Summary
Pour concevoir rationnellement des adjuvants efficaces, nous avons développé une émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules d’acide polylactique-co-glycolique (PNPE). Le PNPE possédait une douceur unique et une interface hydrophobe pour un contact cellulaire puissant et offrait une charge antigénique à haute teneur, améliorant l’affinité cellulaire du système de livraison aux cellules présentatrices d’antigènes et induisant une internalisation efficace des antigènes.
Abstract
L’affinité cellulaire des micro / nanoparticules est la condition préalable à la reconnaissance cellulaire, à l’absorption cellulaire et à l’activation, qui sont essentielles à l’administration de médicaments et à la réponse immunitaire. La présente étude est née de l’observation que les effets de la charge, de la taille et de la forme des particules solides sur l’affinité cellulaire sont généralement pris en compte, mais nous réalisons rarement le rôle essentiel de la douceur, du phénomène de restructuration dynamique et de l’interaction d’interface complexe dans l’affinité cellulaire. Ici, nous avons développé une émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules (PNPE) à l’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) qui a surmonté les lacunes des formes rigides et simulé la flexibilité et la fluidité des agents pathogènes. Une méthode a été mise au point pour tester l’affinité de la PNPE avec les surfaces cellulaires et élaborer sur l’internalisation ultérieure par les cellules immunitaires. L’affinité de la PNPE pour les vésicules extracellulaires biomimétiques (EVb) - le remplacement des cellules dendritiques de la moelle osseuse (BMDC) - a été déterminée à l’aide d’une microbalance de cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D), qui a permis une surveillance en temps réel de l’adhésion de l’émulsion cellulaire. Par la suite, le PNPE a été utilisé pour délivrer l’antigène (ovalbumine, OVA) et l’absorption des antigènes par les BMDC a été observée à l’aide d’un microscope confocale à balayage laser (CLSM). Des résultats représentatifs ont montré que le PNPE diminuait immédiatement la fréquence (ΔF) lorsqu’il rencontrait les bEV, indiquant une adhésion rapide et une forte affinité du PNPE aux BMDC. Le PNPE a montré une liaison significativement plus forte à la membrane cellulaire que les microparticules PLGA (PMP) et l’adjuvant AddaVax (désigné comme nano-émulsion stabilisée par surfactant [SSE]). En outre, en raison de l’affinité cellulaire accrue avec les immunocytes par des changements de courbure dynamiques et des diffusions latérales, l’absorption de l’antigène a ensuite été stimulée par rapport aux PMP et à l’ESS. Ce protocole fournit des informations pour la conception de nouvelles formulations avec une affinité cellulaire élevée et une internalisation efficace des antigènes, fournissant une plate-forme pour le développement de vaccins efficaces.
Introduction
Pour lutter contre les maladies épidémiques, chroniques et infectieuses, il est impératif de développer des adjuvants efficaces pour les vaccinations prophylactiques et thérapeutiques 1,2. Idéalement, les adjuvants devraient posséder une excellente sécurité et une excellente activation immunitaire 3,4,5. On pense que l’absorption et le processus efficaces des antigènes par les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) constituent une étape essentielle des cascades de signalisation en aval et de l’initiation de la réponse immunitaire 6,7,8. Par conséquent, acquérir une compréhension claire du mécanisme d’interaction des cellules immunitaires avec les antigènes et concevoir des adjuvants pour améliorer l’internalisation sont des stratégies efficaces pour améliorer l’efficacité des vaccins.
Des microparticules et nanoparticules ayant des propriétés uniques ont déjà été étudiées en tant que systèmes d’administration d’antigènes pour faciliter l’absorption cellulaire des antigènes et l’interaction cellulaire avec les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes 9,10. Au contact des cellules, les systèmes de livraison commencent à interagir avec la matrice extracellulaire et la membrane cellulaire, ce qui a conduit à l’internalisation et aux réponses cellulaires ultérieures11,12. Des études antérieures ont mis en évidence que l’internalisation des particules se fait par adhésion membrane-particule cellulaire13, suivie d’une déformation flexible de la membrane cellulaire et de la diffusion du récepteur vers la membrane de surface14,15. Dans ces circonstances, les propriétés du système de livraison dépendent de l’affinité avec les APC, qui affectent par la suite la quantité absorbée16,17.
Pour mieux comprendre la conception du système d’administration pour améliorer la réponse immunitaire, des efforts considérables ont été consacrés à l’étude de la relation entre les propriétés des particules et l’absorption cellulaire. La présente étude découle de l’observation que les microparticules et nanoparticules solides ayant des charges, des tailles et des formes variées sont souvent étudiées sous cet angle, tandis que le rôle de la fluidité dans l’internalisation de l’antigène est rarement étudié18,19. En fait, lors de l’adhésion, les particules molles ont démontré des changements de courbure dynamiques et des diffusions latérales pour augmenter la surface de contact pour les interactions multivalentes, ce qui peut difficilement être reproduit par les particules solides20,21. De plus, les membranes cellulaires sont des bicouches phospholipidiques (sphingolipides ou cholestérol) au site d’absorption, et les substances hydrophobes peuvent modifier l’entropie conformationnelle des lipides, réduisant la quantité d’énergie requise pour l’absorption cellulaire22,23. Ainsi, l’amplification de la mobilité et la promotion de l’hydrophobicité du système d’administration peuvent être une stratégie efficace pour renforcer l’internalisation de l’antigène afin d’améliorer la réponse immunitaire.
