Summary
For å rasjonelt designe effektive adjuvanser utviklet vi poly-melkesyre-koglykolsyre nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE). PNPE hadde unik mykhet og et hydrofobt grensesnitt for potent cellulær kontakt og tilbød antigenbelastning med høyt innhold, forbedret leveringssystemets cellulære affinitet til antigenpresenterende celler og induserte effektiv internalisering av antigener.
Abstract
Den cellulære affiniteten til mikro-/nanopartikler er forutsetningen for cellulær gjenkjenning, cellulært opptak og aktivering, som er avgjørende for legemiddellevering og immunrespons. Denne studien stammer fra observasjonen at effekten av ladning, størrelse og form av faste partikler på celleaffinitet vanligvis vurderes, men vi innser sjelden den essensielle rollen som mykhet, dynamisk restruktureringsfenomen og kompleks grensesnittinteraksjon i cellulær affinitet. Her utviklet vi poly-laktisk-koglykolsyre (PLGA) nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE) som overvant manglene i stive former og simulerte fleksibiliteten og fluiditeten til patogener. En metode ble satt opp for å teste PNPEs affinitet til celleoverflater og utdype den påfølgende internaliseringen av immunceller. PNPEs affinitet til bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV) - erstatningen for benmargs dendrittiske celler (BMDC) - ble bestemt ved bruk av en kvartskrystallmikrobalanse med spredningsovervåking (QCM-D), som tillot sanntidsovervåking av celleemulsjonsadhesjon. Deretter ble PNPE brukt til å levere antigenet (ovalbumin, OVA) og opptaket av antigenene av BMDC ble observert ved bruk av konfokal laserskanningsmikroskop (CLSM). Representative resultater viste at PNPE umiddelbart reduserte frekvensen (ΔF) når den møtte bEVs, noe som indikerer rask vedheft og høy affinitet av PNPE til BMDC. PNPE viste signifikant sterkere binding til cellemembranen enn PLGA-mikropartikler (PMPs) og AddaVax adjuvans (betegnet som overflateaktivt stabilisert nano-emulsjon [SSE]). Videre, på grunn av den forbedrede cellulære affiniteten til immuncyttene gjennom dynamiske krumningsendringer og laterale diffusjoner, ble antigenopptaket senere økt sammenlignet med PMP og SSE. Denne protokollen gir innsikt for å designe nye formuleringer med høy celleaffinitet og effektiv antigen-internalisering, og gir en plattform for utvikling av effektive vaksiner.
Introduction
For å bekjempe epidemiske, kroniske og smittsomme sykdommer er det viktig å utvikle effektive hjelpestoffer for profylaktiske og terapeutiske vaksinasjoner 1,2. Ideelt sett bør adjuvansene ha utmerket sikkerhet og immunaktivering 3,4,5. Effektivt opptak og prosess av antigener av antigenpresenterende celler (APC) antas å være et viktig stadium i nedstrøms signalkaskader og initiering av immunresponsen 6,7,8. Derfor, å få en klar forståelse av mekanismen for interaksjon av immunceller med antigener og designe adjuvanser for å forbedre internalisering, er effektive strategier for å øke effektiviteten av vaksiner.
Mikro-/nanopartikler med unike egenskaper har tidligere blitt undersøkt som antigenleveringssystemer for å formidle det cellulære opptaket av antigener og den cellulære interaksjonen med patogenassosierte molekylmønstre 9,10. Ved kontakt med celler begynner leveringssystemer å samhandle med den ekstracellulære matrisen og cellemembranen, noe som førte til internalisering og påfølgende cellulære responser11,12. Tidligere studier har brakt frem at internalisering av partikler skjer gjennom cellemembran-partikkeladhesjon13, etterfulgt av fleksibel deformasjon av cellemembranen og diffusjon av reseptoren til overflatemembranen14,15. Under disse omstendighetene avhenger egenskapene til leveringssystemet av affiniteten til APC-er, som senere påvirker opptaksmengden16,17.
For å få innsikt i utformingen av leveringssystemet for forbedret immunrespons, har det vært fokusert på undersøkelse av forholdet mellom egenskapene til partikler og cellulært opptak. Den foreliggende studien stammer fra observasjonen at faste mikro- / nanopartikler med forskjellige ladninger, størrelser og former ofte studeres i dette lyset, mens fluiditetens rolle i antigen internalisering sjelden undersøkes18,19. Faktisk, under vedheft, viste de myke partiklene dynamiske krumningsendringer og laterale diffusjoner for å øke kontaktområdet for multivalente interaksjoner, som knapt kan replikeres av de faste partiklene20,21. I tillegg er cellemembraner fosfolipid dobbeltlag (sfingolipider eller kolesterol) på opptaksstedet, og hydrofobe stoffer kan endre konformasjonsentropien av lipider, noe som reduserer mengden energi som kreves for cellulært opptak22,23. Dermed kan forsterkning av mobilitet og fremme hydrofobisitet av leveringssystemet være en effektiv strategi for å styrke antigen internalisering for å forbedre immunresponsen.
