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Bioengineering

एंटीजन आंतरिककरण को बढ़ावा देने के लिए कण-स्थिर इमल्शन का सेलुलर संबंध

Published: September 2, 2022 doi: 10.3791/64406
Automatic Translation
*1,2,3, *3,4, 3,4, 3, 1,2
1Graduate School of Bio-Applications and Systems Engineering, Tokyo University of Agriculture and Technology, 2Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 3State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, 4University of Chinese Academy of Sciences
* These authors contributed equally

Summary

तर्कसंगत रूप से कुशल सहायक डिजाइन करने के लिए, हमने पॉली-लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड नैनोपार्टिकल-स्टेबलाइज्ड पिकरिंग इमल्शन (पीएनपीई) विकसित किया। पीएनपीई के पास शक्तिशाली सेलुलर संपर्क के लिए अद्वितीय कोमलता और एक हाइड्रोफोबिक इंटरफ़ेस था और उच्च-सामग्री एंटीजन लोडिंग की पेशकश की, एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं के लिए वितरण प्रणाली के सेलुलर संबंध में सुधार किया और एंटीजन के कुशल आंतरिककरण को प्रेरित किया।

Abstract

नैनोकणों का सेलुलर संबंध सेलुलर मान्यता, सेलुलर अपटेक और सक्रियण के लिए पूर्व शर्त है, जो दवा वितरण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक हैं। वर्तमान अध्ययन इस अवलोकन से उपजा है कि सेल आत्मीयता पर ठोस कणों के चार्ज, आकार और आकार के प्रभावों पर आमतौर पर विचार किया जाता है, लेकिन हम शायद ही कभी सेलुलर आत्मीयता में कोमलता, गतिशील पुनर्गठन घटना और जटिल इंटरफ़ेस इंटरैक्शन की आवश्यक भूमिका का एहसास करते हैं। यहां, हमने पॉली-लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड (पीएलजीए) नैनोपार्टिकल-स्टेबलाइज्ड पिकरिंग इमल्शन (पीएनपीई) विकसित किया जो कठोर रूपों की कमियों को दूर करता है और रोगजनकों के लचीलेपन और तरलता का अनुकरण करता है। सेल सतहों के लिए पीएनपीई के संबंध का परीक्षण करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा बाद के आंतरिककरण पर विस्तार से चर्चा करने के लिए एक विधि स्थापित की गई थी। बायो-मिमेटिक एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी) के लिए पीएनपीई का संबंध - अस्थि मज्जा डेंड्राइटिक कोशिकाओं (बीएमडीसी) के प्रतिस्थापन - को अपव्यय निगरानी (क्यूसीएम-डी) के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस का उपयोग करके निर्धारित किया गया था, जिसने सेल-इमल्शन आसंजन की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति दी थी। इसके बाद, पीएनपीई का उपयोग एंटीजन (ओवलबुमिन, ओवीए) देने के लिए किया गया था और बीएमडीसी द्वारा एंटीजन के उत्थान को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम) का उपयोग करके देखा गया था। प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है कि PNPE ने BEVs का सामना करने पर तुरंत आवृत्ति (ΔF) को कम कर दिया, जो BMDCs के लिए PNPE के तेजी से आसंजन और उच्च संबंध का संकेत देता है। PNPE ने PLGA माइक्रोपार्टिकल्स (PMPs) और AddaVax सहायक (सर्फेक्टेंट-स्थिर नैनो-इमल्शन [SSE] के रूप में चिह्नित) की तुलना में कोशिका झिल्ली के लिए काफी मजबूत बंधन दिखाया। इसके अलावा, गतिशील वक्रता परिवर्तन और पार्श्व प्रसार के माध्यम से इम्युनोसाइट्स के लिए बढ़ी हुई सेलुलर आत्मीयता के कारण, एंटीजन अपटेक को बाद में पीएमपी और एसएसई की तुलना में बढ़ाया गया था। यह प्रोटोकॉल उच्च सेल आत्मीयता और कुशल एंटीजन आंतरिककरण के साथ नए फॉर्मूलेशन को डिजाइन करने के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जो कुशल टीकों के विकास के लिए एक मंच प्रदान करता है।

Introduction

महामारी, पुरानी और संक्रामक बीमारियों का मुकाबला करने के लिए, रोगनिरोधी और चिकित्सीय टीकाकरण के लिए प्रभावी सहायक विकसित करना अनिवार्य है। आदर्श रूप से, सहायक दवाओं में उत्कृष्ट सुरक्षा और प्रतिरक्षा सक्रियण 3,4,5 होना चाहिए। एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एपीआई) द्वारा एंटीजन के प्रभावी उत्थान और प्रक्रिया को डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग कैस्केड और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6,7,8 की शुरुआत में एक आवश्यक चरण माना जाता है। इसलिए, एंटीजन के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत के तंत्र की स्पष्ट समझ प्राप्त करना और आंतरिककरण को बढ़ाने के लिए सहायक दवाओं को डिजाइन करना टीकों की दक्षता को बढ़ाने के लिए कुशल रणनीतियां हैं।

अद्वितीय गुणों वाले माइक्रो-/नैनोकणों की पहले एंटीजन डिलीवरी सिस्टम के रूप में जांच की गई है ताकि एंटीजन के सेलुलर अपटेक और रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न 9,10 के साथ सेलुलर इंटरैक्शन को मध्यस्थ किया जा सके। कोशिकाओं के साथ संपर्क करने पर, वितरण प्रणाली बाह्य मैट्रिक्स और कोशिका झिल्ली के साथ बातचीत करना शुरू कर देती है, जिसके कारण आंतरिककरण और बाद में सेलुलर प्रतिक्रियाएं11,12 होती हैं। पिछले अध्ययनों ने प्रकाश में लाया है कि कणों का आंतरिककरण कोशिका झिल्ली-कण आसंजन13 के माध्यम से होता है, इसके बाद कोशिका झिल्ली का लचीला विरूपण और सतह झिल्ली14,15 में रिसेप्टर का प्रसार होता है। इन परिस्थितियों में, वितरण प्रणाली के गुण एपीआई के संबंध पर निर्भर करते हैं, जो बाद में अपटेक मात्रा16,17 को प्रभावित करते हैं।

बेहतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए वितरण प्रणाली के डिजाइन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए, कणों के गुणों और सेलुलर अपटेक के बीच संबंधों की जांच पर व्यापक प्रयास केंद्रित किए गए हैं। वर्तमान अध्ययन इस अवलोकन से उपजा है कि विभिन्न आवेशों, आकारों और आकृतियों के साथ ठोस सूक्ष्म / नैनोकणों का अध्ययन अक्सर इस प्रकाश में किया जाता है, जबकि एंटीजन आंतरिककरण में तरलता की भूमिका की शायद ही कभी जांच कीजाती है। वास्तव में, आसंजन के दौरान, नरम कणों ने बहुसंयोजक इंटरैक्शन के लिए संपर्क क्षेत्र को बढ़ाने के लिए गतिशील वक्रता परिवर्तन और पार्श्व प्रसार का प्रदर्शन किया, जिसे ठोसकणों 20,21 द्वारा शायद ही दोहराया जा सकता है। इसके अलावा, कोशिका झिल्ली अपटेक की साइट पर फॉस्फोलिपिड बाइलेयर (स्फिंगोलिपिड्स या कोलेस्ट्रॉल) हैं, और हाइड्रोफोबिक पदार्थ लिपिड के विरूपण एन्ट्रॉपी को बदल सकते हैं, जिससे सेलुलर अपटेक22,23 के लिए आवश्यक ऊर्जा की मात्रा कम हो जाती है। इस प्रकार, गतिशीलता को बढ़ाना और वितरण प्रणाली की हाइड्रोफोबिसिटी को बढ़ावा देना प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए एंटीजन आंतरिककरण को मजबूत करने के लिए एक प्रभावी रणनीति हो सकती है।