L’émulsion de Pickering, stabilisée par des particules solides assemblées à l’interface entre deux liquides non miscibles, a été largement utilisée dans le domaine biologique24,25. En fait, les particules agrégeantes sur l’interface huile/eau déterminent la formulation de structures à plusieurs niveaux, qui favorisent les interactions entre le système d’administration et les cellules à plusieurs niveaux et induisent davantage des propriétés physico-chimiques multifonctionnelles dans l’administration de médicaments. En raison de leur déformabilité et de leur mobilité latérale, on s’attendait à ce que les émulsions de Pickering entrent en interaction cellulaire multivalente avec les immunocytes et soient reconnues par les protéines membranaires26. De plus, comme les carottes de micelles huileuses dans les émulsions de Pickering ne sont pas complètement recouvertes de particules solides, les émulsions de Pickering présentent des espaces de différentes tailles entre les particules situées à l’interface huile-eau, ce qui entraîne une hydrophobicité plus élevée. Il est donc crucial d’explorer l’affinité des émulsions de Pickering avec les APC et d’élaborer sur l’internalisation subséquente pour développer des adjuvants efficaces.
Sur la base de ces considérations, nous avons conçu une émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules PLGA (PNPE) en tant que système d’administration de vaccins fluide qui a également permis d’acquérir des informations précieuses sur l’affinité du PNPE avec les BMDC et l’internalisation cellulaire. L’adhésion en temps réel des vésicules extracellulaires biomimétiques (bEV; un remplacement des BMDC) au PNPE a été surveillée par une méthode sans marquage à l’aide d’une microbalance à cristaux de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D). Après la caractérisation de l’affinité de la PNPE avec les BMDC, la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) a été utilisée pour déterminer l’absorption de l’antigène. Le résultat a indiqué une plus grande affinité de la PNPE avec les BMDC et l’internalisation efficace de l’antigène. Nous nous attendions à ce que la PEPN présente une plus grande affinité avec les APC, ce qui pourrait mieux stimuler l’internalisation des antigènes pour améliorer les réponses immunitaires.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’Institut de génie des procédés de l’Académie chinoise des sciences. Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées en stricte conformité avec le Règlement sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et les Directives pour l’examen éthique des animaux (Chine, GB/T35892-2018).
1. Préparation et caractérisation des nanoparticules PLGA
- Préparation de nanoparticules PLGA (PNP)
- Ajouter 0,5 g d’alcool polyvinylique (PVA) à 120 mL d’eau désionisée à 90 °C et agiter jusqu’à dissolution complète pour préparer la solution de PVA. Conservez la solution au réfrigérateur (4 °C) après refroidissement à température ambiante.
- Ajouter 100 mg de PLGA à 10 mL de mélange d’acétone et d’éthanol (rapport de 4:1) pour servir de phase huileuse.
- Placer 20 ml de solution aqueuse de PVA sous la hotte et agiter magnétiquement à 400 tr/min. Ajouter 5 mL de la phase huileuse dans la solution de PVA goutte à goutte à l’aide d’une pompe à seringue. Ensuite, agiter le mélange dans la hotte jusqu’à ce que les solvants organiques s’évaporent complètement.
NOTE: Avec l’augmentation de la concentration des particules dans la phase huileuse, la solution en phase aqueuse se transforme progressivement en une lumière claire et transparente blanc bleuâtre ou blanc laiteux. - Après la volatilisation des solvants organiques (2-3 h), centrifuger le mélange à 15 000 x g. Lavez trois fois ou plus jusqu’à ce que l’eau de lavage finale soit claire et transparente.
REMARQUE : Le but de cette étape est principalement de laver le PVA résiduel sur la surface des particules pour éviter qu’il n’affecte la préparation de l’émulsion de Pickering. - Remettre en suspension les PNP lavés dans 2 mL d’eau désionisée et congeler le mélange à -80 °C pendant 24 h. Ensuite, lyophiliser les particules dans un lyophilisateur pendant 48-72 h. Les PNP préparés sont des troupeaux blancs.
- Caractérisation des PCP
- Pour caractériser la taille et le potentiel zêta des PNP, ajouter 10 μL de PNP dans 1 mL d’eau désionisée pour obtenir une solution de diluant et transférer la solution de diluant dans une cellule DTS1070. Allumez l’ordinateur et l’analyseur de diffusion dynamique de la lumière (DLS), puis placez la cellule DTS1070 dans le système DLS.
- Cliquez sur le logiciel Zeta Size et créez un nouveau fichier de mesure pour configurer la procédure de détermination. Ensuite, lancez la procédure de détermination pour obtenir la taille des particules et la distribution du potentiel zêta.
- Pour observer la morphologie des PNP, étaler uniformément la solution de PNP à 0,1 mL (diluée 40 fois) sur une feuille de papier d’aluminium de 5 cm x 5 cm et laisser l’eau s’évaporer naturellement dans une hotte bien ventilée pendant la nuit.
- Découpez une petite partie de la feuille d’étain et fixez-la sur la table d’échantillonnage avec du ruban conducteur. Vaporisez-le d’or à un courant de 10 mA pendant 120 s. Observer ensuite la morphologie de surface de l’échantillon à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB).
2. Préparation et caractérisation de la PNPE
- Pour préparer le PNPE, ajouter des PNP lyophilisés à de l’eau désionisée à une concentration de 4 mg/mL (la phase aqueuse), puis ajouter du squalène comme phase huileuse. Préparez PNPE par sonication en une étape pendant 5 min à 100 W dans un sonicateur au bain-marie. Le rapport de phase huile-eau est de 1:9.
