Summary
Per progettare razionalmente adiuvanti efficienti, abbiamo sviluppato l'emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle di acido polilattico e co-glicolico (PNPE). Il PNPE possedeva una morbidezza unica e un'interfaccia idrofobica per un potente contatto cellulare e offriva un carico di antigene ad alto contenuto, migliorando l'affinità cellulare del sistema di consegna alle cellule presentanti l'antigene e inducendo un'internalizzazione efficiente degli antigeni.
Abstract
L'affinità cellulare delle micro / nanoparticelle è la precondizione per il riconoscimento cellulare, l'assorbimento cellulare e l'attivazione, che sono essenziali per la somministrazione di farmaci e la risposta immunitaria. Il presente studio è nato dall'osservazione che gli effetti della carica, delle dimensioni e della forma delle particelle solide sull'affinità cellulare sono solitamente considerati, ma raramente ci rendiamo conto del ruolo essenziale della morbidezza, del fenomeno di ristrutturazione dinamica e della complessa interazione di interfaccia nell'affinità cellulare. Qui, abbiamo sviluppato l'emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle (PLGA) con acido poli-lattico-co-glicolico (PLGA) che ha superato le carenze delle forme rigide e simulato la flessibilità e la fluidità dei patogeni. È stato messo a punto un metodo per testare l'affinità del PNPE con le superfici cellulari ed elaborare la successiva internalizzazione da parte delle cellule immunitarie. L'affinità del PNPE con le vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEV) - la sostituzione delle cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) - è stata determinata utilizzando una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D), che ha permesso il monitoraggio in tempo reale dell'adesione dell'emulsione cellulare. Successivamente, il PNPE è stato utilizzato per fornire l'antigene (ovalbumina, OVA) e l'assorbimento degli antigeni da parte dei BMDC è stato osservato utilizzando il microscopio a scansione laser confocale (CLSM). Risultati rappresentativi hanno mostrato che il PNPE ha immediatamente diminuito la frequenza (ΔF) quando ha incontrato i bEV, indicando una rapida adesione e un'alta affinità del PNPE ai BMDC. PNPE ha mostrato un legame significativamente più forte alla membrana cellulare rispetto alle microparticelle PLGA (PMP) e all'adiuvante AddaVax (indicato come nano-emulsione stabilizzata con tensioattivo [SSE]). Inoltre, a causa della maggiore affinità cellulare con gli immunociti attraverso cambiamenti di curvatura dinamica e diffusioni laterali, l'assorbimento dell'antigene è stato successivamente potenziato rispetto alle PMP e all'ESS. Questo protocollo fornisce approfondimenti per la progettazione di nuove formulazioni con elevata affinità cellulare e internalizzazione efficiente dell'antigene, fornendo una piattaforma per lo sviluppo di vaccini efficienti.
Introduction
Per combattere le malattie epidemiche, croniche e infettive, è imperativo sviluppare coadiuvanti efficaci per le vaccinazioni profilattiche e terapeutiche 1,2. Idealmente, gli adiuvanti dovrebbero possedere un'eccellente sicurezza e attivazione immunitaria 3,4,5. Si ritiene che l'assorbimento e il processo efficaci degli antigeni da parte delle cellule presentanti l'antigene (APC) siano una fase essenziale nelle cascate di segnalazione a valle e nell'inizio della risposta immunitaria 6,7,8. Quindi, acquisire una chiara comprensione del meccanismo di interazione delle cellule immunitarie con gli antigeni e progettare adiuvanti per migliorare l'internalizzazione sono strategie efficienti per migliorare l'efficienza dei vaccini.
Le micro-/nanoparticelle con proprietà uniche sono state precedentemente studiate come sistemi di rilascio dell'antigene per mediare l'assorbimento cellulare degli antigeni e l'interazione cellulare con i pattern molecolari associati ai patogeni 9,10. Al contatto con le cellule, i sistemi di consegna iniziano a interagire con la matrice extracellulare e la membrana cellulare, che ha portato all'internalizzazione e alle successive risposte cellulari11,12. Studi precedenti hanno portato alla luce che l'internalizzazione delle particelle avviene attraverso l'adesione membrana cellulare-particella13, seguita da deformazione flessibile della membrana cellulare e diffusione del recettore alla membrana superficiale14,15. In queste circostanze, le proprietà del sistema di consegna dipendono dall'affinità con gli APC, che successivamente influenzano la quantità di assorbimento16,17.
Per ottenere informazioni sulla progettazione del sistema di consegna per migliorare la risposta immunitaria, ampi sforzi sono stati concentrati sullo studio della relazione tra le proprietà delle particelle e l'assorbimento cellulare. Il presente studio è scaturito dall'osservazione che le micro-/nanoparticelle solide con varie cariche, dimensioni e forme sono spesso studiate in questa luce, mentre il ruolo della fluidità nell'internalizzazione dell'antigene è raramente studiato18,19. Infatti, durante l'adesione, le particelle morbide hanno dimostrato cambiamenti dinamici di curvatura e diffusioni laterali per aumentare l'area di contatto per interazioni multivalenti, difficilmente replicabili dalle particelle solide20,21. Inoltre, le membrane cellulari sono doppi strati fosfolipidi (sfingolipidi o colesterolo) nel sito di assorbimento e le sostanze idrofobiche possono alterare l'entropia conformazionale dei lipidi, riducendo la quantità di energia richiesta per l'assorbimento cellulare22,23. Pertanto, amplificare la mobilità e promuovere l'idrofobicità del sistema di consegna può essere una strategia efficace per rafforzare l'internalizzazione dell'antigene per migliorare la risposta immunitaria.