पिकरिंग इमल्शन, दो अपरिवर्तनीय तरल पदार्थों के बीच इंटरफ़ेस पर इकट्ठे ठोस कणों द्वारा स्थिर, जैविक क्षेत्र24,25 में व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। वास्तव में, तेल / पानी इंटरफ़ेस पर एकत्रित कण बहु-स्तरीय संरचनाओं के निर्माण को निर्धारित करते हैं, जो बहु-स्तरीय वितरण प्रणाली-सेलुलर इंटरैक्शन को बढ़ावा देते हैं, और आगे दवा वितरण में बहु-कार्यात्मक फिजियोकेमिकल गुणों को प्रेरित करते हैं। उनकी विकृति और पार्श्व गतिशीलता के कारण, पिकरिंग इमल्शन को इम्यूनोसाइट्स के साथ बहु-वैलेंट सेलुलर इंटरैक्शन में प्रवेश करने और झिल्ली प्रोटीन26 द्वारा मान्यता प्राप्त होने की उम्मीद थी। इसके अलावा, चूंकि पिकरिंग इमल्शन में तैलीय मिसेल कोर पूरी तरह से ठोस कणों से ढके नहीं होते हैं, पिकरिंग इमल्शन में तेल / पानी के इंटरफ़ेस पर कणों के बीच विभिन्न आकारों के अंतराल होते हैं, जो उच्च हाइड्रोफोबिसिटी का कारण बनते हैं। इस प्रकार, एपीसी के लिए पिकरिंग इमल्शन के संबंध का पता लगाना और कुशल सहायक विकसित करने के लिए बाद के आंतरिककरण पर विस्तार से बताना महत्वपूर्ण है।

इन विचारों के आधार पर, हमने एक तरलता वैक्सीन वितरण प्रणाली के रूप में एक पीएलजीए नैनोपार्टिकल-स्टेबलाइज्ड पिकरिंग इमल्शन (पीएनपीई) को इंजीनियर किया, जिसने बीएमडीसी और सेलुलर आंतरिककरण के लिए पीएनपीई के संबंध में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में भी मदद की। बायो-मिमेटिक एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी; बीएमडीसी का प्रतिस्थापन) के पीएनपीई में वास्तविक समय के आसंजन की निगरानी अपव्यय निगरानी (क्यूसीएम-डी) के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस का उपयोग करके लेबल-मुक्त विधि के माध्यम से की गई थी। बीएमडीसी के लिए पीएनपीई के संबंध के लक्षण वर्णन के बाद, एंटीजन अपटेक को निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) का उपयोग किया गया था। परिणाम ने बीएमडीसी के लिए पीएनपीई के उच्च संबंध और एंटीजन के कुशल आंतरिककरण का संकेत दिया। हमने अनुमान लगाया कि पीएनपीई एपीआई के लिए उच्च आत्मीयता प्रदर्शित करेगा, जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ाने के लिए एंटीजन के आंतरिककरण को बेहतर ढंग से उत्तेजित कर सकता है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी विधियों को इंस्टीट्यूट ऑफ प्रोसेस इंजीनियरिंग, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज द्वारा अनुमोदित किया गया है। सभी पशु प्रयोग प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए विनियमों और पशु की नैतिक समीक्षा के लिए दिशानिर्देश (चीन, जीबी / टी 35892-2018) के अनुसार सख्ती से किए गए थे।

1. पीएलजीए नैनोकणों की तैयारी और लक्षण वर्णन

  1. पीएलजीए नैनोकणों (पीएनपी) की तैयारी
    1. 90 डिग्री सेल्सियस पर 120 एमएल विआयनीकृत पानी में 0.5 ग्राम पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) जोड़ें और पीवीए समाधान तैयार करने के लिए पूरी तरह से घुलने तक हिलाएं। कमरे के तापमान पर ठंडा होने के बाद समाधान को रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
    2. तेल चरण के रूप में सेवा करने के लिए एसीटोन और इथेनॉल मिश्रण (4: 1 का अनुपात) के 10 एमएल में पीएलजीए के 100 मिलीग्राम जोड़ें।
    3. फ्यूम हुड के नीचे 20 एमएल पीवीए जलीय घोल रखें और 400 आरपीएम / मिनट पर चुंबकीय रूप से हिलाएं। सिरिंज पंप का उपयोग करके पीवीए समाधान ड्रॉप में तेल चरण के 5 एमएल जोड़ें। फिर, मिश्रण को फ्यूम हुड में हिलाएं जब तक कि कार्बनिक सॉल्वैंट्स पूरी तरह से वाष्पित न हो जाएं।
      नोट: तेल चरण में कणों की एकाग्रता में वृद्धि के साथ, जल चरण समाधान धीरे-धीरे एक स्पष्ट और पारदर्शी हल्के नीले-सफेद या दूधिया सफेद में बदल जाता है।
    4. कार्बनिक सॉल्वैंट्स (2-3 घंटे) के वाष्पीकरण के बाद, मिश्रण को 15,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। तीन या अधिक बार धोएं जब तक कि अंतिम धोने का पानी स्पष्ट और पारदर्शी न हो जाए।
      नोट: इस कदम का उद्देश्य मुख्य रूप से कण की सतह पर अवशिष्ट पीवीए को धोना है ताकि इसे पिकरिंग इमल्शन तैयारी को प्रभावित करने से रोका जा सके।
    5. धोए गए पीएनपी को 2 एमएल विआयनीकृत पानी में फिर से निलंबित कर दिया और मिश्रण को 24 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दिया। इसके बाद कणों को 48-72 घंटे के लिए लियोफिलाइज़र में फ्रीज-सुखाएं। तैयार पीएनपी सफेद झुंड हैं।
  2. पीएनपी के लक्षण वर्णन
    1. पीएनपी के आकार और ज़ेटा क्षमता को चिह्नित करने के लिए, 1 एमएल विआयनीकृत पानी में 10 μL PNPs जोड़ें ताकि डिल्यूएंट समाधान प्राप्त किया जा सके और डिल्यूएंट समाधान को DTS1070 सेल में स्थानांतरित किया जा सके। कंप्यूटर और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषक (DLS) पर स्विच करें, फिर DTS1070 सेल को DLS सिस्टम में रखें।
    2. Zeta आकार सॉफ़्टवेयर पर क्लिक करें और निर्धारण प्रक्रिया सेट करने के लिए एक नई माप फ़ाइल बनाएँ। फिर, कण आकार और जेटा संभावित वितरण प्राप्त करने के लिए निर्धारण प्रक्रिया शुरू करें।
    3. पीएनपी आकृति विज्ञान का निरीक्षण करने के लिए, समान रूप से 0.1 एमएल पीएनपी समाधान (40 बार पतला) को 5 सेमी x 5 सेमी टिन पन्नी शीट पर फैलाएं और पानी को रात भर अच्छी तरह से छिद्रित फ्यूम हुड में स्वाभाविक रूप से वाष्पित होने दें।
    4. टिन पन्नी के एक छोटे से हिस्से को काटें और इसे प्रवाहकीय टेप के साथ नमूना तालिका पर सुरक्षित करें। इसे 120 सेकंड के लिए 10 mA की धारा पर सोने के साथ स्प्रे करें। इसके बाद स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) का उपयोग करके नमूने की सतह आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।