Pickering-emulsjon, stabilisert av faste partikler samlet ved grensesnittet mellom to ublandbare væsker, har blitt mye brukt i det biologiske feltet24,25. Faktisk bestemmer de aggregerende partiklene på olje / vann-grensesnittet formuleringen av flernivåstrukturer, som fremmer multi-level delivery system-cellulære interaksjoner, og induserer videre multifunksjonelle fysiokjemiske egenskaper i legemiddellevering. På grunn av deres deformabilitet og laterale mobilitet ble Pickering-emulsjoner forventet å gå inn i multivalent cellulær interaksjon med immunocyttene og bli anerkjent av membranproteinene26. I tillegg, da oljeaktige micellekjerner i Pickering-emulsjoner ikke er helt dekket med faste partikler, har Pickering-emulsjoner hull av forskjellige størrelser mellom partikler på olje / vann-grensesnittet, noe som forårsaker høyere hydrofobisitet. Dermed er det avgjørende å utforske affiniteten til Pickering-emulsjoner til APC-er og utdype den påfølgende internaliseringen for å utvikle effektive adjuvanser.
Basert på disse vurderingene konstruerte vi en PLGA nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE) som et fluiditetsvaksineleveringssystem som også bidro til å få verdifull innsikt i PNPEs affinitet til BMDC-er og cellulær internalisering. Real-time adhesjon av bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEVs; en erstatning av BMDC) til PNPE ble overvåket via en etikettfri metode ved bruk av en kvartskrystallmikrobalanse med spredningsovervåking (QCM-D). Etter karakterisering av PNPEs affinitet til BMDC ble konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) brukt til å bestemme antigenopptaket. Resultatet indikerte PNPEs høyere affinitet til BMDC, og effektiv internalisering av antigenet. Vi forventet at PNPE ville vise høyere affinitet til APC, noe som bedre kan stimulere internaliseringen av antigener for å forbedre immunresponsene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene beskrevet i denne protokollen er godkjent av Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences. Alle dyreforsøk ble utført i strengt samsvar med forskrift om stell og bruk av forsøksdyr og retningslinjer for etisk gjennomgang av dyr (Kina, GB / T35892-2018).
1. Forberedelse og karakterisering av PLGA nanopartikler
- Fremstilling av PLGA nanopartikler (PNPs)
- Tilsett 0,5 g polyvinylalkohol (PVA) til 120 ml avionisert vann ved 90 °C og rør til det er helt oppløst for å klargjøre PVA-oppløsningen. Oppbevar oppløsningen i kjøleskap (4 °C) etter avkjøling til romtemperatur.
- Tilsett 100 mg PLGA til 10 ml aceton og etanolblanding (forhold på 4: 1) for å tjene som oljefase.
- Plasser 20 ml PVA vandig oppløsning under avtrekkshetten og rør magnetisk ved 400 o / min. Tilsett 5 ml oljefase i PVA-oppløsningen dråpe for dråpe ved hjelp av en sprøytepumpe. Rør deretter blandingen i avtrekkshetten til de organiske løsningsmidlene fordamper helt.
MERK: Med økningen i konsentrasjonen av partiklene i oljefasen, blir vannfaseløsningen gradvis til en klar og gjennomsiktig lys blåhvit eller melkehvit. - Etter fordampning av organiske løsningsmidler (2-3 timer), sentrifuger blandingen ved 15 000 x g. Vask tre eller flere ganger til det endelige vaskevannet er klart og gjennomsiktig.
MERK: Formålet med dette trinnet er hovedsakelig å vaske av gjenværende PVA på partikkeloverflaten for å forhindre at den påvirker Pickering-emulsjonspreparatet. - Re-suspendert de vasket PNPs i 2 ml avionisert vann og frys blandingen ved -80 ° C i 24 timer. Frys deretter partiklene i et lyofilisator i 48-72 timer. De forberedte PNP-ene er hvite flokker.
- Karakterisering av PNPs
- For å karakterisere størrelsen og zetapotensialet til PNPs, tilsett 10 μL PNPs i 1 ml avionisert vann for å oppnå fortynningsmiddeloppløsning og overføre fortynningsløsningen til en DTS1070-celle. Slå på datamaskinen og dynamisk lysspredningsanalysator (DLS), og plasser deretter DTS1070-cellen i DLS-systemet.