- Caractérisation du PNPE préparé
- Ouvrez le logiciel Mastersizer 2000 et le laser en séquence. Cliquez sur Mesure pour ouvrir le programme prédéfini et définir le nom de l’échantillon. Cliquez sur Démarrer pour commencer à mesurer le fond de l’échantillon, puis, à l’aide d’un compte-gouttes, ajoutez 1 mL de PNPE dans le réservoir d’échantillon de l’analyseur de taille de particules laser pour mesurer la taille des particules de l’émulsion trois fois en parallèle.
- Diluer 20 μL de PNPE dans 1 mL d’eau désionisée. Déposer 20 μL de l’émulsion sur la lame. Observer la morphologie et l’homogénéité de l’émulsion par microscopie optique à grossissement 40x et obtenir des photographies.
- Efficacité de chargement de l’antigène
- Dissoudre 200 μg d’ovalbumine (OVA) dans 500 mL d’eau désionisée. Ensuite, mélangez-le avec 500 ml de PNPE préparé et agitez pendant 1 h à température ambiante. Prélever l’antigène fluidique par centrifugation à 5000 x g pendant 20 min.
- Déterminer les concentrations d’antigènes fluidiques à l’aide de dosages de l’acide bicinchoninique (BCA)27. La formule de calcul de l’efficacité de charge de l’antigène est la suivante:
Efficacité de chargement de l’antigène =
Utilisez la même méthode pour déterminer l’efficacité de chargement de l’antigène de l’ESS qui est utilisé comme groupe témoin.
- Stabilité du PNPE
- Diviser 6 mL du PNPE préparé en six portions égales et conserver trois parties à 4 °C et 25 °C, respectivement. Diluer 20 μL de PNPE stocké dans 1 mL d’eau désionisée (1:50) aux jours 0, 3 et 6. Ensuite, mesurez la taille et le potentiel zêta des solutions mères de PNPE conservées à différentes températures.
REMARQUE: Les différentes températures de stockage sont réglées pour comparer l’effet de différentes températures sur la stabilité du PNPE, ce qui peut optimiser les conditions de stockage pour une stabilité élevée et une longue durée de conservation.
- Diviser 6 mL du PNPE préparé en six portions égales et conserver trois parties à 4 °C et 25 °C, respectivement. Diluer 20 μL de PNPE stocké dans 1 mL d’eau désionisée (1:50) aux jours 0, 3 et 6. Ensuite, mesurez la taille et le potentiel zêta des solutions mères de PNPE conservées à différentes températures.
- Préparation des microparticules PLGA (PMP)
- Dissoudre 500 mg de PLGA dans 5 mL de dichlorométhane en phase huileuse, puis verser dans 50 mL de phase aqueuse externe contenant 1,5% de PVA pour obtenir le mélange huile/eau. Homogénéiser le mélange à 3000 rpm pendant 1 min à l’aide d’un homogénéisateur pour obtenir des émulsions grossières.
- Maintenir l’uniformité de la taille des particules PLGA des microsphères (déterminée par des émulsions grossières) par émulsification membranaire. Installez une membrane de 5,2 μm dans le tube à membrane. Ajustez la pression à 800 kPa et maintenez-la stable.
- Ouvrez la soupape d’échappement et la soupape d’alimentation et, après avoir ajouté les émulsions grossières au réservoir d’échantillon, fermez la soupape d’échappement et la soupape d’alimentation, ouvrez la soupape de décharge et la soupape d’admission et prenez l’émulsion post-film dans un bécher de 200 mL. Répétez le processus trois fois pour obtenir des émulsions pré-doubles.
- Remuer les émulsions pré-doubles pour évaporer le dichlorométhane à température ambiante afin de durcir les microsphères. Laver les microsphères à l’eau désionisée à 7741 x g pendant 3 min cinq fois. Précongeler dans un congélateur à -80 °C et enfin lyophiliser pour obtenir des microsphères séchées.
- Caractérisation des PGR
- Ouvrez le logiciel Mastersizer 2000 et le laser en séquence. Cliquez sur Mesure pour ouvrir le programme prédéfini et définir le nom de l’échantillon. Cliquez sur Démarrer pour commencer à mesurer le fond de l’échantillon. Ensuite, ajoutez 1 mL de PMP dans le réservoir d’ajout d’échantillon de l’analyseur granulométrique laser avec un compte-gouttes et mesurez la taille des particules des microparticules trois fois en parallèle.
- Analyse de douceur
REMARQUE: PNPE a été enduit sur le capteur SiO2 pour mesurer la douceur.- Nettoyez la puce du capteur de quartz SiO 2 par traitement UV-ozone pendant 10 min, rincez deux fois avec 5 ml d’éthanol (75% v/v) et séchez avec du N2. Installez la puce vide du capteur de quartz SiO2 dans la cellule d’écoulement.
- Allumez l’ordinateur et activez le contrôle de la température en bas à droite du logiciel pour vous assurer que la température réglée est inférieure d’environ 1 °C à la température ambiante.
- Cliquez sur le bouton Acquisition dans la barre d’outils et sélectionnez Configurer la mesure pour rechercher les 1, 3, 5, 7, 9 et 11 octaves de la puce dans le canal utilisé. Cliquez sur le bouton Acquisition dans la barre d’outils et sélectionnez Démarrer la mesure.
- Corrigez la ligne de base avec de l’air et, lorsque la ligne de base est équilibrée, sélectionnez Arrêter et enregistrez le fichier en tant que blanc.
- Nettoyez la puce et essorez 10 μg/mL de PNPE sur la puce. Brièvement, allumez l’enrobage et définissez le paramètre de fonctionnement. Connectez le tuyau N2 au coater, réglez le fractionnement de la bouteille de gaz à 0,4 kPa et placez la puce propre sur la ventouse de la bobine d’essorage. Ajoutez 100 μL de PNPE goutte à goutte au centre du capteur SiO2 et fermez le couvercle supérieur de l’enrobage pour compléter le revêtement.
