE pumpes ind i flowmodulet igen, hvilket indikerer, at overfladen på SiO 2-sensorerne er blevet helt dækket af PNPE. - Pump den forberedte bEV-opløsning ind i flowmodulet med en strømningshastighed på 50 μL/min for at spore processen med bEV-vedhæftning til PNPE-overfladen.
6. CLSM-analyse af antigenoptagelse
- Samkultur PNPE-OVA med BMDC'er
- Inkuber BMDC'erne med 1640 komplette medier (1% penicillin-streptomycin, 10% føtalt kvægserum, 20 ng / ml IL-4 og 10 ng / ml GM-CSF) i 7 dage, og så dem derefter i små konfokale laserskåle ved 1 x 106 pr. brønd natten over ved 37 ° C i en 5% CO2 -inkubator.
- Bland 0,5 ml Cy5-mærket OVA (400 μg/ml) med 0,5 ml PNPE i 1 time, og det flydende antigen fjernes ved centrifugering ved 5000 x g i 20 minutter for at udvikle vaccineformulering. Efter re-suspension med 200 μL deioniseret vand tilsættes 10 μL af formuleringen (10 μg/ml OVA) i de små konfokale laserskåle under en superren bænk og samkultur med BMDC'er i 6 timer.
- Actin cytoskelet plet
- Fjern kulturvæsken fra cellerne, og vask dem to gange med forvarmet fosfatbufferet saltvand (PBS; pH 7,4).
- Fikser cellerne med 4% formaldehydopløsning i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Under fiksering skal du undgå fikseringsmidler, der indeholder methanol, som kan ødelægge actin.
- Cellerne vaskes med PBS to eller tre gange ved stuetemperatur i 10 minutter hver. Gennemtræng cellerne med 100 μL 0,5% Triton X-100 opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Cellerne vaskes med PBS to eller tre gange ved stuetemperatur i 10 minutter hver igen.
- Dæk cellerne på glasbunden af de små konfokale laserskåle med 200 μL fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugeret phalloidin-arbejdsløsning og inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. For at reducere baggrundssignalet tilsættes 1% bovin serumalbumin til den FITC-konjugerede phalloidin-arbejdsløsning. Derudover skal du dække låget på de små konfokale laserskåle under inkubation for at forhindre fordampning af opløsningen.
- Vask cellerne med PBS thre gange i 5 minutter hver. Farvning af kernerne igen med 200 μL DAPI-opløsning (koncentration: 100 nM) i ca. 30 s.
- Billedanalyse
- Tænd for konfokalmikroskopets hardware i rækkefølge, herunder laser, konfokal, mikroskop og computer. Klik på NIS-Elements AR 5.20.00-softwaren , og vælg Nikon Confocal for at komme ind i testsystemet.
- I konfokalmikroskopsystemet skal du tænde de forskellige enheder i den angivne rækkefølge. Først skal du konfigurere FITC-, DAPI- og Cy5-kanalerne og justere den tilsvarende HV og offset. Vælg derefter 100x olielinsen og læg en dråbe cedertræolie på toppen. Placer de små konfokale laserskåle indeholdende farvede BMDC'er på mikroskopstadiet.