L'emulsione pickering, stabilizzata da particelle solide assemblate all'interfaccia tra due liquidi immiscibili, è stata ampiamente utilizzata in campo biologico24,25. Infatti, le particelle aggreganti sull'interfaccia olio/acqua determinano la formulazione di strutture multilivello, che promuovono interazioni multi-livello sistema di somministrazione-cellulare e inducono ulteriormente proprietà fisiochimiche multifunzionali nella somministrazione di farmaci. A causa della loro deformabilità e mobilità laterale, ci si aspettava che le emulsioni di Pickering entrassero in interazione cellulare multivalente con gli immunociti e fossero riconosciute dalle proteine di membrana26. Inoltre, poiché i nuclei di micelle oleose nelle emulsioni Pickering non sono completamente ricoperti di particelle solide, le emulsioni Pickering presentano spazi di diverse dimensioni tra le particelle sull'interfaccia olio/acqua, che causano una maggiore idrofobicità. Pertanto, è fondamentale esplorare l'affinità delle emulsioni di Pickering con le APC ed elaborare la successiva internalizzazione per sviluppare adiuvanti efficienti.
Sulla base di queste considerazioni, abbiamo progettato un'emulsione di Pickering stabilizzata con nanoparticelle PLGA (PNPE) come sistema di somministrazione del vaccino a fluidità che ha anche contribuito a ottenere preziose informazioni sull'affinità del PNPE con i BMDC e sull'internalizzazione cellulare. L'adesione in tempo reale delle vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEV; una sostituzione dei BMDC) al PNPE è stata monitorata tramite un metodo label-free utilizzando una microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D). Dopo la caratterizzazione dell'affinità di PNPE con BMDC, è stata utilizzata la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) per determinare l'assorbimento dell'antigene. Il risultato ha indicato la maggiore affinità di PNPE con le BMDC e l'efficiente internalizzazione dell'antigene. Abbiamo anticipato che il PNPE avrebbe mostrato una maggiore affinità con le APC, che potrebbero stimolare meglio l'internalizzazione degli antigeni per migliorare le risposte immunitarie.
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Protocol
Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dall'Istituto di ingegneria di processo, Accademia cinese delle scienze. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in stretta conformità con i regolamenti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida per la revisione etica degli animali (Cina, GB / T35892-2018).
1. Preparazione e caratterizzazione di nanoparticelle PLGA
- Preparazione di nanoparticelle di PLGA (PNP)
- Aggiungere 0,5 g di alcool polivinilico (PVA) a 120 ml di acqua deionizzata a 90 °C e mescolare fino a completa dissoluzione per preparare la soluzione di PVA. Conservare la soluzione in frigorifero (4 °C) dopo il raffreddamento a temperatura ambiente.
- Aggiungere 100 mg di PLGA a 10 ml di miscela di acetone ed etanolo (rapporto di 4:1) per servire come fase oleosa.
- Porre 20 mL di soluzione acquosa di PVA sotto la cappa aspirante e agitare magneticamente a 400 giri/min. Aggiungere 5 ml di fase oleosa nella soluzione di PVA goccia a goccia utilizzando una pompa a siringa. Quindi, mescolare la miscela nella cappa aspirante fino a quando i solventi organici evaporano completamente.
NOTA: Con l'aumento della concentrazione delle particelle nella fase oleosa, la soluzione in fase acquosa si trasforma gradualmente in una luce chiara, bianco-bluastra o bianco latte. - Dopo la volatilizzazione dei solventi organici (2-3 h), centrifugare la miscela a 15.000 x g. Lavare tre o più volte fino a quando l'acqua di lavaggio finale è limpida e trasparente.
NOTA: Lo scopo di questa fase è principalmente quello di lavare via il PVA residuo sulla superficie delle particelle per evitare che influisca sulla preparazione dell'emulsione Pickering. - Risospendere i PNP lavati in 2 ml di acqua deionizzata e congelare la miscela a -80 °C per 24 ore. Successivamente liofilizzare le particelle in un liofilizzatore per 48-72 h. I PNP preparati sono floccati bianchi.
- Caratterizzazione dei PNP
- Per caratterizzare le dimensioni e il potenziale zeta dei PNP, aggiungere 10 μL di PNP in 1 mL di acqua deionizzata per ottenere una soluzione diluente e trasferire la soluzione di diluente in una cella DTS1070. Accendere il computer e l'analizzatore dinamico di diffusione della luce (DLS), quindi posizionare la cella DTS1070 nel sistema DLS.
- Fare clic sul software Zeta Size e creare un nuovo file di misurazione per impostare la procedura di determinazione. Quindi, avviare la procedura di determinazione per ottenere la dimensione delle particelle e la distribuzione del potenziale zeta.
- Per osservare la morfologia dei PNP, distribuire uniformemente la soluzione di PNP da 0,1 mL (diluita 40 volte) su un foglio di stagnola di 5 cm x 5 cm e lasciare che l'acqua evapori naturalmente in una cappa aspirante ben ventilata durante la notte.
- Ritagliare una piccola parte della carta stagnola e fissarla sul tavolo del campione con del nastro conduttivo. Spruzzarlo con oro ad una corrente di 10 mA per 120 s. Successivamente osservare la morfologia superficiale del campione utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM).
2. Preparazione e caratterizzazione di PNPE
- Per preparare il PNPE, aggiungere PNP liofilizzati all'acqua deionizzata ad una concentrazione di 4 mg/ml (fase acquosa) e quindi aggiungere lo squalene come fase oleosa. Preparare PNPE tramite sonicazione one-step per 5 minuti a 100 W in un sonicatore a bagnomaria. Il rapporto di fase olio-acqua è 1:9.