- Installez la puce revêtue de PNPE dans la cellule d’écoulement. Répétez les étapes 2.7.3 à 2.7.4 et enregistrez le fichier au format PNPE. Ouvrez les fichiers vierges et PNPE et cliquez sur le bouton Stitch pour obtenir les données de dissipation (ΔD) associées.
3. Isoler et cultiver des BMDC 28
REMARQUE: Assurez-vous que tous les réactifs et échantillons sont placés sur de la glace, car cela a un effet positif sur l’activité cellulaire. Pour maintenir la stérilité, effectuez toutes les étapes sur un banc ultra-propre à l’aide d’ustensiles stériles.
- Euthanasier les souris C57BL/6 (femelles, 6-8 semaines) par inhalation de CO2 et les tremper dans de l’éthanol à 70% (v/v) pour une brève stérilisation.
- Après avoir trempé pendant 3-5 min, transférer les souris sur un banc super propre. Enlevez les muscles des jambes à l’aide de ciseaux en acier inoxydable pour exposer le fémur et le tibia, puis séparez le fémur et le tibia.
- Remplissez une boîte de Petri avec de l’éthanol à 70% (v/v) et faites tremper les os propres pendant 5 à 10 s pour compléter la stérilisation externe. Nettoyez tous les os et placez-les dans un tube stérile entouré de glace.
- Coupez le fémur et le tibia près de l’articulation à l’aide de ciseaux. Insérez l’aiguille de la seringue dans l’os pour rincer la moelle osseuse dans un tube à centrifuger à l’aide d’un milieu RPMI prérefroidi (1640).
- Rincer deux ou trois fois jusqu’à ce que l’os soit complètement blanc. Pipeter la moelle osseuse plusieurs fois pour séparer toutes les touffes. Filtrer les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL à l’aide d’un tamis de 40 μm de diamètre.
- Centrifuger à 4 °C et 500 x g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 2 mL de lysat érythrocytaire au sédiment pendant 4 min.
- Après le lavage deux ou trois fois, remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu complet (1 % de pénicilline-streptomycine, 10 % de sérum bovin fœtal, 20 ng/mL d’IL-4 et 10 ng/mL de GM-CSF). Ensuite, diluez 10 μL de cellules dans 1 mL de PBS et insérez la puce du compteur de cellules automatisé portatif dans la dilution cellulaire pour le comptage cellulaire. Enfin, les cellules de graines à une densité de 1 x 106 cellules/mL dans une boîte de culture de 10 mm avec un milieu complet.
- Culture des cellules dans un incubateur cellulaire avec 5% de CO2 à 37 °C. Changez le milieu tous les 2 jours. Le jour 7, transférer les cellules dans un tube de 50 ml et centrifuger à 450 x g pendant 5 minutes pour recueillir les cellules.
4. Préparation de vésicules extracellulaires biomimétiques (EVb)
- Assemblez la mini-extrudeuse en séquence selon les instructions du fabricant. Assurez-vous que le boîtier de la seringue n’est pas fissuré avant de l’utiliser. Assurez-vous que tous les joints toriques sont en bon état avant chaque expérience et remplacez rapidement ceux usés ou endommagés. Les joints toriques usés ou endommagés peuvent provoquer un relâchement soudain de la pression lors de l’utilisation de l’extrudeuse.
- Aspirer les BMDC à plusieurs reprises et les transférer dans un tube à centrifuger. Récolter les cellules par centrifugation à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Pressuriser les suspensions cellulaires à travers des membranes de polycarbonate de 10 μm, 5 μm et 1 μm pendant 30 passages à l’aide de la mini-extrudeuse29.
REMARQUE : Pour permettre l’uniformité de la taille des EVb, les suspensions BMDC ont été poussées à travers des membranes en polycarbonate de 10 μm, 5 μm et 1 μm pendant 30 passages. De plus, pendant le fonctionnement, assurez-vous d’appliquer la force uniformément et de maintenir la direction de la force le long de l’axe de la seringue. - Centrifuger les surnageants groupés pendant 5 min à 1000 x g et 4 °C pour éliminer les cellules. Recueillir le surnageant et le centrifuger à 3000 x g pendant 5 min à 4 °C pour éliminer les cellules restantes et les débris cellulaires.
- Recueillir le surnageant et le centrifuger à 100 000 x g pendant 90 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les VVE dans 2 mL de solution saline tamponnée HEPES (HBS). Purifier les bEV par filtration à travers une membrane de 0,45 μm et stocker les bEV purifiés à −80 °C.
5. Les bEV adhèrent au PNPE
REMARQUE: Le capteur SiO2 a été modifié par la méthode de spin-coating.
- Capteur SiO2 modifié avec poly-L-lysine (PLL).
- Nettoyez la puce du capteur de quartz SiO 2 en utilisant un traitement UV-ozone pendant 10 min, rincez deux fois avec de l’éthanol et séchez-la avec du N2.
- Allumez le spin coater en appuyant sur le bouton d’alimentation , appuyez sur le bouton Contrôle et réglez la durée et la vitesse du revêtement. La vitesse de rotation initiale est de 400 tr / min, qui augmente régulièrement à 5000 tr / min.
- Connectez le tuyau N2 à l’enrobage et réglez le fractionnement de la bouteille de gaz à 0,4 kPa. Placez la puce propre sur la ventouse de la bobine de spin. Ajoutez 100 μL de PLL goutte à goutte au centre du capteur SiO2 et fermez le capot supérieur de la rouleuse.