2. पीएनपीई की तैयारी और लक्षण वर्णन

  1. पीएनपीई तैयार करने के लिए, 4 मिलीग्राम / एमएल (जलीय चरण) की एकाग्रता पर विआयनीकृत पानी में फ्रीज-सूखे पीएनपी जोड़ें और फिर तेल चरण के रूप में स्क्वालेन जोड़ें। एक पानी स्नान सोनिकेटर में 100 डब्ल्यू पर 5 मिनट के लिए एक-चरण सोनिकेशन के माध्यम से पीएनपीई तैयार करें। तेल-पानी चरण अनुपात 1: 9 है।
  2. तैयार PNPE का लक्षण वर्णन
    1. मास्टरसाइज़र 2000 सॉफ्टवेयर और लेजर को अनुक्रम में खोलें। पूर्व-निर्धारित प्रोग्राम खोलने के लिए माप पर क्लिक करें और नमूना नाम सेट करें। नमूने की पृष्ठभूमि को मापना शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें, फिर, ड्रॉपर का उपयोग करके, समानांतर में तीन बार इमल्शन के कण आकार को मापने के लिए लेजर कण आकार विश्लेषक के नमूना टैंक में 1 एमएल पीएनपीई जोड़ें।
    2. 1 एमएल विआयनीकृत पानी में पीएनपीई के 20 μL को पतला करें। स्लाइड पर इमल्शन के 20 μL गिराएं। 40x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके इमल्शन की आकृति विज्ञान और समरूपता का निरीक्षण करें और तस्वीरें प्राप्त करें।
  3. एंटीजन लोडिंग दक्षता
    1. 500 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 200 μg ओवलबुमिन (OVA) को भंग करें। फिर इसे तैयार पीएनपीई के 500 एमएल के साथ मिलाएं और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए हिलाएं। 20 मिनट के लिए 5000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा द्रव एंटीजन को हटा दें।
    2. 27. बिसिनकोनिनिक एसिड (बीसीए) का उपयोग करके द्रव एंटीजन सांद्रता निर्धारित करें। एंटीजन लोडिंग दक्षता की गणना के लिए सूत्र निम्नानुसार है:
      एंटीजन लोडिंग दक्षता = Equation 1
      नियंत्रण समूह के रूप में उपयोग किए जाने वाले एसएसई की एंटीजन लोडिंग दक्षता निर्धारित करने के लिए एक ही विधि का उपयोग करें।
  4. PNPE की स्थिरता
    1. तैयार PNPE के 6 mL को छह बराबर भागों में विभाजित करें, और क्रमशः 4 °C और 25 °C पर तीन भागों को स्टोर करें। दिन 0, 3 और 6 पर 1 एमएल विआयनीकृत पानी (1:50) में संग्रहीत पीएनपीई के 20 μL को पतला करें। फिर, विभिन्न तापमानों पर रखे गए पीएनपीई स्टॉक समाधानों के आकार और जेटा क्षमता को मापें।
      नोट: विभिन्न भंडारण तापमान पीएनपीई की स्थिरता पर विभिन्न तापमानों के प्रभाव की तुलना करने के लिए सेट हैं, जो उच्च स्थिरता और लंबी शेल्फ जीवन के लिए भंडारण स्थिति को अनुकूलित कर सकता है।
  5. पीएलजीए माइक्रोपार्टिकल्स (पीएमपी) की तैयारी
    1. तेल चरण के रूप में 5 एमएल डाइक्लोरोमेथेन में 500 मिलीग्राम पीएलजीए को घोलें, और फिर तेल / पानी मिश्रण प्राप्त करने के लिए 1.5% पीवीए युक्त 50 एमएल बाहरी जलीय चरण में डालें। मोटे इमल्शन प्राप्त करने के लिए होमोजेनाइज़र का उपयोग करके मिश्रण को 1 मिनट के लिए 3000 आरपीएम पर समरूप करें।
    2. झिल्ली पायसीकरण द्वारा माइक्रोसेफर्स (मोटे-इमल्शन द्वारा निर्धारित) के पीएलजीए कण आकार की एकरूपता बनाए रखें। झिल्ली ट्यूब में 5.2 μm झिल्ली स्थापित करें। दबाव को 800 kPa में समायोजित करें और स्थिर रखें।
    3. निकास वाल्व और फ़ीड वाल्व खोलें, और नमूना टैंक में मोटे-इमल्शन जोड़ने के बाद, निकास वाल्व और फ़ीड वाल्व को बंद करें, निर्वहन वाल्व और इनलेट वाल्व खोलें, और 200 एमएल बीकर में पोस्ट-फिल्म इमल्शन लें। प्री-डबल इमल्शन प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
    4. माइक्रोसेफर्स को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर डाइक्लोरोमेथेन को वाष्पित करने के लिए प्री-डबल इमल्शन को हिलाएं। 7741 x g पर विआयनीकृत पानी का उपयोग करके माइक्रोसेफर्स को 3 मिनट के लिए पांच बार धोएं। -80 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में प्री-फ्रीज और अंत में सूखे माइक्रोसेफर्स हासिल करने के लिए फ्रीज-ड्राई।
  6. पीएमपी के लक्षण वर्णन
    1. मास्टरसाइज़र 2000 सॉफ्टवेयर और लेजर को अनुक्रम में खोलें। पूर्व-निर्धारित प्रोग्राम खोलने के लिए माप पर क्लिक करें और नमूना नाम सेट करें। नमूने की पृष्ठभूमि को मापना शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें। फिर, ड्रॉपर के साथ लेजर कण आकार विश्लेषक के टैंक को जोड़ने वाले नमूने में 1 एमएल पीएमपी जोड़ें और समानांतर में तीन बार माइक्रोपार्टिकल्स के कण आकार को मापें।
  7. कोमलता विश्लेषण
    नोट: पीएनपीई को कोमलता को मापने के लिए एसआईओ2 सेंसर पर लेपित किया गया था।
    1. यूवी-ओजोन उपचार द्वारा एसआईओ2 क्वार्ट्ज सेंसर चिप को 10 मिनट के लिए साफ करें, 5 एमएल इथेनॉल (75% वी / वी) के साथ दो बार कुल्ला करें, और एन2 के साथ सुखाएं। खाली एसआईओ2 क्वार्ट्ज सेंसर चिप को प्रवाह सेल में स्थापित करें।
    2. कंप्यूटर चालू करें और सॉफ्टवेयर के निचले दाईं ओर तापमान नियंत्रण को सक्रिय करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि सेट तापमान कमरे के तापमान से लगभग 1 डिग्री सेल्सियस नीचे है।
    3. टूलबार में अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें और उपयोग किए गए चैनल में चिप के 1, 3, 5, 7, 9 और 11 ऑक्टेव्स की खोज के लिए सेटअप माप का चयन करें। उपकरण पट्टी में अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें और मापन प्रारंभ करें का चयन करें.
    4. आधार रेखा को हवा के साथ सही करें, और जब बेसलाइन संतुलित हो, तो रोकें का चयन करें और फ़ाइल को रिक्त स्थान के रूप में सहेजें।
    5. चिप पर पीएनपीई के 10 μg / mL चिप और स्पिन कोट को साफ करें। संक्षेप में, स्पिन कोटर चालू करें और ऑपरेटिंग पैरामीटर सेट करें। एन2 पाइप को स्पिन कोटर से कनेक्ट करें, गैस सिलेंडर के विभाजन को 0.4 केपीए में समायोजित करें, और स्पिन कोटर के सक्शन कप पर साफ चिप रखें। SiO2 सेंसर के केंद्र में PNPE ड्रॉपवाइज का 100 μL जोड़ें और कोटिंग को पूरा करने के लिए स्पिन कोटर के शीर्ष कवर को बंद करें।
    6. प्रवाह सेल में पीएनपीई लेपित चिप स्थापित करें। चरण 2.7.3-2.7.4 दोहराएँ और फ़ाइल को PNPE के रूप में सहेजें। रिक्त और पीएनपीई दोनों फ़ाइलों को खोलें और अपव्यय (ऍडी) के संबंधित डेटा प्राप्त करने के लिए स्टिच बटन पर क्लिक करें।