- Caratterizzazione del PNPE preparato
- Aprire il software Mastersizer 2000 e il laser in sequenza. Fare clic su Misura per aprire il programma preimpostato e impostare il nome del campione. Fare clic su Start per iniziare a misurare lo sfondo del campione, quindi, utilizzando un contagocce, aggiungere 1 mL di PNPE al serbatoio del campione dell'analizzatore laser di dimensioni delle particelle per misurare la dimensione delle particelle dell'emulsione tre volte in parallelo.
- Diluire 20 μL di PNPE in 1 mL di acqua deionizzata. Rilasciare 20 μL dell'emulsione sul vetrino. Osservare la morfologia e l'omogeneità dell'emulsione utilizzando la microscopia ottica con ingrandimento 40x e ottenere fotografie.
- Efficienza di caricamento dell'antigene
- Sciogliere 200 μg di ovoalbumina (OVA) in 500 ml di acqua deionizzata. Quindi mescolare con 500 ml di PNPE preparato e agitare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere l'antigene fluidico mediante centrifugazione a 5000 x g per 20 minuti.
- Determinare le concentrazioni di antigene fluidico utilizzando saggi di acido bicinconinico (BCA)27. La formula per calcolare l'efficienza di carico dell'antigene è la seguente:
Efficienza di carico dell'antigene =
Utilizzare lo stesso metodo per determinare l'efficienza di caricamento dell'antigene dell'SSE utilizzato come gruppo di controllo.
- Stabilità del PNPE
- Dividere 6 mL del PNPE preparato in sei porzioni uguali e conservare tre parti ciascuna a 4 °C e 25 °C, rispettivamente. Diluire 20 μL di PNPE immagazzinato in 1 mL di acqua deionizzata (1:50) nei giorni 0, 3 e 6. Quindi, misurare le dimensioni e il potenziale zeta delle soluzioni stock di PNPE mantenute a temperature diverse.
NOTA: Le diverse temperature di conservazione sono impostate per confrontare l'effetto delle diverse temperature sulla stabilità del PNPE, che può ottimizzare le condizioni di conservazione per un'elevata stabilità e una lunga durata.
- Dividere 6 mL del PNPE preparato in sei porzioni uguali e conservare tre parti ciascuna a 4 °C e 25 °C, rispettivamente. Diluire 20 μL di PNPE immagazzinato in 1 mL di acqua deionizzata (1:50) nei giorni 0, 3 e 6. Quindi, misurare le dimensioni e il potenziale zeta delle soluzioni stock di PNPE mantenute a temperature diverse.
- Preparazione di microparticelle PLGA (PMP)
- Sciogliere 500 mg di PLGA in 5 ml di diclorometano come fase oleosa, quindi versare in 50 ml di fase acquosa esterna contenente l'1,5% di PVA per ottenere la miscela olio/acqua. Omogeneizzare la miscela a 3000 giri/min per 1 minuto utilizzando un omogeneizzatore per ottenere emulsioni grossolane.
- Mantenere l'uniformità della dimensione delle particelle PLGA delle microsfere (determinata da emulsioni grossolane) mediante emulsificazione a membrana. Installare una membrana da 5,2 μm nel tubo della membrana. Regolare la pressione a 800 kPa e mantenerla costante.
- Aprire la valvola di scarico e la valvola di alimentazione e, dopo aver aggiunto le emulsioni grossolane al serbatoio del campione, chiudere la valvola di scarico e la valvola di alimentazione, aprire la valvola di scarico e la valvola di ingresso e prelevare l'emulsione post-film in un becher da 200 ml. Ripetere il processo tre volte per ottenere emulsioni pre-doppie.
- Mescolare le emulsioni pre-doppie per far evaporare il diclorometano a temperatura ambiente per polimerizzare le microsfere. Lavare le microsfere con acqua deionizzata a 7741 x g per 3 minuti cinque volte. Pre-congelare in un congelatore a -80 °C e infine liofilizzare per ottenere microsfere essiccate.
- Caratterizzazione dei PMP
- Aprire il software Mastersizer 2000 e il laser in sequenza. Fare clic su Misura per aprire il programma preimpostato e impostare il nome del campione. Fare clic su Start per iniziare a misurare lo sfondo del campione. Quindi, aggiungere 1 mL di PMP al serbatoio di aggiunta del campione dell'analizzatore di dimensioni delle particelle laser con un contagocce e misurare la dimensione delle particelle delle microparticelle tre volte in parallelo.
- Analisi della morbidezza
NOTA: PNPE è stato rivestito sul sensore SiO2 per misurare la morbidezza.- Pulire il chip del sensore al quarzo SiO 2 mediante trattamento UV-ozono per 10 minuti, risciacquare due volte con 5 ml di etanolo (75% v/v) e asciugare con N2. Installare il chip del sensore al quarzo SiO2 vuoto nella cella di flusso.
- Accendere il computer e attivare il controllo della temperatura in basso a destra del software per assicurarsi che la temperatura impostata sia di circa 1 °C inferiore alla temperatura ambiente.
- Fare clic sul pulsante Acquisizione nella barra degli strumenti e selezionare Setup Measurement per cercare le ottave 1, 3, 5, 7, 9 e 11 del chip nel canale utilizzato. Fare clic sul pulsante Acquisizione nella barra degli strumenti e selezionare Avvia misurazione.
- Correggete la linea di base con aria e, quando la linea di base è bilanciata, selezionate Interrompi e salvate il file come spazio vuoto.
- Pulire il chip e lo spin coat 10 μg/mL di PNPE sul chip. In breve, accendere lo spin coater e impostare il parametro operativo. Collegare il tubo N2 al rivestimento di rotazione, regolare il frazionamento della bombola del gas a 0,4 kPa e posizionare il chip pulito sulla ventosa del rivestimento di rotazione. Aggiungere 100 μL di PNPE a goccia al centro del sensore SiO2 e chiudere il coperchio superiore dello spin coater per completare il rivestimento.