- Appuyez sur le bouton Start (Démarrer ) pour commencer à enduire l’échantillon et arrêter la machine lorsque vous avez terminé. Mettez la pompe à vide, éteignez les boutons d’alimentation et de contrôle , puis retirez le capteur SiO2 modifié par PLL.
REMARQUE: Avant d’appuyer sur Démarrer, assurez-vous que le temps et la vitesse de revêtement ont été réglés. De plus, assurez-vous que le capteur SiO2 est placé au centre de la ventouse. Assurez-vous que le couvercle est fermé avant d’exécuter le processus pour éviter les accidents.
- Détermination de l’adhérence des VVE au PNPE
- Allumez l’ordinateur, l’unité électronique, la pompe péristaltique et activez le contrôle de température en bas à droite dans le logiciel pour vous assurer que la température réglée est inférieure d’environ 1 °C à la température ambiante.
- Placez les capteurs SiO2 modifiés par PLL dans la cellule d’écoulement conformément aux instructions d’utilisation et connectez la ligne de mesure entre la cellule de débit et la pompe de débit. Placez la cellule d’écoulement à l’intérieur du système de module d’écoulement et rincez-les à l’eau ultrapure avant de commencer les expériences.
- Cliquez sur la barre d’outils Acquisition et sélectionnez Configurer la mesure pour rechercher 1, 3, 5, 7, 9 et 11 octaves de la puce dans le canal utilisé. Pour corriger la ligne de base, cliquez sur Démarrer la mesure pour permettre à l’air d’entrer dans le module de débit jusqu’à ce que la ligne de base de l’air soit lisse. Ensuite, écoulez l’eau désionisée pendant 10-15 minutes pour permettre à nouveau l’équilibre de base de la solution.
- Pomper la solution de PNPE préparée dans le module d’écoulement à un débit de 50 μL/min pour obtenir une adsorption d’équilibre sur le capteur SiO2 .
REMARQUE: Le ΔF ne change plus lorsque le PNPE est pompé à nouveau dans le module de débit, ce qui indique que la surface des capteurs SiO2 a été complètement recouverte de PNPE. - Pomper la solution de bEVs préparée dans le module d’écoulement à un débit de 50 μL/min pour suivre le processus d’adhésion des bEV à la surface du PNPE.
6. Analyse CLSM de l’absorption de l’antigène
- Co-culture PNPE-OVA avec BMDC
- Incuber les BMDC avec 1640 milieux complets (1% pénicilline-streptomycine, 10% sérum bovin fœtal, 20 ng / mL d’IL-4 et 10 ng / mL de GM-CSF) pendant 7 jours, puis les ensemencer dans de petites boîtes laser confocales à 1 x 106 par puits pendant une nuit à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 .
- Mélanger 0,5 mL d’OVA marqué au Cy5 (400 μg/mL) avec 0,5 mL de PNPE pendant 1 h et éliminer l’antigène fluidique par centrifugation à 5000 x g pendant 20 min pour développer la formulation du vaccin. Après une remise en suspension avec 200 μL d’eau désionisée, ajouter 10 μL de la formulation (10 μg/mL d’OVU) dans les petites antennes confocales laser sous un banc super propre et co-culture avec les BMDC pendant 6 h.
- Coloration au cytosquelette d’actine
- Retirez le liquide de culture des cellules et lavez-les deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate préchauffée (PBS; pH 7,4).
- Fixer les cellules avec une solution de formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante. Lors de la fixation, évitez les fixateurs contenant du méthanol, qui peuvent détruire l’actine.
- Lavez les cellules avec du PBS deux ou trois fois à température ambiante pendant 10 minutes chacune. Perméabiliser les cellules avec 100 μL de solution de Triton X-100 à 0,5% pendant 5 min à température ambiante. Lavez à nouveau les cellules avec du PBS deux ou trois fois à température ambiante pendant 10 minutes chacune.
- Couvrir les cellules de la capsule à fond de verre des petites antennes confocales laser avec 200 μL de solution de travail conjuguée à la phalloïdine à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Pour réduire le signal de fond, ajouter 1% d’albumine sérique bovine à la solution de travail de phalloïdine conjuguée FITC. De plus, couvrez le couvercle des petites antennes confocales laser pendant l’incubation pour éviter l’évaporation de la solution.
- Lavez les cellules avec PBS trois fois pendant 5 minutes chacune. Recolorer les noyaux avec 200 μL de solution DAPI (concentration : 100 nM) pendant environ 30 s.
- Analyse d’images
- Allumez le matériel de microscope confocal en séquence, y compris le laser, le microscope confocal, le microscope et l’ordinateur. Cliquez sur le logiciel NIS-Elements AR 5.20.00 et sélectionnez Nikon Confocal pour accéder au système de test.
- Dans le système de microscope confocal, allumez les différentes unités dans l’ordre indiqué. Tout d’abord, configurez les canaux FITC, DAPI et Cy5 et ajustez le HV et le décalage correspondants. Ensuite, sélectionnez la lentille d’huile 100x et mettez une goutte d’huile de cèdre sur le dessus. Placez les petites antennes laser confocales contenant des BMDC colorées sur la platine du microscope.
- Cliquez sur le bouton Analyser . Sous un microscope à fluorescence, localisez les cellules d’intérêt en déplaçant l’axe X, l’axe Y et l’axe Z. Ajustez l’intensité laser, la taille de l’image et d’autres paramètres pour permettre la numérisation d’images confocales de haute qualité. Enfin, cliquez sur le bouton Capturer et enregistrez les images.