- Klik på knappen Scan . Under et fluorescensmikroskop lokaliseres celler af interesse ved at flytte X-aksen, Y-aksen og Z-aksen. Indstil laserintensiteten, billedstørrelsen og andre parametre for at muliggøre scanning af konfokale billeder i høj kvalitet. Til sidst skal du klikke på Capture-knappen og gem billederne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En simpel et-trins sonificering blev brugt til at opnå PNPE. Først forberedte vi ensartede PNP'er til brug som den faste stabilisator (figur 1A). Morfologien af PNP'er blev observeret gennem SEM, hvilket viser, at de for det meste er ensartede og sfæriske (figur 1B). Formuleringernes hydrodynamiske størrelse og zetapotentiale blev påvist via DLS. PNP'ernes diameter var 187,7 ± 3,5 nm, og zetapotentialet var -16,4 ± 0,4 mV (figur 1C og supplerende tabel 1). For at fremstille PNPE blev blandingen af PNP-opløsning (0,4%, w / v) og squalen simpelthen sonikeret ved 100 w i 5 minutter (figur 1D). Efter optimering af den kontinuerlige fase blev den opnåede PNPE internt sammensat af squalen og eksternt adsorberet med PNP'er (supplerende figur 1). Et optisk mikroskop blev anvendt til at observere emulsionsdråberne, og Mastersizer-partikelstørrelsesanalysatoren blev brugt til at bestemme størrelsesfordelingen. PNPE udviste ikke færre partikler for at forhindre sammensmeltning af emulsionerne og ikke flere partikler til overskud i den kontinuerlige fase, der forårsager de større aggregater (figur 1E). Som vist i figur 1F og supplerende tabel 1 var emulsionsstørrelsen 2100 ± 300 nm, og zetapotentialet var -27,1 ± 0,5 mV, hvilket indikerer, at partiklerne aggregerede på olie/vand-grænsefladen. For at observere den cellulære optagelse af antigen blev Cy5-labled OVA adsorberet på PNPE. Til at begynde med blev 500 μL PNPE blandet med 500 μL Cy5-mærket OVA ved stuetemperatur i 1 time. Absorptionen af antigener på formuleringerne blev testet ved hjælp af BCA-assay. På grund af dets høje specifikke overfladeareal og hydrofobicitet blev mere end 70,6% af de fluide antigener adsorberet på PNPE inden for 1 time, hvilket indikerer et betydeligt potentiale for at indlæse store mængder antigener på kort tid. Som kontrolgruppe blev PMP'er og SSE også karakteriseret. PMP'erne var sammenlignelige i størrelse (1987 ± 310 nm) med PNPE. SSE var negativt ladet emulsion (-15,9 ± 0,8 mV) med en diameterstørrelse på 147,2 ± 0,5 nm. Derudover var belastningseffektiviteten for PMP'er og SSE kun 25,6% ± henholdsvis 0,6% og 23,4% ± 0,2% på grund af den begrænsede adsorption med antigener (supplerende tabel 1). For at evaluere PNPE's stabilitet blev den tilberedte PNPE desuden opbevaret ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Stamopløsningens størrelse og zetapotentiale blev bestemt på dag 0-6 (1:50 fortynding). Som vist i supplerende figur 2 forblev dråberne ens i størrelse og zetapotentiale under opbevaring ved 4 °C, og 25 °C tydede på højere stabilitet af PNPE til levering af antigener. Derefter blev QCM-D brugt til at måle fleksibiliteten af PNPE. Som vist i figur 1G udviste PMP'erne som følge af sin stive struktur lavere spredning (ΔD). Samtidig havde PNPE en signifikant højere ΔD, hvilket demonstrerede dens fremragende viskoelasticitet og fleksibilitet, hvilket kan være en af grundene til forbedret cellebinding og optagelse.
For at validere PNPE's affinitet til BMDC-membranen blev bEV'erne brugt til at erstatte de intakte celler på grund af deres passende størrelse til nøjagtig QCM-D-detektion. I denne proces blev de modne BMDC'er høstet og serielt ekstruderet gennem polycarbonatmembranfiltre, der indeholdt 10, 5 og 1 μm porestørrelser til forberedte blærer i nanostørrelse. De opnåede bEV'er blev opsamlet og renset via ultracentrifugering og gensuspenderet i HEPES bufferet saltvand (figur 2A). Morfologien af de negativt farvede bEV'er blev derefter undersøgt ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). En nanopartikelsporingsanalyse (NTA) blev brugt til at teste størrelsen af bEV'er. Resultaterne viste, at bEV'er var lukkede lipid-tolags vesikulære former, og fordelingen var homogen (figur 2B). NTA viste, at størrelsesfordelingen af bEV'erne med topdiameter for de oprensede bEV'er var 131 nm (figur 2C). Vi konkluderede således, at bEV'erne var en typisk membranstruktur med ensartet fordeling, hvilket muliggjorde mere nøjagtighed i QCM-D-analysen som erstatning for BMDC'er.