3. पृथक और संस्कृति बीएमडीसी 28

नोट: सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मकों और नमूनों को बर्फ पर रखा गया है, क्योंकि इसका सेल गतिविधि पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। बाँझपन बनाए रखने के लिए, बाँझ बर्तनों का उपयोग करके एक अल्ट्रा-क्लीन बेंच पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें।

  1. सी 57बीएल /6 (महिला, 6-8 सप्ताह पुराने) चूहों को सीओ2 साँस के माध्यम से इच्छामृत्यु करें और उन्हें संक्षिप्त नसबंदी के लिए इथेनॉल 70% (वी / वी) में भिगोदें।
  2. 3-5 मिनट के लिए भिगोने के बाद, चूहों को एक सुपर क्लीन बेंच पर स्थानांतरित करें। फीमर और टिबिया को उजागर करने के लिए स्टेनलेस-स्टील कैंची का उपयोग करके पैर की मांसपेशियों को हटा दें, और फिर फीमर और टिबिया को अलग करें।
  3. एक पेट्री डिश को 70% (v / v) इथेनॉल के साथ भरें और बाहरी नसबंदी को पूरा करने के लिए इसमें साफ हड्डियों को 5-10 सेकंड के लिए भिगोदें। सभी हड्डियों को साफ करें और उन्हें उनके चारों ओर बर्फ के साथ एक बाँझ ट्यूब में रखें।
  4. कैंची का उपयोग करके जोड़ के करीब फीमर और टिबिया को ट्रिम करें। पूर्व-ठंडा आरपीएमआई माध्यम (1640) का उपयोग करके अस्थि मज्जा को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में बाहर निकालने के लिए हड्डी में सिरिंज सुई डालें।
  5. दो या तीन बार कुल्ला करें जब तक कि हड्डी पूरी तरह से सफेद न हो जाए। सभी झुरमुट को अलग करने के लिए अस्थि मज्जा को कई बार पिपेट करें। कोशिकाओं को 40 μm व्यास छलनी का उपयोग करके 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  6. सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर और 5 मिनट के लिए 500 x g । सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और 4 मिनट के लिए तलछट में 2 एमएल एरिथ्रोसाइट लाइसेट जोड़ें।
  7. दो या तीन बार धोने के बाद, कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के 2 एमएल (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, आईएल -4 के 20 एनजी / एमएल, और जीएम-सीएसएफ के 10 एनजी / एमएल) में फिर से निलंबित करें। फिर, पीबीएस के 1 एमएल में 10 μL कोशिकाओं को पतला करें और सेल गिनती के लिए सेल कमजोर पड़ने में हैंडहेल्ड स्वचालित सेल काउंटर की चिप डालें। अंत में, 1 x 106 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर बीज कोशिकाएं एक पूर्ण माध्यम के साथ 10 मिमी कल्चर डिश में।
  8. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ सेल इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को कल्चर करें। हर 2 दिन में माध्यम बदलें। दिन 7 पर, कोशिकाओं को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।

4. बायो-मिमेटिक एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी) की तैयारी

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार मिनी-एक्सट्रूडर को अनुक्रम में इकट्ठा करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज आवास का उपयोग करने से पहले क्रैक न किया गया हो। सुनिश्चित करें कि हर प्रयोग से पहले सभी ओ-रिंग अच्छी स्थिति में हैं और घिसे हुए या क्षतिग्रस्त लोगों को तुरंत बदलें। घिसे हुए या क्षतिग्रस्त ओ-रिंग एक्सट्रूडर का संचालन करते समय अचानक दबाव रिलीज का कारण बन सकते हैं।
  2. बीएमडीसी को बार-बार एस्पिरेट करें और उन्हें सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 450 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं की कटाई करें। मिनी-एक्सट्रूडर29 का उपयोग करके 30 पास के लिए 10 μm, 5 μm, और 1 μm पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से सेल निलंबन को दबाएं।
    नोट: बीईवी आकार एकरूपता को सक्षम करने के लिए, बीएमडीसी निलंबन को 30 पास के लिए 10 μm, 5 μm, और 1 μm पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से धकेल दिया गया था। इसके अतिरिक्त, ऑपरेशन के दौरान, समान रूप से बल लागू करना सुनिश्चित करें और सिरिंज की धुरी के साथ बल की दिशा बनाए रखें।
  3. कोशिकाओं को हटाने के लिए 1000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए पूल किए गए सुपरनैटेंट को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें और शेष कोशिकाओं और सेल मलबे को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 3000 x g पर इसे सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाला इकट्ठा करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए 100,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाला छोड़ दें और 2 एमएल एचईपीईएस-बफर्ड सेलाइन (एचबीएस) में बीईवी को फिर से निलंबित करें। 0.45 μm झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन के माध्यम से bEVs को शुद्ध करें और शुद्ध bEV को -80 °C पर स्टोर करें।

5. बीईवी पीएनपीई का पालन करते हैं

नोट: एसआईओ2 सेंसर को स्पिन-कोटिंग विधि के माध्यम से संशोधित किया गया था।

  1. एसआईओ2 सेंसर पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) के साथ संशोधित।
    1. यूवी-ओजोन उपचार का उपयोग करके एसआईओ2 क्वार्ट्ज सेंसर चिप को 10 मिनट के लिए साफ करें, इथेनॉल के साथ दो बार कुल्ला करें, और एन 2 के साथसुखाएं।
    2. पावर बटन दबाकर स्पिन कोटर चालू करें, नियंत्रण बटन दबाएं, और कोटिंग समय और गति सेट करें। प्रारंभिक रोटेशन गति 400 आरपीएम है, जिसे लगातार 5000 आरपीएम तक बढ़ाया जाता है।
    3. एन2 पाइप को स्पिन कोटर से कनेक्ट करें और गैस सिलेंडर के विभाजन को 0.4 केपीए में समायोजित करें। स्पिन कोटर के सक्शन कप पर साफ चिप रखें। एसआईओ2 सेंसर के केंद्र में 100 μL PLL ड्रॉपवाइज जोड़ें और स्पिन कोटर के शीर्ष कवर को बंद करें।
    4. नमूना कोटिंग शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं और समाप्त होने पर मशीन को रोकें। वैक्यूम पंप को बंद करें, पावर और कंट्रोल बटन बंद करें, और पीएलएल-संशोधित एसआईओ2 सेंसर को हटा दें।
      नोट: प्रारंभ दबाने से पहले, सुनिश्चित करें कि कोटिंग समय और गति सेट की गई है। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि SiO2 सेंसर सक्शन कप के केंद्र में रखा गया है। सुनिश्चित करें कि दुर्घटनाओं को रोकने के लिए प्रक्रिया चलाने से पहले ढक्कन बंद है।
  2. पीएनपीई के लिए बीईवी के आसंजन का निर्धारण
    1. कंप्यूटर, इलेक्ट्रॉनिक इकाई, पेरिस्टालिक पंप चालू करें, और यह सुनिश्चित करने के लिए सॉफ्टवेयर में नीचे दाईं ओर तापमान नियंत्रण को सक्रिय करें कि निर्धारित तापमान कमरे के तापमान से लगभग 1 डिग्री सेल्सियस नीचे है।
    2. ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार फ्लो सेल में पीएलएल-संशोधित एसआईओ2 सेंसर रखें और फ्लो सेल और फ्लो पंप के बीच माप रेखा को कनेक्ट करें। प्रवाह मॉड्यूल प्रणाली के अंदर प्रवाह सेल रखें और प्रयोगशुरू करने से पहले उन्हें अल्ट्राप्योर पानी से कुल्ला करें।
    3. अधिग्रहण टूलबार पर क्लिक करें और उपयोग किए गए चैनल में चिप के 1, 3, 5, 7, 9 और 11 ऑक्टेव्स की खोज के लिए सेटअप माप का चयन करें। बेसलाइन को सही करने के लिए, स्टार्ट मेजरमेंट पर क्लिक करें ताकि हवा को प्रवाह मॉड्यूल में प्रवेश करने की अनुमति मिल सके जब तक कि एयर बेसलाइन चिकनी न हो। इसके बाद, समाधान बेसलाइन संतुलन को फिर से सक्षम करने के लिए 10-15 मिनट के लिए विआयनीकृत पानी का प्रवाह करें।
    4. एसआईओ 2 सेंसर पर संतुलन सोखना प्राप्त करने के लिए 50 μL / min की प्रवाह दर पर तैयार PNPE समाधान कोप्रवाह मॉड्यूल में पंप करें।
      नोट: जब पीएनपीई को फिर से प्रवाह मॉड्यूल में पंप किया जाता है, तो एएफ अब नहीं बदलता है, यह दर्शाता है कि एसआईओ2 सेंसर की सतह पूरी तरह से पीएनपीई के साथ कवर की गई है।
    5. पीएनपीई सतह पर बीईवी आसंजन की प्रक्रिया को ट्रैक करने के लिए 50 μL / min की प्रवाह दर पर प्रवाह मॉड्यूल में तैयार बीईवी समाधान पंप करें।