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Representative Results
Une sonification simple en une étape a été utilisée pour obtenir le PNPE. Tout d’abord, nous avons préparé des PNP uniformes à utiliser comme stabilisateur solide (Figure 1A). La morphologie des PNP a été observée par MEB, montrant qu’ils sont pour la plupart uniformes et sphériques (Figure 1B). La taille hydrodynamique et le potentiel zêta des formulations ont été détectés via DLS. Le diamètre des PNP était de 187,7 ± 3,5 nm et le potentiel zêta était de -16,4 ± 0,4 mV (figure 1C et tableau supplémentaire 1). Pour préparer le PNPE, le mélange de solution de PNP (0,4 %, p/v) et de squalène a simplement été soniqué à 100 w pendant 5 min (Figure 1D). Après optimisation de la phase continue, le PNPE obtenu était composé en interne de squalène et adsorbé à l’extérieur avec des PNP (Figure supplémentaire 1). Un microscope optique a été utilisé pour observer les gouttelettes d’émulsion, et l’analyseur granulométrique Mastersizer a été utilisé pour déterminer la distribution de taille. Le PNPE n’a pas présenté moins de particules pour empêcher la coalescence des émulsions et plus de particules à l’excès dans la phase continue qui provoquent les agrégats plus gros (Figure 1E). Comme le montrent la figure 1F et le tableau supplémentaire 1, la taille de l’émulsion était de 2100 ± 300 nm et le potentiel zêta était de -27,1 ± 0,5 mV, indiquant que les particules se sont agrégées sur l’interface huile/eau. Pour observer l’absorption cellulaire de l’antigène, l’OVA à lacet Cy5 a été adsorbé sur le PNPE. Pour commencer, 500 μL de PNPE ont été mélangés avec l’OVA marqué Cy5 de 500 μL à température ambiante pendant 1 h. L’absorption des antigènes sur les formulations a été testée à l’aide du dosage BCA. En raison de sa surface spécifique élevée et de son hydrophobicité, plus de 70,6 % des antigènes fluidiques ont été adsorbés sur le PNPE en 1 h, ce qui indique un potentiel important de chargement de grandes quantités d’antigènes en peu de temps. En tant que groupe témoin, les PMP et l’ESS ont également été caractérisés. Les PGR étaient de taille comparable (1987 ± 310 nm) au PNPE. Le SSE était une émulsion chargée négativement (-15,9 ± 0,8 mV) avec un diamètre de 147,2 ± 0,5 nm. De plus, l’efficacité de charge des PMP et de l’ESS n’était que de 25,6 % ± 0,6 % et 23,4 % ± 0,2 %, respectivement, en raison de l’adsorption limitée avec les antigènes (tableau supplémentaire 1). De plus, pour évaluer la stabilité du PNPE, les PNPE préparés ont été stockés à 4 °C et 25 °C, respectivement. La taille et le potentiel zêta de la solution mère ont été déterminés aux jours 0 à 6 (dilution de 1:50). Comme le montre la figure supplémentaire 2, les gouttelettes sont restées de taille similaire et le potentiel zêta pendant le stockage à 4 °C et 25 °C suggère une plus grande stabilité du PNPE pour l’administration d’antigènes. Ensuite, le QCM-D a été utilisé pour mesurer la flexibilité de PNPE. Comme le montre la figure 1G, en raison de sa structure rigide, les PMP présentaient une dissipation plus faible (ΔD). Dans le même temps, le PNPE avait un ΔD significativement plus élevé, démontrant son excellente viscoélasticité et flexibilité, ce qui peut être l’une des raisons de l’amélioration de la fixation et de l’absorption des cellules.
Pour valider l’affinité de la PNPE avec la membrane des BMDC, les bEV ont été utilisés pour remplacer les cellules intactes en raison de leur taille d’ajustement pour la détection précise de la QCM-D. Dans ce processus, les BMDC matures ont été récoltés et extrudés en série à travers des filtres à membrane en polycarbonate contenant des pores de 10, 5 et 1 μm pour des vésicules nanométriques préparées. Les VEV obtenues ont été collectées et purifiées par ultracentrifugation et remises en suspension dans une solution saline tamponnée HEPES (Figure 2A). La morphologie des bEV colorés négativement a ensuite été explorée à l’aide de la microscopie électronique à transmission (MET). Une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) a été utilisée pour tester la taille des VVE. Les résultats ont révélé que les VVE étaient des formes vésiculeuses lipido-bicouches fermées et que la distribution était homogène (Figure 2B). La NTA a montré que la distribution granulométrique des VHE avec le diamètre maximal des VÉV purifiés était de 131 nm (figure 2C). Nous avons donc conclu que les VEV étaient une structure membranaire typique avec une distribution uniforme, ce qui permettait une plus grande précision dans le test QCM-D en remplacement des BMDC.
Ensuite, l’adhérence des véhicules électriques biologiques à la PNPE a été suivie à l’aide de QCM-D. Tout d’abord, le capteur QCM-D SiO2 a été modifié avec PLL pour conférer une charge positive afin de fixer ensuite le PNPE à la surface et de simuler le processus de bio-interphase. Elle a été immédiatement suivie par l’ajout de la solution de VEV b) dans la chambre pour élucider l’interaction entre le PNPE et les EVVb (Figure 3A). Comme le montre la figure 3B, la diminution immédiate de la fréquence (ΔF) indique une adhésion rapide des EVb à la PNPE après la rencontre. De plus, la ΔF diminuait avec l’augmentation de la concentration de bEV, reflétant un effet dépendant de la concentration. La PNPE a une surface densément tassée pour soutenir le point d’atterrissage; de plus, il présentait des changements de courbure dynamiques et une diffusion latérale pour un contact cellulaire puissant, ce qui se traduisait par une forte affinité avec les BMDC. En revanche, les PMP et l’ESS étaient faiblement liés aux EVb, même à une concentration élevée (80 μg/mL), ce qui résultait probablement d’un manque de sites de contact avec les cellules immunitaires (Figure 3C).