- Installare il chip rivestito PNPE nella cella di flusso. Ripetere i passaggi 2.7.3-2.7.4 e salvare il file come PNPE. Aprire sia i file vuoti che quelli PNPE e fare clic sul pulsante Stitch per ottenere i relativi dati di dissipazione (ΔD).
3. Isolare e coltura BMDC 28
NOTA: Assicurarsi che tutti i reagenti e i campioni siano posti sul ghiaccio, poiché ciò ha un effetto positivo sull'attività cellulare. Per mantenere la sterilità, eseguire tutti i passaggi su una panca ultra-pulita utilizzando utensili sterili.
- Eutanasia dei topi C57BL / 6 (femmina, 6-8 settimane) tramite inalazione di CO2 e immergerli in etanolo al 70% (v / v) per una breve sterilizzazione.
- Dopo aver immerso per 3-5 minuti, trasferire i topi in una panchina super pulita. Rimuovere i muscoli delle gambe usando forbici in acciaio inossidabile per esporre il femore e la tibia, quindi separare il femore e la tibia.
- Riempire una capsula di Petri con etanolo al 70% (v / v) e immergere le ossa pulite in essa per 5-10 s per completare la sterilizzazione esterna. Pulire tutte le ossa e metterle in un tubo sterile con ghiaccio intorno a loro.
- Tagliare il femore e la tibia vicino all'articolazione usando le forbici. Inserire l'ago della siringa nell'osso per lavare il midollo osseo in una provetta da centrifuga utilizzando un mezzo RPMI pre-raffreddato (1640).
- Risciacquare due o tre volte fino a quando l'osso è completamente bianco. Pipettare il midollo osseo più volte per separare tutti i grumi. Filtrare le celle in una provetta da centrifuga da 15 ml utilizzando un setaccio da 40 μm di diametro.
- Centrifugare a 4 °C e 500 x g per 5 min. Scartare il surnatante e aggiungere 2 ml di lisato eritrocitario al sedimento per 4 minuti.
- Dopo aver lavato due o tre volte, risospendere le cellule in 2 ml di terreno completo (1 % penicillina-streptomicina, 10 % siero fetale bovino, 20 ng/ml di IL-4 e 10 ng/ml di GM-CSF). Quindi, diluire 10 μL di cellule in 1 mL di PBS e inserire il chip del contatore automatico di celle portatile nella diluizione delle cellule per il conteggio delle cellule. Infine, le cellule seme ad una densità di 1 x 106 cellule/ml in una capsula di coltura da 10 mm con un mezzo completo.
- Coltura delle cellule in un incubatore cellulare con il 5% di CO2 a 37 °C. Cambia il mezzo ogni 2 giorni. Il giorno 7, trasferire le cellule in un tubo da 50 ml e centrifugare a 450 x g per 5 minuti per raccogliere le cellule.
4. Preparazione di vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEVs)
- Assemblare il mini-estrusore in sequenza secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che l'alloggiamento della siringa non sia rotto prima di utilizzarlo. Assicurarsi che tutti gli O-ring siano in buone condizioni prima di ogni esperimento e sostituire prontamente quelli usurati o danneggiati. Gli O-ring usurati o danneggiati possono causare un improvviso rilascio di pressione durante il funzionamento dell'estrusore.
- Aspirare ripetutamente i BMDC e trasferirli in un tubo da centrifuga. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Pressurizzare le sospensioni cellulari attraverso membrane in policarbonato da 10 μm, 5 μm e 1 μm per 30 passaggi utilizzando il miniestrusore29.
NOTA: Per consentire l'uniformità delle dimensioni bEV, le sospensioni BMDC sono state spinte attraverso membrane in policarbonato da 10 μm, 5 μm e 1 μm per 30 passaggi. Inoltre, durante il funzionamento, assicurarsi di applicare la forza in modo uniforme e mantenere la direzione della forza lungo l'asse della siringa. - Centrifugare i surnatanti raggruppati per 5 minuti a 1000 x g e 4 °C per rimuovere le cellule. Raccogliere il surnatante e centrifugarlo a 3000 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere le cellule rimanenti e i detriti cellulari.
- Raccogliere il surnatante e centrifugarlo a 100.000 x g per 90 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere i bEV in 2 mL di soluzione salina tamponata HEPES (HBS). Purificare i bEV tramite filtrazione attraverso una membrana da 0,45 μm e conservare i bEV purificati a -80 °C.
5. I veicoli elettrici aderiscono al PNPE
NOTA: Il sensore SiO2 è stato modificato tramite il metodo dello spin-coating.
- Sensore SiO2 modificato con poli-L-lisina (PLL).
- Pulire il chip del sensore al quarzo SiO 2 utilizzando il trattamento UV-ozono per 10 minuti, risciacquare due volte con etanolo e asciugare con N2.
- Accendere la spin coater premendo il pulsante di accensione , premere il pulsante Control e impostare il tempo e la velocità del rivestimento. La velocità di rotazione iniziale è di 400 giri / min, che viene costantemente aumentata a 5000 giri / min.
- Collegare il tubo N2 allo spin coater e regolare il frazionamento della bombola del gas a 0,4 kPa. Posizionare il chip pulito sulla ventosa dello spin coater. Aggiungere 100 μL di PLL goccia al centro del sensore SiO2 e chiudere il coperchio superiore dello spin coater.
- Premere il pulsante Start per iniziare a rivestire il campione e arrestare la macchina al termine. Spegnere la pompa per vuoto, spegnere i pulsanti di accensione e controllo e rimuovere il sensore SiO2 modificato da PLL.