6. एंटीजन अपटेक का सीएलएसएम विश्लेषण

  1. बीएमडीसी के साथ सह-संस्कृति पीएनपीई-ओवीए
    1. बीएमडीसी को 7 दिनों के लिए 1640 पूर्ण मीडिया (1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, आईएल -4 के 20 एनजी / एमएल, और जीएम-सीएसएफ के 10 एनजी / एमएल) के साथ इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 x 106 प्रति कुएं पर छोटे कॉन्फोकल लेजरव्यंजनों में बीज दें।
    2. 1 घंटे के लिए 0.5 एमएल साइ5-लेबल ओवीए (400 μg/mL) को PNPE के 0.5 mL के साथ मिलाएं और वैक्सीन निर्माण विकसित करने के लिए 20 मिनट के लिए 5000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा द्रव एंटीजन को हटा दें। 200 μL विआयनीकृत पानी के साथ फिर से निलंबन के बाद, एक सुपर-क्लीन बेंच के तहत छोटे कॉन्फोकल लेजर व्यंजनों में 10 μL फॉर्मूलेशन (10 μg / mL OVA) जोड़ें और 6 घंटे के लिए BMDCs के साथ सह-संस्कृति करें।
  2. एक्टिन साइटोस्केलेटन दाग
    1. कोशिकाओं से कल्चर तरल पदार्थ को हटा दें और उन्हें पूर्व-गर्म फॉस्फेट बफर्ड खारा (पीबीएस; पीएच 7.4) के साथ दो बार धोएं।
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। निर्धारण के दौरान, मेथनॉल युक्त फिक्सेटिव से बचें, जो एक्टिन को नष्ट कर सकता है।
    3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दो या तीन बार धोएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 समाधान के 100 μL के साथ कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर दो या तीन बार 10 मिनट के लिए फिर से धोएं।
    4. छोटे कॉन्फोकल लेजर व्यंजनों के ग्लास-बॉटम डिश पर कोशिकाओं को 200 μL फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -संयुग्मित फेलोइडिन वर्किंग सॉल्यूशन के साथ कवर करें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। पृष्ठभूमि संकेत को कम करने के लिए, एफआईटीसी-संयुग्मित फेलोइडिन कामकाजी समाधान में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन जोड़ें। इसके अलावा, समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए इनक्यूबेशन के दौरान छोटे कॉन्फोकल लेजर व्यंजनों के ढक्कन को कवर करें।
    5. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए धोएं। लगभग 30 सेकंड के लिए 200 μL DAPI समाधान (एकाग्रता: 100 nM) के साथ नाभिक को फिर से दाग दें।
  3. छवि विश्लेषण
    1. अनुक्रम में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप हार्डवेयर पर स्विच करें, जिसमें लेजर, कॉन्फोकल, माइक्रोस्कोप और कंप्यूटर शामिल हैं। एनआईएस-तत्व एआर 5.20.00 सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें और परीक्षण प्रणाली में प्रवेश करने के लिए Nikon Confocal का चयन करें।
    2. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप प्रणाली में, नोट किए गए क्रम में विभिन्न इकाइयों को चालू करें। सबसे पहले, एफआईटीसी, DAPI और Cy5 चैनल स्थापित करें और संबंधित HV और ऑफसेट को समायोजित करें। फिर, 100x तेल लेंस का चयन करें और शीर्ष पर देवदार के तेल की एक बूंद डालें। माइक्रोस्कोप स्टेज पर दाग वाले बीएमडीसी युक्त छोटे कॉन्फोकल लेजर व्यंजन रखें।
    3. स्कैन बटन क्लिक करें। एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत, एक्स-अक्ष, वाई-अक्ष और जेड-अक्ष को स्थानांतरित करके रुचि की कोशिकाओं का पता लगाएं। उच्च गुणवत्ता वाले कॉन्फोकल छवियों को स्कैन करने में सक्षम करने के लिए लेजर तीव्रता, छवि आकार और अन्य मापदंडों को ट्यून करें। अंत में, कैप्चर बटन पर क्लिक करें और छवियों को सहेजें।