Dernæst blev vedhæftningen af bEV'er til PNPE sporet ved hjælp af QCM-D. Først blev QCM-D SiO2-sensoren modificeret med PLL for at give en positiv ladning for efterfølgende at fastgøre PNPE på overfladen og simulere bio-interfaseprocessen. Det blev straks efterfulgt af tilføjelse af bEV-løsningen i kammeret for at belyse interaktionen mellem PNPE og bEV'er (figur 3A). Som vist i figur 3B indikerede det umiddelbare fald i frekvensen (ΔF) en hurtig vedhæftning af bEV'er til PNPE efter mødet. Desuden faldt ΔF med stigende bEV-koncentration, hvilket afspejler en koncentrationsafhængig effekt. PNPE har en tæt pakket overflade til at understøtte landingsstedet; desuden udviste den dynamiske krumningsændringer og lateral diffusion for potent cellulær kontakt, hvilket resulterede i høj affinitet til BMDC'er. I modsætning hertil var PMP'er og SSE svagt bundet til bEV'er, selv ved høj koncentration (80 μg / ml), hvilket sandsynligvis skyldtes mangel på kontaktsteder med immuncellerne (figur 3C).
Efter at have bekræftet adhæsionsprocessen til BMDC'er blev PNPE brugt til at levere antigen til BMDC'erne. For direkte at visualisere antigeninternaliseringsprofilerne in vitro blev Cy5-mærket OVA blandet med henholdsvis PMP'er, SSE og PNPE til behandling med BMDC'er. Efter 6 timers efterbehandling blev CLSM udført for at analysere den cellulære optagelse af Cy5-mærket OVA i BMDC'er. Som vist i figur 4A indikerede Cy5-OVA-fluorescenssignalet, at den samlede mængde antigen, der internaliseres i celler, er signifikant højere i den PNPE-behandlede gruppe sammenlignet med den i PMP'erne og SSE-behandlede gruppe. Den kvantitative analyse af cellulær optagelse blev yderligere udført og viste en signifikant højere relativ fluorescensintensitet hos BMDC'er behandlet med PNPE end hos dem, der blev behandlet med PMP'er og SSE (p < 0,001), hvilket bekræftede observationen ovenfor (figur 4B). De opnåede resultater viste, at PNPE fremmede antigeninternaliseringen og effektivt leverede antigenet intracellulært. Derfor var antigenernes optagelseseffektivitet positivt forbundet med leveringssystemets affinitet til målrettede celler, og PNPE øgede effektivt antigencellulær optagelse via kontakt på flere niveauer med cellemembranen.
Figur 1: Karakterisering af PLGA nanopartikelstabiliseret Pickering-emulsion. (A) Skematisk for den eksperimentelle procedure, der anvendes til fremstilling af PLGA-nanopartikler (PNP'er). (B) Scanning elektronmikroskopi (SEM) billeder af PNP'er. (C) Størrelsesfordeling af PNP'er. (D) Skematisk over den eksperimentelle procedure, der anvendes til fremstilling af nanopartikelstabiliseret pickeringemulsion (PNPE). E) Optiske mikrografer af PNPE. Skala bar = 20 μm. (F) Størrelsesfordeling af PNPE. (G) Kvartskrystalmikrobalance med spredningsovervågning (QCM-D) analyse af blødheden af PNPE, PLGA-mikropartikler (PMP'er) og overfladeaktivt stabiliseret emulsion (SSE) gennem påvisning af spredning (ΔD). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Karakterisering af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler. (A) Skematisk over den eksperimentelle procedure, der anvendes til fremstilling af bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV'er). (B) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) billeder af bEV'er. Skala bar = 200 nm. (C) Størrelsesfordeling af bEV'er målt ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA) (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Finitet af PNPE til bEV'er analyseret ved hjælp af QCM-D . (A) Skematisk for modifikationen af PLL-overfladen gennem PNPE-belægning. (B) Ændringer i hyppigheden (ΔF) af PNPE efter at have stødt på forskellige koncentrationer af bEV'er. (C) Sammenligning af ændringer i ΔF i PLGA-mikropartikler (PMP'er), overfladeaktivt stabiliseret emulsion (SSE) og PNPE. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Optagelse af antigener. (A) Repræsentativt diagram over den cellulære optagelse af antigener. Skalabar = 20 μm. (B) Relativ intensitetsfluorescens af cellulær optagelse af antigener. Grafen viser middelværdi ± SEM fra tre uafhængige eksperimenter. Envejs ANOVA blev brugt til at analysere betydningen af de observerede forskelle. P < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Optimering af kontinuerlig fase. A) Optiske mikrografer af PNPE konstrueret af forskellige kontinuerlige faser. Skalabar = 20 μm. (B) Emulsionernes størrelser blev påvist efter tilberedningen. Resultaterne blev udtrykt som gennemsnit ± SEM (n = 3). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: PNPE's stabilitet. Størrelse (A) og zetapotentiale (B) af PNPE efter 0, 3 og 6 dages opbevaring ved de angivne temperaturer. Data blev påvist som middel ± SEM (n = 3). Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1: Karakteriseringer af formuleringerne. PNP'er, PNPE og SSE blev udarbejdet i henhold til den angivne protokol. Størrelsesfordelingerne og zetapotentialet blev bestemt af dynamisk lysspredningsanalysator (DLS) eller Mastersizer partikelstørrelsesanalysator. Lasteeffektiviteten blev evalueret ved hjælp af BCA-analysen. Data blev påvist som middel ± SEM (n = 3). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi udviklede PLGA nanopartikelstabiliseret olie/vandemulsion som et leveringssystem til forbedret antigeninternalisering. Den forberedte PNPE havde en tæt pakket overflade til at understøtte landingsstedet og unik blødhed og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Desuden tilbød olie/vand-grænsefladen antigenbelastning med højt indhold, og amfifil PLGA gav PNPE høj stabilitet til transport af antigener til immunceller. PNPE kunne hurtigt klæbe til overfladen af cellerne, hvilket indikerer, at PLGA-nanopartikelstabiliseret emulsion har en stærk affinitet til cellemembranen til cellulær optagelse. Desuden havde PNPE en høj sikkerhedsprofil, fordi både squalen og PLGA er Food and Drug Administration (FDA) godkendte ingredienser30, som forventes at udnytte sikker overførsel til klinikken.
PLGA's molekylvægt og typen af kontinuerlige og dispergerede faser påvirkede PNPE-egenskaberne, herunder stabilitet og hydrofobicitet. I denne forskning blev 17 kDa molekylvægt PLGA nanopartikler valgt som stabilisator og squalen som dispergeringsfasen, hvilket resulterede i øget stabilitet. Derudover forenklede deioniseret vand som en kontinuerlig fase formuleringens sammensætning. Under denne betingelse tillod PNPE effektiv samling af antigener og fremmede levering af antigener til immunceller. Desuden blev metoden til et-trins sonikering brugt til at forberede PNPE, hvilket eliminerede den kedelige proces og undgik muligheden for forurening. Det er vigtigt at bemærke, at leveringssystemet bestående af PNP'er og squalen skal være en ensartet kraft, ellers dannes der ingen emulsion, eller den tilberedte PNPE er ikke ensartet i størrelse.
Mens undersøgelse af affiniteten af leveringssystemet til celler var en ekstraordinær udfordring udført in vivo, kunne in vitro-undersøgelser hjælpe med at belyse processen involveret i cellulær vedhæftning og internalisering. For nylig har dette problem fået stor opmærksomhed på det biomedicinske område. Der er gjort en betydelig indsats for at kaste lys over partiklers affinitet til celler ved hjælp af flowcytometri og CLSM-analyse31,32. Mens disse metoder giver en gennemsnitlig aflæsning på celleniveau, overvåges de specifikke dynamiske bindingsprocesser mellem celler og leveringssystemer ikke let. I modsætning hertil afhænger QCM primært af en følsom piezoelektrisk krystal, som ΔF ændrer med masse. Evnen til at detektere små masseændringer gør det muligt for QCM-D at overvåge de målrettede molekylære interaktioner. Teknikken kan bruges til at overvåge realtidshændelser, hvilket gør det muligt at studere affinitet af PNPE med BMDC'er under forskellige forhold33.