NOTA: prima di premere Start, assicurarsi che il tempo e la velocità del rivestimento siano stati impostati. Inoltre, assicurarsi che il sensore SiO2 sia posizionato al centro della ventosa. Assicurarsi che il coperchio sia chiuso prima di eseguire il processo per evitare incidenti.
- Determinazione dell'adesione dei bEV al PNPE
- Accendere il computer, l'unità elettronica, la pompa peristaltica e attivare il controllo della temperatura in basso a destra nel software per assicurarsi che la temperatura impostata sia di circa 1 °C inferiore alla temperatura ambiente.
- Posizionare i sensori SiO2 modificati da PLL nella cella di flusso secondo le istruzioni operative e collegare la linea di misura tra la cella di flusso e la pompa di flusso. Posizionare la cella di flusso all'interno del sistema del modulo di flusso e sciacquarla con acqua ultrapura prima di iniziare gli esperimenti.
- Fare clic sulla barra degli strumenti Acquisizione e selezionare Setup Measurement per cercare 1, 3, 5, 7, 9 e 11 ottave del chip nel canale utilizzato. Per correggere la linea di base, fare clic su Avvia misurazione per consentire all'aria di entrare nel modulo di flusso fino a quando la linea di base dell'aria non è liscia. Successivamente, far scorrere acqua deionizzata per 10-15 minuti per consentire nuovamente l'equilibrio della linea di base della soluzione.
- Pompare la soluzione PNPE preparata nel modulo di flusso a una portata di 50 μL/min per ottenere un adsorbimento all'equilibrio sul sensore SiO2 .
NOTA: Il ΔF non cambia più quando il PNPE viene pompato nuovamente nel modulo di flusso, indicando che la superficie dei sensori SiO2 è stata completamente coperta con PNPE. - Pompare la soluzione di bEVs preparata nel modulo di flusso a una portata di 50 μL/min per tracciare il processo di adesione del bEV alla superficie PNPE.
6. Analisi CLSM dell'assorbimento dell'antigene
- Co-coltura PNPE-OAV con BMDC
- Incubare le BMDC con 1640 terreni completi (1% penicillina-streptomicina, 10% siero fetale bovino, 20 ng/ml di IL-4 e 10 ng/ml di GM-CSF) per 7 giorni, quindi seminarli in piccole piastre laser confocali a 1 x 106 per pozzetto durante la notte a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 .
- Mescolare 0,5 mL di OAV marcato con Cy5 (400 μg/mL) con 0,5 mL di PNPE per 1 ora e rimuovere l'antigene fluidico mediante centrifugazione a 5000 x g per 20 minuti per sviluppare la formulazione del vaccino. Dopo la risospensione con 200 μL di acqua deionizzata, aggiungere 10 μL della formulazione (10 μg/mL OVA) nelle piccole piastre laser confocali sotto un banco super-pulito e co-coltura con BMDC per 6 ore.
- Colorazione del citoscheletro di actina
- Rimuovere il liquido di coltura dalle cellule e lavarle due volte con soluzione salina tamponata fosfato preriscaldata (PBS; pH 7,4).
- Fissare le cellule con una soluzione di formaldeide al 4% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Durante la fissazione, evitare fissativi contenenti metanolo, che possono distruggere l'actina.
- Lavare le celle con PBS due o tre volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuna. Permeabilizzare le cellule con 100 μL di soluzione Triton X-100 allo 0,5% per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle con PBS due o tre volte a temperatura ambiente per 10 minuti ciascuna.
- Coprire le cellule sul piatto con fondo di vetro delle piccole piastre laser confocali con 200 μL di soluzione di lavoro di falloidina coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Per ridurre il segnale di fondo, aggiungere l'1% di albumina sierica bovina alla soluzione di lavoro di falloidina coniugata con FITC. Inoltre, coprire il coperchio delle piccole piastre laser confocali durante l'incubazione per prevenire l'evaporazione della soluzione.
- Lavare le celle con PBS tre volte per 5 minuti ciascuna. Colorare nuovamente i nuclei con 200 μL di soluzione DAPI (concentrazione: 100 nM) per circa 30 s.
- Analisi delle immagini
- Accendere l'hardware del microscopio confocale in sequenza, inclusi laser, confocale, microscopio e computer. Fare clic sul software NIS-Elements AR 5.20.00 e selezionare Nikon Confocal per accedere al sistema di test.
- Nel sistema di microscopio confocale, accendere le varie unità nell'ordine indicato. Innanzitutto, impostare i canali FITC, DAPI e Cy5 e regolare l'HV e l'offset corrispondenti. Quindi, seleziona la lente dell'olio 100x e metti una goccia di olio di cedro sulla parte superiore. Posizionare le piccole piastre laser confocali contenenti BMDC colorate sul palco del microscopio.
- Fare clic sul pulsante Scansione . Sotto un microscopio a fluorescenza, individuare le cellule di interesse spostando l'asse X, l'asse Y e l'asse Z. Ottimizza l'intensità del laser, le dimensioni dell'immagine e altri parametri per consentire la scansione di immagini confocali di alta qualità. Infine, fai clic sul pulsante Cattura e salva le immagini.