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Representative Results

पीएनपीई प्राप्त करने के लिए एक साधारण एक-चरण सोनिफिकेशन का उपयोग किया गया था। सबसे पहले, हमने ठोस स्टेबलाइजर (चित्रा 1 ए) के रूप में उपयोग के लिए समान पीएनपी तैयार किए। पीएनपी की आकृति विज्ञान एसईएम के माध्यम से देखा गया था, यह दर्शाता है कि वे ज्यादातर समान और गोलाकार हैं (चित्रा 1 बी)। डीएलएस के माध्यम से फॉर्मूलेशन के हाइड्रोडायनामिक आकार और जेटा क्षमता का पता लगाया गया था। पीएनपी का व्यास 187.7 ± 3.5 एनएम था और जेटा क्षमता -16.4 ± 0.4 एमवी (चित्रा 1 सी और पूरक तालिका 1) थी। पीएनपीई तैयार करने के लिए, पीएनपी समाधान (0.4%, डब्ल्यू / वी) और स्क्वालेन के मिश्रण को 5 मिनट के लिए 100 डब्ल्यू पर बस सोनिक किया गया था (चित्रा 1 डी)। निरंतर चरण के अनुकूलन के बाद, प्राप्त पीएनपीई आंतरिक रूप से स्क्वालेन से बना था और बाहरी रूप से पीएनपी (पूरक चित्रा 1) के साथ अधिशोषित था। इमल्शन बूंदों का निरीक्षण करने के लिए एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप नियोजित किया गया था, और आकार वितरण निर्धारित करने के लिए मास्टर्साइज़र कण आकार विश्लेषक का उपयोग किया गया था। पीएनपीई ने इमल्शन के सहवास को रोकने के लिए कोई कम कणों का प्रदर्शन नहीं किया और निरंतर चरण में अधिक कणों को अधिक नहीं दिखाया जो बड़े समुच्चय का कारण बनता है (चित्रा 1 ई)। जैसा कि चित्र 1 एफ और पूरक तालिका 1 में दिखाया गया है, इमल्शन का आकार 2100 ± 300 एनएम था और जेटा क्षमता -27.1 ± 0.5 एमवी थी, यह दर्शाता है कि कण तेल / पानी इंटरफ़ेस पर एकत्रित होते हैं। एंटीजन के सेलुलर अपटेक का निरीक्षण करने के लिए, Cy5-labed OVA को PNPE पर अधिशोषित किया गया था। शुरू करने के लिए, पीएनपीई के 500 μL को 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 500 μL Cy5-लेबल OVA के साथ मिलाया गया था। बीसीए परख का उपयोग करके फॉर्मूलेशन पर एंटीजन के अवशोषण का परीक्षण किया गया था। इसके उच्च विशिष्ट सतह क्षेत्र और हाइड्रोफोबिसिटी के कारण, 70.6% से अधिक द्रव एंटीजन 1 घंटे के भीतर पीएनपीई पर अधिशोषित किए गए थे, जो कम समय में बड़ी मात्रा में एंटीजन लोड करने के लिए पर्याप्त क्षमता का संकेत देते हैं। नियंत्रण समूह के रूप में, पीएमपी और एसएसई को भी विशेषता दी गई थी। पीएमपी आकार (1987 ± 310 एनएम) में पीएनपीई के बराबर थे। एसएसई को 147.2 ± 0.5 एनएम के व्यास के आकार के साथ नकारात्मक रूप से चार्ज इमल्शन (-15.9 ± 0.8 एमवी) किया गया था। इसके अतिरिक्त, एंटीजन के साथ सीमित सोखना के कारण पीएमपी और एसएसई की लोडिंग दक्षता क्रमशः 25.6% ± 0.6% और 23.4% ± 0.2% थी (पूरक तालिका 1)। इसके अतिरिक्त, पीएनपीई की स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, तैयार पीएनपीई को क्रमशः 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था। स्टॉक समाधान का आकार और ज़ेटा क्षमता 0-6 दिनों (1: 50 कमजोर पड़ने) पर निर्धारित की गई थी। जैसा कि पूरक चित्र 2 में दिखाया गया है, बूंदें आकार में समान रहीं और 4 डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के दौरान जेटा क्षमता ने एंटीजन के वितरण के लिए पीएनपीई की उच्च स्थिरता का सुझाव दिया। तब क्यूसीएम-डी का उपयोग पीएनपीई के लचीलेपन को मापने के लिए किया गया था। जैसा कि चित्रा 1 जी में दिखाया गया है, इसकी कठोर संरचना के परिणामस्वरूप, पीएमपी ने कम अपव्यय (ऌडी) का प्रदर्शन किया। उसी समय, पीएनपीई में काफी अधिक एएचडी था, जो इसकी उत्कृष्ट विस्कोस्टिकिटी और लचीलेपन का प्रदर्शन करता है, जो बेहतर सेल लगाव और उत्थान के कारणों में से एक हो सकता है।

बीएमडीसी झिल्ली के लिए पीएनपीई के संबंध को मान्य करने के लिए, बीईवी का उपयोग सटीक क्यूसीएम-डी का पता लगाने के लिए उनके फिटिंग आकार के कारण बरकरार कोशिकाओं को बदलने के लिए किया गया था। इस प्रक्रिया में, परिपक्व बीएमडीसी को पॉली कार्बोनेट झिल्ली फिल्टर के माध्यम से काटा और क्रमिक रूप से बाहर निकाला गया, जिसमें नैनो-आकार के पुटिकाओं को तैयार करने के लिए 10, 5 और 1 μm छिद्र आकार शामिल थे। प्राप्त बीईवी को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से एकत्र और शुद्ध किया गया था और एचईपीईएस बफर्ड खारा (चित्रा 2 ए) में फिर से निलंबित किया गया था। नकारात्मक दाग वाले बीईवी की आकृति विज्ञान को तब ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का उपयोग करके खोजा गया था। बीईवी के आकार का परीक्षण करने के लिए एक नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग किया गया था। परिणामों से पता चला कि बीईवी बंद लिपिड-बाइलेरेड वेसिकुलर रूप थे और वितरण सजातीय था (चित्रा 2 बी)। एनटीए ने दिखाया कि शुद्ध बीईवी के चरम व्यास वाले बीईवी का आकार वितरण 131 एनएम (चित्रा 2 सी) था। इस प्रकार हमने निष्कर्ष निकाला कि बीईवी एक समान वितरण के साथ एक विशिष्ट झिल्ली संरचना थी, जिसने बीएमडीसी के विकल्प के रूप में क्यूसीएम-डी परख में अधिक सटीकता की अनुमति दी।

इसके बाद, पीएनपीई के लिए बीईवी के आसंजन को क्यूसीएम-डी का उपयोग करके ट्रैक किया गया था। सबसे पहले, क्यूसीएम-डी एसआईओ2 सेंसर को पीएलएल के साथ संशोधित किया गया था ताकि बाद में सतह पर पीएनपीई को ठीक करने और जैव-इंटरफेज प्रक्रिया का अनुकरण करने के लिए सकारात्मक चार्ज प्रदान किया जा सके। इसके तुरंत बाद पीएनपीई और बीईवी (चित्रा 3 ए) के बीच बातचीत को स्पष्ट करने के लिए कक्ष में बीईवी समाधान जोड़ा गया। जैसा कि चित्रा 3 बी में दिखाया गया है, आवृत्ति (एएफ) में तत्काल कमी ने मुठभेड़ के बाद पीएनपीई के लिए बीईवी के तेजी से आसंजन का संकेत दिया। इसके अलावा, बीईवी एकाग्रता में वृद्धि के साथ एआईएफ में कमी आई, जो एकाग्रता-निर्भर प्रभाव को दर्शाता है। लैंडिंग स्पॉट का समर्थन करने के लिए पीएनपीई में एक घनी पैक सतह है; इसके अलावा, इसने शक्तिशाली सेलुलर संपर्क के लिए गतिशील वक्रता परिवर्तन और पार्श्व प्रसार का प्रदर्शन किया, जिसके परिणामस्वरूप बीएमडीसी के लिए उच्च संबंध था। इसके विपरीत, पीएमपी और एसएसई उच्च सांद्रता (80 μg / mL) पर भी bEV से कमजोर रूप से बंधे थे, जो संभवतः प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ संपर्क साइटों की कमी के परिणामस्वरूप हुआ (चित्रा 3 सी)।

बीएमडीसी के आसंजन की प्रक्रिया की पुष्टि करने के बाद, पीएनपीई का उपयोग बीएमडीसी को एंटीजन देने के लिए किया गया था। विट्रो में एंटीजन आंतरिककरण प्रोफाइल को सीधे कल्पना करने के लिए, Cy5-लेबल ओवीए को क्रमशः BMDCs के साथ इलाज करने के लिए PMPs, SSE और PNPE के साथ मिलाया गया था। 6 घंटे के पोस्ट-ट्रीटमेंट के बाद, बीएमडीसी में Cy5-लेबल ओवीए के सेलुलर अपटेक का विश्लेषण करने के लिए CLSM किया गया था। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, Cy5-OVA प्रतिदीप्ति संकेत ने संकेत दिया कि कोशिकाओं में आंतरिक एंटीजन की कुल मात्रा PMPs और SSE-उपचारित समूह की तुलना में PNPE-उपचारित समूह में काफी अधिक है। सेलुलर अपटेक का मात्रात्मक विश्लेषण आगे किया गया था, जो पीएमपी और एसएसई (पी < 0.001) के साथ इलाज किए गए लोगों की तुलना में पीएनपीई के साथ इलाज किए गए बीएमडीसी में फ्लोरेसेंस की काफी अधिक सापेक्ष तीव्रता दिखाता है, जिसने ऊपर दिए गए अवलोकन की पुष्टि की (चित्रा 4 बी)। प्राप्त परिणामों से पता चला कि पीएनपीई ने एंटीजन आंतरिककरण को बढ़ावा दिया और प्रभावी रूप से एंटीजन को इंट्रासेल्युलर रूप से वितरित किया। नतीजतन, एंटीजन की अपटेक दक्षता लक्षित कोशिकाओं के लिए वितरण प्रणाली आत्मीयता के साथ सकारात्मक रूप से जुड़ी हुई थी, और पीएनपीई ने कोशिका झिल्ली के साथ बहु-स्तरीय संपर्क के माध्यम से एंटीजन सेलुलर अपटेक को प्रभावी ढंग से बढ़ाया।