Après avoir confirmé le processus d’adhésion aux BMDC, la PNPE a été utilisée pour délivrer l’antigène aux BMDC. Pour visualiser directement les profils d’internalisation de l’antigène in vitro, l’OVA marquée au Cy5 a été mélangée avec des PMP, des ESS et des PNPE pour traiter avec des BMDC, respectivement. Après 6 h post-traitement, le CLSM a été réalisé pour analyser l’absorption cellulaire de l’OVA marqué Cy5 dans les BMDC. Comme le montre la figure 4A, le signal de fluorescence Cy5-OVA indique que la quantité totale d’antigène internalisée dans les cellules est significativement plus élevée dans le groupe traité par PNPE que dans le groupe PMP et le groupe traité par ESS. L’analyse quantitative de l’absorption cellulaire a été effectuée plus avant, montrant une intensité relative de fluorescence significativement plus élevée dans les BMDC traités avec PNPE que chez ceux traités avec PMP et SSE (p < 0,001), ce qui corrobore l’observation ci-dessus (Figure 4B). Les résultats obtenus ont démontré que la PNPE favorisait l’internalisation de l’antigène et délivrait efficacement l’antigène par voie intracellulaire. Par conséquent, l’efficacité de l’absorption des antigènes était positivement associée à l’affinité du système de livraison avec les cellules ciblées, et la PNPE augmentait efficacement l’absorption cellulaire de l’antigène par contact à plusieurs niveaux avec la membrane cellulaire.
Figure 1 : Caractérisation de l’émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules PLGA. (A) Schéma de la procédure expérimentale utilisée pour la préparation des nanoparticules PLGA (PNP). (B) Images de PNP en microscopie électronique à balayage (MEB). Barre d’échelle = 200 nm. (C) Distribution granulométrique des PNP. (D) Schéma de la procédure expérimentale utilisée pour la préparation de l’émulsion de Pickering stabilisée par nanoparticules (PNPE). (E) Micrographies optiques de PNPE. Barre d’échelle = 20 μm. (F) Distribution granulométrique du PNPE. (G) Microbalance cristalline de quartz avec surveillance de la dissipation (QCM-D) analyse de la douceur du PNPE, des microparticules PLGA (PMP) et de l’émulsion stabilisée par surfactant (SSE) par détection de la dissipation (ΔD). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Caractérisation des vésicules extracellulaires biomimétiques. (A) Schéma de la procédure expérimentale utilisée pour la préparation des vésicules extracellulaires biomimétiques (VVE). (B) Images de microscopie électronique à transmission (MET) des véhicules électriques. Barre d’échelle = 200 nm. (C) Distribution granulométrique des VVE mesurées à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Affinité du PNPE aux VVE analysées à l’aide de QCM-D. (A) Schéma de la modification de la surface de la LPL par le revêtement PNPE. (B) Changements de fréquence (ΔF) de PNPE après avoir rencontré différentes concentrations de bEV. (C) Comparaison des changements de ΔF dans les microparticules PLGA (PMP), l’émulsion stabilisée par surfactant (SSE) et le PNPE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Absorption des antigènes. (A) Diagramme représentatif de l’absorption cellulaire des antigènes. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Fluorescence d’intensité relative de l’absorption cellulaire des antigènes. Le graphique montre la moyenne ± MEB de trois expériences indépendantes. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour analyser la signification des différences observées. p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : L’optimisation de la phase continue. (A) Micrographies optiques de PNPE construites par différentes phases continues. Barre d’échelle = 20 μm. (B) Les tailles des émulsions ont été détectées après la préparation. Les résultats ont été exprimés sous forme de MEB moyen ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Stabilité du PNPE. Taille (A) et potentiel zêta (B) de PNPE après 0, 3 et 6 jours de stockage aux températures indiquées. Les données ont été démontrées sous forme de MEB moyen ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Caractérisation des formulations. Les PNP, PNPE et SSE ont été préparés conformément au protocole indiqué. Les distributions granulométriques et le potentiel zêta ont été déterminés par l’analyseur dynamique de diffusion de la lumière (DLS) ou l’analyseur granulométrique Mastersizer. L’efficacité de chargement a été évaluée à l’aide du test BCA. Les données ont été démontrées sous forme de MEB moyen ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Nous avons développé une émulsion huile/eau stabilisée par nanoparticules PLGA comme système d’administration pour une internalisation améliorée de l’antigène. Le PNPE préparé possédait une surface densément tassée pour soutenir le point d’atterrissage et une douceur et une fluidité uniques pour un contact cellulaire puissant avec la membrane cellulaire immunitaire. En outre, l’interface huile/eau offrait une charge antigénique à haute teneur et la PLGA amphiphile conférait au PNPE une grande stabilité pour le transport des antigènes vers les cellules immunitaires. Le PNPE pourrait rapidement adhérer à la surface des cellules, ce qui indique que l’émulsion stabilisée par nanoparticules PLGA a une forte affinité avec la membrane cellulaire pour l’absorption cellulaire. En outre, le PNPE avait un profil d’innocuité élevé parce que le squalène et la PLGA sont des ingrédients approuvés par la Food and Drug Administration (FDA)30, ce qui devrait favoriser un transfert sûr dans la clinique.