Adhæsionen til PNPE blev undersøgt ved hjælp af bEV'er i stedet for intakte celler. Som de velkontrollerede enkle APC'er menes bEV'er at arve de fleste af modercellernes egenskaber. Generelt fungerer ekstracellulære vesikler med små og homogene partikelstørrelser bedre i adhæsionsassays. Således blev bEV'erne fremstillet via ekstrudering gennem polycarbonatfiltre med 10, 5 og 1 μm porestørrelser34. Diameteren og udbyttet af bEV'er kunne styres ved at regulere antallet af ekstruderinger og porestørrelsen af polycarbonatmembraner. Det anbefales at lave 30 passerer gennem polycarbonatmembranerne. Denne metode havde imidlertid også en begrænsning, idet en del af membranen kan vendes, hvilket får proteinerne på DC-overfladen til at blive indkapslet i bEV'erne, hvilket reducerede affiniteten til emulsioner lidt.
Det blev vist, at modifikationen af SiO 2-sensoroverfladerne ved hjælp af positivt ladede proteiner var egnet til den efterfølgende PNPE-belægning. Den beskrevne implementering af PLL (Polycation polypeptid) som mellemlag mellem SiO2-sensoroverflader og PNPE viste sig at være en forbedring for hurtigbelægningsmetoden. Ændringer i masse forårsaget af enhver begivenhed, f.eks. uspecifikke adsorptioner af en hvilken som helst komponent fra opløsningsflowet på SiO 2-sensoren, kan påvirke nøjagtigheden af eksperimentelle resultater35. Det var derfor nødvendigt at sikre, at PLL bevarede en ensartet kvalitet på chippen efter spincoating, og deres overflade ville blive fuldstændigt dækket af PNPE for at undgå målefejl forårsaget af uspecifik adsorption. På samme tid, da ΔF ikke længere ændrede sig under kontakten med den PNPE-holdige mobile fase, blev chipoverfladen betragtet som helt dækket. Dette sikrede, at de detekterede signaler blev genereret ved vedhæftning af bEV'er til PNPE. Vi demonstrerede, at QCM-D var en god metode til at vise vedhæftningen af bEV'er til PNPE i realtid, hvilket afspejler PNPE's høje affinitet til APC'er. Desværre kunne denne metode ikke afspejle samspillet mellem individuelle celler og leveringssystemet. Derfor vil en mere præcis bestemmelse kræve yderligere design af protokollen og optimering af foranstaltningsproceduren.
Efter at have analyseret PNPE's høje affinitet til bEV'er blev forbedret internalisering yderligere verificeret. Vi viste, at den potente cellulære optagelse af antigener korrelerede med PNPE's høje affinitet. PNPE havde strukturen på flere niveauer til effektiv indlæsning af antigener og fleksibilitet til multi-level kontakt med cellemembranen for at forbedre leveringen. Derfor stimulerede den rationelt designede Pickering-emulsion cellulær internalisering og intracellulære veje gennem den robuste interaktion med cellemembranen. Efter at have demonstreret disse fordele kan PNPE kaste lys over udviklingen af nye, sikre og effektive antigenleveringssystemer til forbedring af vacciner.
Denne protokol viste med succes den høje affinitet af PNPE til phospholipid dobbeltlaget af immunceller og efterfølgende intracellulær levering af antigenet til immunceller in vitro. Derfor kan forskellige typer antigener fra forskellige patogener leveres og karakteriseres ved hjælp af den foreslåede protokol for at give beskyttelse mod infektionssygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af projekt støttet af Kinas nationale nøgleforsknings- og udviklingsprogram (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), Fra 0 til 1 originalt innovationsprojekt af grundlæggende frontier videnskabeligt forskningsprogram for kinesisk videnskabsakademi (ZDBS-LY-SLH040), Stiftelsen for innovative forskningsgrupper fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr. 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