Figure 1
चित्र 1: पीएलजीए नैनोपार्टिकल-स्टेबलाइज्ड पिकरिंग इमल्शन का लक्षण वर्णन। (ए) पीएलजीए नैनोकणों (पीएनपी) की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (बी) पीएनपी की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) छवियां। स्केल बार = 200 एनएम। (ग) पीएनपी का आकार वितरण (घ) नैनोपार्टिकल-स्टेबलाइज्ड पिकरिंग इमल्शन (पीएनपीई) तैयार करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (ई) पीएनपीई के ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 20 μm. (F) PNPE का आकार वितरण। (छ) अपव्यय का पता लगाने के माध्यम से पीएनपीई, पीएलजीए माइक्रोपार्टिकल्स (पीएमपी) और सर्फैक्टेंट-स्टेबलाइज्ड इमल्शन (एसएसई) की कोमलता पर अपव्यय निगरानी (क्यूसीएम-डी) विश्लेषण के साथ क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: जैव-मिमेटिक बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं का लक्षण वर्णन। (ए) बायो-मिमेटिक एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी) की तैयारी के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध। (बी) बीईवी की ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) छवियां। स्केल बार = 200 एनएम। (सी) नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) (एन = 3) का उपयोग करके मापा गया बीईवी का आकार वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: क्यूसीएम-डी का उपयोग करके विश्लेषण किए गए बीईवी के लिए पीएनपीई की आत्मीयता (ए) पीएनपीई कोटिंग के माध्यम से पीएलएल सतह के संशोधन का योजनाबद्ध। (बी) बीईवी की विभिन्न सांद्रता के साथ सामना करने के बाद पीएनपीई की आवृत्ति (एएफ) में परिवर्तन। (ग) पीएलजीए माइक्रोपार्टिकल्स (पीएमपी), सर्फेक्टेंट-स्टेबलाइज्ड इमल्शन (एसएसई), और पीएनपीई में एयूएफ में परिवर्तन की तुलना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: एंटीजन का उत्थान। (ए) एंटीजन के सेलुलर अपटेक का प्रतिनिधि आरेख। स्केल बार = 20 μm. (B) एंटीजन के सेलुलर अपटेक की सापेक्ष तीव्रता प्रतिदीप्ति। ग्राफ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत ± एसईएम प्रदर्शित करता है। वन-वे एनोवा का उपयोग देखे गए मतभेदों के महत्व का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 1: निरंतर चरण का अनुकूलन। (ए) विभिन्न सतत चरणों द्वारा निर्मित पीएनपीई के ऑप्टिकल माइक्रोग्राफ। स्केल बार = 20 μm. (B) तैयारी के बाद इमल्शन के आकार का पता लगाया गया था। परिणाम एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में व्यक्त किए गए थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: पीएनपीई की स्थिरता। संकेतित तापमान पर भंडारण के 0, 3 और 6 दिनों के बाद पीएनपीई का आकार (ए) और जेटा क्षमता (बी)। डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रदर्शित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: योगों के लक्षण वर्णन। पीएनपी, पीएनपीई और एसएसई को संकेतित प्रोटोकॉल के अनुसार तैयार किया गया था। आकार वितरण और जेटा क्षमता गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषक (डीएलएस) या मास्टर्साइज़र कण आकार विश्लेषक द्वारा निर्धारित की गई थी। बीसीए परख का उपयोग करके लोडिंग दक्षता का मूल्यांकन किया गया था। डेटा को एसईएम (एन = 3) ± माध्य के रूप में प्रदर्शित किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमने पीएलजीए नैनोपार्टिकल-स्थिर तेल / जल इमल्शन को उन्नत एंटीजन आंतरिककरण के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में विकसित किया। तैयार पीएनपीई में लैंडिंग स्पॉट का समर्थन करने के लिए एक घनी पैक की गई सतह और प्रतिरक्षा कोशिका झिल्ली के साथ शक्तिशाली सेलुलर संपर्क के लिए अद्वितीय कोमलता और तरलता थी। इसके अलावा, तेल / पानी इंटरफ़ेस ने उच्च सामग्री एंटीजन लोडिंग की पेशकश की, और एम्फीफिलिक पीएलजीए ने प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एंटीजन के परिवहन के लिए उच्च स्थिरता के साथ पीएनपीई प्रदान किया। पीएनपीई तेजी से कोशिकाओं की सतह का पालन कर सकता है, यह दर्शाता है कि पीएलजीए नैनोपार्टिकल-स्थिर इमल्शन का सेलुलर उत्थान के लिए कोशिका झिल्ली के लिए एक मजबूत संबंध है। इसके अलावा, पीएनपीई में एक उच्च सुरक्षा प्रोफ़ाइल थी क्योंकि स्क्वालेन और पीएलजीए दोनों खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) अनुमोदित सामग्री30 हैं, जिससे क्लिनिक में सुरक्षित हस्तांतरण का लाभ उठाने की उम्मीद है।

पीएलजीए के आणविक भार और निरंतर और बिखरे हुए चरणों के प्रकार ने स्थिरता और हाइड्रोफोबिसिटी सहित पीएनपीई गुणों को प्रभावित किया। इस शोध में, 17 केडीए आणविक भार पीएलजीए नैनोकणों को स्टेबलाइजर और स्क्वालेन को फैलाव चरण के रूप में चुना गया था, जिसके परिणामस्वरूप स्थिरता में वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, एक निरंतर चरण के रूप में विआयनीकृत पानी ने फॉर्मूलेशन की संरचना को सरल बना दिया। इस स्थिति के तहत, पीएनपीई ने एंटीजन की कुशल असेंबली की अनुमति दी और प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एंटीजन के वितरण को बढ़ावा दिया। इसके अलावा, पीएनपीई तैयार करने के लिए वन-स्टेप सोनिकेशन की विधि का उपयोग किया गया था, जिसने थकाऊ प्रक्रिया को समाप्त कर दिया और संदूषण की संभावना से बचा। यह ध्यान रखना आवश्यक है कि पीएनपी और स्क्वालेन से बनी वितरण प्रणाली को एक समान बल होने की आवश्यकता है, अन्यथा कोई इमल्शन नहीं बनता है या तैयार पीएनपीई आकार में समान नहीं है।

कोशिकाओं के लिए वितरण प्रणाली के संबंध का अध्ययन करना विवो में किया गया एक असाधारण चुनौती थी, इन विट्रो अध्ययन सेलुलर आसंजन और आंतरिककरण में शामिल प्रक्रिया को स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं। हाल ही में, इस समस्या ने बायोमेडिकल क्षेत्र में बहुत ध्यान आकर्षित किया है। फ्लो साइटोमेट्री और सीएलएसएम विश्लेषण31,32 का उपयोग करके कोशिकाओं के लिए कणों के संबंध पर प्रकाश डालने के लिए पर्याप्त प्रयास किए गए हैं। जबकि ये विधियां सेलुलर स्तर पर एक औसत रीडआउट प्रदान करती हैं, कोशिकाओं और वितरण प्रणालियों के बीच विशिष्ट गतिशील बाध्यकारी प्रक्रियाओं की आसानी से निगरानी नहीं की जाती है। इसके विपरीत, क्यूसीएम मुख्य रूप से एक संवेदनशील पीजोइलेक्ट्रिक क्रिस्टल पर निर्भर करता है कि एएफ द्रव्यमान के साथ बदलता है। मिनट द्रव्यमान परिवर्तनों का पता लगाने की क्षमता क्यूसीएम-डी को लक्षित आणविक इंटरैक्शन की निगरानी करने की अनुमति देती है। तकनीक का उपयोग वास्तविक समय की घटनाओं की निगरानी के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न परिस्थितियों में बीएमडीसी के साथ पीएनपीई के संबंध के अध्ययन की अनुमति मिलतीहै।