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Representative Results
Per ottenere il PNPE è stata utilizzata una semplice sonificazione in un'unica fase. In primo luogo, abbiamo preparato PNP uniformi da utilizzare come stabilizzatore solido (Figura 1A). La morfologia delle PNP è stata osservata attraverso SEM, mostrando che sono per lo più uniformi e sferiche (Figura 1B). La dimensione idrodinamica e il potenziale zeta delle formulazioni sono stati rilevati tramite DLS. Il diametro dei PNP era 187,7 ± 3,5 nm e il potenziale zeta era -16,4 ± 0,4 mV (Figura 1C e Tabella supplementare 1). Per preparare PNPE, la miscela di soluzione PNP (0,4%, p/v) e squalene è stata semplicemente sonicata a 100 w per 5 minuti (Figura 1D). Dopo l'ottimizzazione della fase continua, il PNPE ottenuto è stato internamente composto da squalene e adsorbito esternamente con PNP (Figura supplementare 1). Un microscopio ottico è stato impiegato per osservare le goccioline di emulsione e l'analizzatore delle dimensioni delle particelle Mastersizer è stato utilizzato per determinare la distribuzione dimensionale. PNPE ha mostrato non meno particelle per impedire la coalescenza delle emulsioni e non più particelle in eccesso nella fase continua che causano gli aggregati più grandi (Figura 1E). Come mostrato nella figura 1F e nella tabella supplementare 1, la dimensione dell'emulsione era 2100 ± 300 nm e il potenziale zeta era -27,1 ± 0,5 mV, indicando che le particelle si aggregavano sull'interfaccia olio/acqua. Per osservare l'assorbimento cellulare dell'antigene, l'OAV Cy5-labled è stato adsorbito sul PNPE. Per cominciare, 500 μL di PNPE sono stati miscelati con l'OAV marcato Cy5 da 500 μL a temperatura ambiente per 1 ora. L'assorbimento degli antigeni sulle formulazioni è stato testato utilizzando il saggio BCA. A causa della sua elevata area superficiale specifica e dell'idrofobicità, oltre il 70,6% degli antigeni fluidici sono stati adsorbiti sul PNPE entro 1 ora, indicando un notevole potenziale per caricare grandi quantità di antigeni in breve tempo. Come gruppo di controllo, sono stati caratterizzati anche PMP e SSE. I PMP erano paragonabili per dimensioni (1987 ± 310 nm) al PNPE. L'SSE era un'emulsione caricata negativamente (-15,9 ± 0,8 mV) con una dimensione del diametro di 147,2 ± 0,5 nm. Inoltre, l'efficienza di carico delle PMP e dell'ESS è stata solo del 25,6% ± 0,6% e del 23,4% ± 0,2%, rispettivamente a causa del limitato adsorbimento con antigeni (Tabella supplementare 1). Inoltre, per valutare la stabilità del PNPE, il PNPE preparato è stato conservato rispettivamente a 4 °C e 25 °C. Le dimensioni e il potenziale zeta della soluzione madre sono stati determinati nei giorni 0-6 (diluizione 1:50). Come mostrato nella figura supplementare 2, le goccioline sono rimaste simili per dimensioni e il potenziale zeta durante la conservazione a 4 °C e 25 °C ha suggerito una maggiore stabilità del PNPE per il rilascio di antigeni. Quindi il QCM-D è stato utilizzato per misurare la flessibilità di PNPE. Come mostrato nella Figura 1G, come risultato della sua struttura rigida, i PMP hanno mostrato una dissipazione inferiore (ΔD). Allo stesso tempo, PNPE aveva un ΔD significativamente più alto, dimostrando la sua eccellente viscoelasticità e flessibilità, che può essere una delle ragioni per un migliore attaccamento e assorbimento delle cellule.
Per convalidare l'affinità di PNPE con la membrana BMDC, i bEV sono stati utilizzati per sostituire le celle intatte a causa delle loro dimensioni adeguate per il rilevamento accurato di QCM-D. In questo processo, i BMDC maturi sono stati raccolti ed estrusi in serie attraverso filtri a membrana in policarbonato che contenevano dimensioni dei pori di 10, 5 e 1 μm per preparare vescicole di dimensioni nanometriche. I bEV ottenuti sono stati raccolti e purificati tramite ultracentrifugazione e risospesi in soluzione salina tamponata HEPES (Figura 2A). La morfologia dei bEV colorati negativamente è stata quindi esplorata utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata utilizzata per testare le dimensioni dei bEV. I risultati hanno rivelato che i bEV erano forme vescicolari lipidiche chiuse e bistrato e la distribuzione era omogenea (Figura 2B). NTA ha mostrato che la distribuzione dimensionale dei bEV con diametro di picco dei bEV purificati era di 131 nm (Figura 2C). Abbiamo quindi concluso che i bEV erano una tipica struttura a membrana con distribuzione uniforme, che consentiva una maggiore accuratezza nel test QCM-D come sostituto dei BMDC.
Successivamente, l'adesione dei bEV a PNPE è stata monitorata utilizzando QCM-D. In primo luogo, il sensore QCM-D SiO2 è stato modificato con PLL per conferire una carica positiva per fissare successivamente PNPE sulla superficie e simulare il processo di bio-interfase. È stato immediatamente seguito dall'aggiunta della soluzione bEV nella camera per chiarire l'interazione tra PNPE e bEV (Figura 3A). Come mostrato nella Figura 3B, l'immediata diminuzione della frequenza (ΔF) ha indicato una rapida adesione dei bEV al PNPE dopo l'incontro. Inoltre, il ΔF è diminuito con l'aumentare della concentrazione di bEV, riflettendo un effetto dipendente dalla concentrazione. PNPE ha una superficie densamente imballata per sostenere il punto di atterraggio; inoltre, ha mostrato cambiamenti dinamici della curvatura e diffusione laterale per un potente contatto cellulare, con conseguente alta affinità con i BMDC. Al contrario, PMP e SSE erano debolmente legati alle bEV, anche ad alta concentrazione (80 μg / ml), che probabilmente risultava da una mancanza di siti di contatto con le cellule immunitarie (Figura 3C).