Le poids moléculaire de la PLGA et le type de phases continues et dispersées ont affecté les propriétés du PNPE, y compris la stabilité et l’hydrophobicité. Dans cette recherche, des nanoparticules PLGA de poids moléculaire de 17 kDa ont été sélectionnées comme stabilisateur et le squalène comme phase dispersée, ce qui a entraîné une stabilité accrue. De plus, l’eau désionisée en phase continue a simplifié la composition de la formulation. Dans ces conditions, la PNPE a permis l’assemblage efficace des antigènes et a favorisé l’administration d’antigènes aux cellules immunitaires. En outre, la méthode de sonication en une étape a été utilisée pour préparer le PNPE, ce qui a éliminé le processus fastidieux et évité la possibilité de contamination. Il est essentiel de noter que le système d’administration composé de PNP et de squalène doit être une force uniforme, sinon aucune émulsion n’est formée ou le PNPE préparé n’est pas de taille uniforme.
Alors que l’étude de l’affinité du système de livraison aux cellules était un défi extraordinaire réalisé in vivo, les études in vitro pourraient aider à élucider le processus impliqué dans l’adhésion cellulaire et l’internalisation. Récemment, ce problème a attiré beaucoup d’attention dans le domaine biomédical. Des efforts substantiels ont été déployés pour faire la lumière sur l’affinité des particules avec les cellules en utilisant la cytométrie en flux et l’analyse CLSM31,32. Bien que ces méthodes fournissent une lecture moyenne au niveau cellulaire, les processus de liaison dynamique spécifiques entre les cellules et les systèmes d’administration ne sont pas faciles à surveiller. En revanche, QCM dépend principalement d’un cristal piézoélectrique sensible que le ΔF change avec la masse. La capacité de détecter des changements de masse infimes permet à QCM-D de surveiller les interactions moléculaires ciblées. La technique peut être utilisée pour surveiller des événements en temps réel, permettant l’étude de l’affinité de PNPE avec les BMDC dans différentes conditions33.
L’adhésion à la PNPE a été étudiée en utilisant des EVb au lieu de cellules intactes. En tant que simples APC bien contrôlés, on pense que les bEV héritent de la plupart des caractéristiques des cellules mères. En général, les vésicules extracellulaires avec des particules de petite taille homogène donnent de meilleurs résultats dans les tests d’adhésion. Ainsi, les bEV ont été préparés par extrusion à travers des filtres en polycarbonate avec des pores de 10, 5 et 1 μmde taille 34. Le diamètre et le rendement des véhicules électriques biologiques pourraient être contrôlés en régulant le nombre d’extrusions et la taille des pores des membranes en polycarbonate. Il est recommandé de faire 30 passages à travers les membranes en polycarbonate. Cependant, cette méthode avait également une limitation dans le fait que la partie de la membrane peut être inversée, ce qui a entraîné l’encapsulation des protéines à la surface DC dans les bEV, ce qui a légèrement diminué l’affinité avec les émulsions.
Il a été démontré que la modification des surfaces du capteur SiO2 à l’aide de protéines chargées positivement convenait au revêtement PNPE ultérieur. La mise en œuvre décrite de PLL (Polycation polypeptide) en tant que couche intermédiaire entre les surfaces du capteur SiO2 et le PNPE s’est avérée être une amélioration pour la méthode de revêtement rapide. Les changements de masse causés par un événement, par exemple des adsorptions non spécifiques de tout composant provenant du flux de solution sur le capteur SiO2 , pourraient affecter la précision des résultats expérimentaux35. Par conséquent, il était nécessaire de s’assurer que la LPL conservait une qualité constante sur la puce après le revêtement par centrisme et que leur surface serait complètement recouverte de PNPE pour éviter l’erreur de mesure causée par une adsorption non spécifique. Dans le même temps, lorsque ΔF ne changeait plus pendant le contact avec la phase mobile contenant du PNPE, la surface de la puce était considérée comme complètement recouverte. Cela a permis de s’assurer que les signaux détectés étaient générés par l’adhérence des véhicules électriques au PNPE. Nous avons démontré que la QCM-D était une bonne méthode pour montrer l’adhérence des VVE à la PNPE en temps réel, reflétant la forte affinité de la PNPE pour les APC. Malheureusement, cette méthode n’a pas pu refléter l’interaction entre les cellules individuelles et le système d’administration. Par conséquent, une détermination plus précise nécessitera une conception plus poussée du protocole et l’optimisation de la procédure de mesure.
Après avoir analysé la forte affinité de la PNPE pour les véhicules électriques, l’internalisation accrue a été vérifiée. Nous avons démontré que la puissante absorption cellulaire des antigènes était corrélée à la forte affinité de la PNPE. La PNPE possédait la structure à plusieurs niveaux pour une charge efficace des antigènes et la flexibilité pour un contact à plusieurs niveaux avec la membrane cellulaire afin d’améliorer la livraison. Par conséquent, l’émulsion de Pickering conçue rationnellement a stimulé l’internalisation cellulaire et les voies intracellulaires grâce à l’interaction robuste avec la membrane cellulaire. Après avoir démontré ces avantages, la PNPE pourrait faire la lumière sur la mise au point de systèmes d’administration d’antigènes nouveaux, sûrs et efficaces pour améliorer les vaccins.
Ce protocole a démontré avec succès la forte affinité de la PNPE pour la bicouche phospholipidique des cellules immunitaires et l’administration intracellulaire ultérieure de l’antigène aux cellules immunitaires in vitro. Par conséquent, divers types d’antigènes provenant de différents agents pathogènes peuvent être délivrés et caractérisés à l’aide du protocole proposé pour conférer une protection contre les maladies infectieuses.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet soutenu par le Programme national de recherche et de développement clé de Chine (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program de l’Académie chinoise des sciences (ZDBS-LY-SLH040), la Fondation pour les groupes de recherche innovants de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n ° 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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