पीएनपीई के आसंजन की जांच बरकरार कोशिकाओं के बजाय बीईवी का उपयोग करके की गई थी। अच्छी तरह से नियंत्रित सरल एपीआई के रूप में, बीईवी को मूल कोशिकाओं की अधिकांश विशेषताओं को विरासत में माना जाता है। सामान्य तौर पर, छोटे और सजातीय कण आकार वाले बाह्य पुटिकाएं आसंजन परख में बेहतर प्रदर्शन करती हैं। इस प्रकार, बीईवी को 10, 5, और 1 μm छिद्र आकार34 के साथ पॉली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से एक्सट्रूज़न के माध्यम से तैयार किया गया था। बीईवी के व्यास और उपज को एक्सट्रूज़न की संख्या और पॉली कार्बोनेट झिल्ली के छिद्र आकार को विनियमित करके नियंत्रित किया जा सकता है। पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से 30 पास बनाने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, इस विधि में एक सीमा भी थी कि झिल्ली के उस हिस्से को अलग किया जा सकता है, जिससे डीसी सतह पर प्रोटीन को बीईवी में समझाया जा सकता है, जिससे इमल्शन के लिए आत्मीयता थोड़ी कम हो जाती है।

यह दिखाया गया था कि सकारात्मक चार्ज प्रोटीन का उपयोग करके एसआईओ2 सेंसर सतहों का संशोधन बाद के पीएनपीई कोटिंग के लिए उपयुक्त था। एसआईओ 2 सेंसर सतहों और पीएनपीई के बीच मध्यवर्ती परत के रूप मेंपीएलएल (पॉलीकेशन पॉलीपेप्टाइड) का वर्णित कार्यान्वयन तेजी से कोटिंग विधि के लिए एक सुधार साबित हुआ। किसी भी घटना के कारण द्रव्यमान में परिवर्तन, उदाहरण के लिए, एसआईओ2 सेंसर पर समाधान के प्रवाह से किसी भी घटक के गैर-विशिष्ट सोखना, प्रयोगात्मक परिणामों की सटीकता को प्रभावित कर सकताहै। इसलिए, यह सुनिश्चित करना आवश्यक था कि पीएलएल ने स्पिन कोटिंग के बाद चिप पर एक सुसंगत गुणवत्ता बनाए रखी, और उनकी सतह को गैर-विशिष्ट सोखना के कारण माप त्रुटि से बचने के लिए पीएनपीई द्वारा पूरी तरह से कवर किया जाएगा। उसी समय, जब पीएनपीई युक्त मोबाइल चरण के संपर्क के दौरानए एफ अब नहीं बदला, तो चिप की सतह को पूरी तरह से कवर माना जाता था। इसने सुनिश्चित किया कि पता लगाए गए संकेत पीएनपीई में बीईवी के आसंजन से उत्पन्न हुए थे। हमने प्रदर्शित किया कि क्यूसीएम-डी वास्तविक समय में पीएनपीई के लिए बीईवी के आसंजन को दिखाने के लिए एक अच्छी विधि थी, जो एपीआई के लिए पीएनपीई के उच्च संबंध को दर्शाती है। दुर्भाग्य से, यह विधि व्यक्तिगत कोशिकाओं और वितरण प्रणाली के बीच बातचीत को प्रतिबिंबित नहीं कर सकी। इसलिए, एक अधिक सटीक निर्धारण के लिए प्रोटोकॉल के आगे के डिजाइन और माप प्रक्रिया के अनुकूलन की आवश्यकता होगी।

बीईवी के लिए पीएनपीई के उच्च संबंध को समझने के बाद, बढ़ी हुई आंतरिककरण को और सत्यापित किया गया था। हमने दिखाया कि एंटीजन के शक्तिशाली सेलुलर उत्थान पीएनपीई के उच्च संबंध के साथ सहसंबद्ध हैं। पीएनपीई के पास एंटीजन के प्रभावी लोडिंग के लिए बहु-स्तरीय संरचना और वितरण को बढ़ाने के लिए कोशिका झिल्ली के साथ बहु-स्तरीय संपर्क के लिए लचीलापन था। इसलिए, तर्कसंगत रूप से डिज़ाइन किए गए पिकरिंग इमल्शन ने कोशिका झिल्ली के साथ मजबूत बातचीत के माध्यम से सेलुलर आंतरिककरण और इंट्रासेल्युलर मार्गों को उत्तेजित किया। इन फायदों का प्रदर्शन करने के बाद, पीएनपीई टीकों को बढ़ाने के लिए नवीन, सुरक्षित और कुशल एंटीजन डिलीवरी सिस्टम के विकास पर प्रकाश डाल सकता है।

इस प्रोटोकॉल ने सफलतापूर्वक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फॉस्फोलिपिड बाइलेयर के लिए पीएनपीई के उच्च संबंध और बाद में विट्रो में प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एंटीजन के इंट्रासेल्युलर वितरण का प्रदर्शन किया। इसलिए, विभिन्न रोगजनकों से विभिन्न प्रकार के एंटीजन को संक्रामक रोगों के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने के लिए प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग करके वितरित और विशेषता दी जा सकती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), चीनी विज्ञान अकादमी (ZDBS-LY-SLH040) के बुनियादी सीमांत वैज्ञानिक अनुसंधान कार्यक्रम की 0 से 1 मूल नवाचार परियोजना द्वारा समर्थित परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के अभिनव अनुसंधान समूहों के लिए फाउंडेशन (अनुदान संख्या 21821005)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AddVax InvivoGen Vac-adx-10
Cell Strainer Biosharp BS-70-CS 70 μm
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) Nikon A1
Cy3 NHS Ester YEASEN 40777ES03
DAPI Staining Solution Beyotime C1005
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 16000-044
FITC Phalloidin Solarbio CA1620
Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer Malvern
Micro BCA protein Assay Kit Thermo Science 23235
Membrane emulsification equipment Zhongke Senhui Microsphere Technology FM0201/500M
Mini-Extruder Avanti Polar Lipids, Inc
NANO ZS Malvern JSM-6700F
Polycarbonate membranes Avanti Polar Lipids, Inc
Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) Sigma-Aldrich 26780-50-7 Mw 7,000-17,000
Poly-L-lysine Solution Solarbio P2100
Poly (vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Aldrich 9002-89-5
QSense Silicon dioxide sensor Biolin Scientific QSX 303 Surface roughness < 1 nm RMS
Quartz Crystal Microbalance Biosharp Q-SENSE E4
RPMI Medium 1640 basic Gibco C22400500BT L-Glutamine, 25 mM HEPES
Scanning Electron Microscopy (SEM) JEOL JSM-6700F
Squalene Sigma-Aldrich 111-02-4

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बायोइंजीनियरिंग अंक 187
एंटीजन आंतरिककरण को बढ़ावा देने के लिए कण-स्थिर इमल्शन का सेलुलर संबंध
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Cao, F., Ming, Y., Gao, W., Ge, J., Ogino, K. Cellular Affinity of Particle-Stabilized Emulsion to Boost Antigen Internalization. J. Vis. Exp. (187), e64406, doi:10.3791/64406 (2022).

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