Dopo aver confermato il processo di adesione alle BMDC, PNPE è stato utilizzato per fornire l'antigene ai BMDC. Per visualizzare direttamente i profili di internalizzazione dell'antigene in vitro, l'OAV marcato con Cy5 è stato miscelato con PMP, SSE e PNPE per trattare con BMDC, rispettivamente. Dopo 6 ore dopo il trattamento, è stato eseguito CLSM per analizzare l'assorbimento cellulare di OAV marcati con Cy5 nei BMDC. Come mostrato nella Figura 4A, il segnale di fluorescenza Cy5-OAV ha indicato che la quantità totale di antigene internalizzato nelle cellule è significativamente più alta nel gruppo trattato con PNPE rispetto a quella nel gruppo trattato con PMP e SSE. L'analisi quantitativa dell'assorbimento cellulare è stata ulteriormente eseguita, mostrando un'intensità relativa significativamente più elevata di fluorescenza nelle BMDC trattate con PNPE rispetto a quelle trattate con PMP e SSE (p < 0,001), che ha corroborato l'osservazione sopra (Figura 4B). I risultati ottenuti hanno dimostrato che il PNPE ha promosso l'internalizzazione dell'antigene e ha effettivamente consegnato l'antigene intracellulare. Di conseguenza, l'efficienza di assorbimento degli antigeni è stata positivamente associata all'affinità del sistema di rilascio alle cellule bersaglio e PNPE ha effettivamente aumentato l'assorbimento cellulare dell'antigene attraverso il contatto multilivello con la membrana cellulare.
Figura 1: Caratterizzazione dell'emulsione di Pickering stabilizzata con nanoparticelle PLGA. (A) Schema della procedura sperimentale utilizzata per la preparazione di nanoparticelle di PLGA (PNP). (B) Immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) di PNP. Barra di scala = 200 nm. (C) Distribuzione dimensionale dei PNP. (D) Schema della procedura sperimentale utilizzata per la preparazione dell'emulsione di Pickering stabilizzata con nanoparticelle (PNPE). (E) Micrografie ottiche di PNPE. Barra di scala = 20 μm. (F) Distribuzione dimensionale di PNPE. (G) Analisi della microbilancia a cristalli di quarzo con monitoraggio della dissipazione (QCM-D) sulla morbidezza di PNPE, microparticelle PLGA (PMP) ed emulsione stabilizzata con tensioattivo (SSE) attraverso la rilevazione della dissipazione (ΔD). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Caratterizzazione delle vescicole extracellulari bio-mimetiche. (A) Schema della procedura sperimentale utilizzata per la preparazione di vescicole extracellulari bio-mimetiche (bEVs). (B) Immagini di microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di bEV. Barra di scala = 200 nm. (C) Distribuzione dimensionale dei bEV misurata mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Affinità di PNPE con bEV analizzata utilizzando QCM-D . (A) Schema della modifica della superficie PLL attraverso il rivestimento PNPE. (B) Variazioni di frequenza (ΔF) di PNPE dopo aver incontrato diverse concentrazioni di bEV. (C) Confronto delle variazioni di ΔF nelle microparticelle PLGA (PMP), emulsione stabilizzata con tensioattivo (SSE) e PNPE. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Assorbimento degli antigeni. (A) Diagramma rappresentativo dell'assorbimento cellulare degli antigeni. Barra di scala = 20 μm. (B) Fluorescenza di intensità relativa dell'assorbimento cellulare degli antigeni. Il grafico mostra la media ± SEM da tre esperimenti indipendenti. ANOVA unidirezionale è stato utilizzato per analizzare il significato delle differenze osservate. p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: L'ottimizzazione della fase continua. (A) Micrografie ottiche di PNPE costruite da diverse fasi continue. Barra della scala = 20 μm. (B) Le dimensioni delle emulsioni sono state rilevate dopo la preparazione. I risultati sono stati espressi come media ± SEM (n = 3). Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: La stabilità del PNPE. Dimensioni (A) e potenziale zeta (B) di PNPE dopo 0, 3 e 6 giorni di conservazione alle temperature indicate. I dati sono stati dimostrati come media ± SEM (n = 3). Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella integrativa 1: Caratterizzazioni delle formulazioni. PNP, PNPE e SSE sono stati preparati secondo il protocollo indicato. Le distribuzioni dimensionali e il potenziale zeta sono stati determinati mediante analizzatore dinamico di diffusione della luce (DLS) o analizzatore dimensionale di particelle Mastersizer. L'efficienza di carico è stata valutata utilizzando il saggio BCA. I dati sono stati dimostrati come media ± SEM (n = 3). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Abbiamo sviluppato un'emulsione olio/acqua stabilizzata con nanoparticelle PLGA come sistema di rilascio per una maggiore internalizzazione dell'antigene. Il PNPE preparato possedeva una superficie densamente imballata per supportare il punto di atterraggio e una morbidezza e fluidità uniche per un potente contatto cellulare con la membrana cellulare immunitaria. Inoltre, l'interfaccia olio/acqua offriva un carico di antigene ad alto contenuto e il PLGA anfifilico conferiva al PNPE un'elevata stabilità per il trasporto di antigeni alle cellule immunitarie. Il PNPE potrebbe aderire rapidamente alla superficie delle cellule, indicando che l'emulsione stabilizzata con nanoparticelle PLGA ha una forte affinità con la membrana cellulare per l'assorbimento cellulare. Inoltre, PNPE aveva un alto profilo di sicurezza perché sia lo squalene che il PLGA sono ingredienti approvati dalla Food and Drug Administration (FDA)30, che dovrebbe sfruttare il trasferimento sicuro nella clinica.
Il peso molecolare del PLGA e il tipo di fasi continue e disperse hanno influenzato le proprietà del PNPE, tra cui stabilità e idrofobicità. In questa ricerca, sono state selezionate nanoparticelle di PLGA a peso molecolare 17 kDa come stabilizzante e squalene come fase dispersa, con conseguente aumento della stabilità. Inoltre, l'acqua deionizzata come fase continua ha semplificato la composizione della formulazione. In questa condizione, PNPE ha permesso un assemblaggio efficiente di antigeni e ha promosso la consegna di antigeni alle cellule immunitarie. Inoltre, il metodo della sonicazione in un'unica fase è stato utilizzato per preparare PNPE, che ha eliminato il noioso processo ed evitato la possibilità di contaminazione. È essenziale notare che il sistema di rilascio composto da PNP e squalene deve essere una forza uniforme, altrimenti non si forma emulsione o il PNPE preparato non è di dimensioni uniformi.
Mentre studiare l'affinità del sistema di consegna alle cellule è stata una sfida straordinaria eseguita in vivo, gli studi in vitro potrebbero aiutare a chiarire il processo coinvolto nell'adesione cellulare e nell'internalizzazione. Recentemente, questo problema ha ottenuto molta attenzione in campo biomedico. Sono stati fatti sforzi sostanziali per far luce sull'affinità delle particelle con le cellule utilizzando la citometria a flusso e l'analisi CLSM31,32. Mentre questi metodi forniscono una lettura media a livello cellulare, i processi specifici di legame dinamico tra cellule e sistemi di consegna non sono facilmente monitorabili. Al contrario, la QCM dipende principalmente da un cristallo piezoelettrico sensibile che il ΔF cambia con la massa. La capacità di rilevare minuscole variazioni di massa consente a QCM-D di monitorare le interazioni molecolari mirate. La tecnica può essere utilizzata per monitorare eventi in tempo reale, consentendo lo studio dell'affinità di PNPE con BMDC in diverse condizioni33.
L'adesione al PNPE è stata studiata utilizzando bEV invece di cellule intatte. Come le APC semplici ben controllate, si ritiene che i bEV ereditino la maggior parte delle caratteristiche delle celle madri. In generale, le vescicole extracellulari con particelle di dimensioni piccole e omogenee ottengono risultati migliori nei saggi di adesione. Pertanto, i bEV sono stati preparati tramite estrusione attraverso filtri in policarbonato con pori da 10, 5 e 1 μm di dimensioni34. Il diametro e la resa dei bEV potrebbero essere controllati regolando il numero di estrusi e la dimensione dei pori delle membrane in policarbonato. Si consiglia di effettuare 30 passaggi attraverso le membrane in policarbonato. Tuttavia, questo metodo aveva anche una limitazione in quanto la parte della membrana può essere invertita, causando l'incapsulamento delle proteine sulla superficie DC nei bEV, che ha leggermente diminuito l'affinità con le emulsioni.
È stato dimostrato che la modifica delle superfici del sensore SiO2 utilizzando proteine caricate positivamente era adatta per il successivo rivestimento PNPE. L'implementazione descritta di PLL (Polycation polypeptide) come strato intermedio tra le superfici del sensore SiO2 e PNPE si è rivelata un miglioramento per il metodo di rivestimento rapido. Variazioni di massa causate da qualsiasi evento, ad esempio adsorbimento non specifico di qualsiasi componente dal flusso di soluzione sul sensore SiO2 , potrebbero influire sull'accuratezza dei risultati sperimentali35. Pertanto, era necessario garantire che i PLL mantenessero una qualità costante sul chip dopo il rivestimento di spin e la loro superficie fosse completamente coperta da PNPE per evitare l'errore di misurazione causato dall'adsorbimento non specifico. Allo stesso tempo, quando ΔF non cambiava più durante il contatto con la fase mobile contenente PNPE, la superficie del chip era considerata completamente coperta. Ciò ha assicurato che i segnali rilevati fossero generati dall'adesione di bEV al PNPE. Abbiamo dimostrato che QCM-D era un buon metodo per mostrare l'adesione dei bEV a PNPE in tempo reale, riflettendo l'elevata affinità di PNPE con APC. Sfortunatamente, questo metodo non poteva riflettere l'interazione tra le singole cellule e il sistema di consegna. Pertanto, una determinazione più accurata richiederà un'ulteriore progettazione del protocollo e l'ottimizzazione della procedura di misura.
Dopo aver analizzato l'elevata affinità di PNPE con i bEV, è stata ulteriormente verificata una maggiore internalizzazione. Abbiamo dimostrato che il potente assorbimento cellulare degli antigeni era correlato con l'alta affinità di PNPE. PNPE possedeva la struttura multilivello per un carico efficace degli antigeni e flessibilità per il contatto multilivello con la membrana cellulare per migliorare la consegna. Pertanto, l'emulsione Pickering progettata razionalmente ha stimolato l'internalizzazione cellulare e le vie intracellulari attraverso la robusta interazione con la membrana cellulare. Avendo dimostrato questi vantaggi, PNPE può far luce sullo sviluppo di sistemi di rilascio dell'antigene nuovi, sicuri ed efficienti per migliorare i vaccini.
Questo protocollo ha dimostrato con successo l'elevata affinità di PNPE al doppio strato fosfolipidico delle cellule immunitarie e il successivo rilascio intracellulare dell'antigene alle cellule immunitarie in vitro. Pertanto, vari tipi di antigeni provenienti da diversi agenti patogeni possono essere consegnati e caratterizzati utilizzando il protocollo proposto per conferire protezione contro le malattie infettive.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal progetto sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), la Fondazione per i gruppi di ricerca innovativi della National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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