- Klikk på Zeta Size Software og opprett en ny målefil for å sette opp bestemmelsesprosedyren. Start deretter bestemmelsesprosedyren for å oppnå partikkelstørrelsen og zeta potensiell fordeling.
- For å observere PNPs morfologi, fordel 0,1 ml PNPs-løsningen jevnt (fortynnet 40 ganger) på et 5 cm x 5 cm tinnfolieark og la vannet fordampe naturlig i en godt ventilert avtrekkshette over natten.
- Klipp ut en liten del av tinnfolien og fest den på prøvebordet med ledende tape. Spray den med gull med en strøm på 10 mA i 120 s. Deretter observere overflatemorfologien til prøven ved hjelp av skanningelektronmikroskopi (SEM).
2. Forberedelse og karakterisering av PNPE
- For å forberede PNPE, tilsett frysetørkede PNPs til avionisert vann i en konsentrasjon på 4 mg / ml (den vandige fasen) og tilsett deretter squalen som oljefase. Forbered PNPE via en-trinns sonikering i 5 minutter ved 100 W i et vannbad sonikator. Faseforholdet mellom olje og vann er 1:9.
- Karakterisering av den forberedte PNPE
- Åpne Mastersizer 2000-programvaren og laseren i rekkefølge. Klikk på Mål for å åpne det forhåndsinnstilte programmet og angi eksempelnavnet. Klikk på Start for å begynne å måle bakgrunnen til prøven, og tilsett deretter 1 ml PNPE til prøvetanken til laserpartikkelstørrelsesanalysatoren for å måle partikkelstørrelsen til emulsjonen tre ganger parallelt.
- Fortynn 20 μL PNPE i 1 ml avionisert vann. Slipp 20 μL av emulsjonen på lysbildet. Vær oppmerksom på emulsjonens morfologi og homogenitet ved hjelp av optisk mikroskopi ved 40x forstørrelse og oppnå fotografier.
- Effektivitet ved antigenbelastning
- Løs opp 200 μg ovalbumin (OVA) i 500 ml avionisert vann. Bland den deretter med 500 ml tilberedt PNPE og rist i 1 time ved romtemperatur. Fjern fluidantigenet ved sentrifugering ved 5000 x g i 20 minutter.
- Bestem fluidisk antigenkonsentrasjoner ved hjelp av bicinchoninic acid (BCA) analyser27. Formelen for beregning av antigenbelastningseffektiviteten er som følger:
Effektivitet ved antigenbelastning =
Bruk samme metode for å bestemme antigenbelastningseffektiviteten til SSE som brukes som en kontrollgruppe.
- Stabilitet av PNPE
- Del 6 ml av den tilberedte PNPE i seks like store deler, og oppbevar tre deler hver ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Fortynn 20 μL lagret PNPE i 1 ml avionisert vann (1:50) på dag 0, 3 og 6. Deretter måler du størrelsen og zetapotensialet til PNPE-stamløsningene som holdes ved forskjellige temperaturer.
MERK: De forskjellige lagringstemperaturene er satt til å sammenligne effekten av forskjellige temperaturer på stabiliteten til PNPE, noe som kan optimalisere lagringstilstanden for høy stabilitet og lang holdbarhet.
- Del 6 ml av den tilberedte PNPE i seks like store deler, og oppbevar tre deler hver ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Fortynn 20 μL lagret PNPE i 1 ml avionisert vann (1:50) på dag 0, 3 og 6. Deretter måler du størrelsen og zetapotensialet til PNPE-stamløsningene som holdes ved forskjellige temperaturer.
- Fremstilling av PLGA-mikropartikler (PMP)
- Oppløs 500 mg PLGA i 5 ml diklormetan som oljefase, og hell deretter i 50 ml ekstern vandig fase inneholdende 1,5% PVA for å oppnå olje / vannblandingen. Homogeniser blandingen ved 3000 o / min i 1 minutt ved bruk av en homogenisator for å oppnå grove emulsjoner.
- Opprettholde ensartetheten av PLGA-partikkelstørrelsen til mikrosfærer (bestemt av grove emulsjoner) ved membranemulgering. Installer en 5,2 μm membran i membranrøret. Juster trykket til 800 kPa og hold deg stabil.
- Åpne eksosventilen og tilførselsventilen, og etter å ha tilsatt grovemulsjonene til prøvetanken, lukk eksosventilen og mateventilen, åpne utløpsventilen og innløpsventilen, og ta etterfilmemulsjonen i et 200 ml beger. Gjenta prosessen tre ganger for å oppnå pre-doble emulsjoner.
- Rør pre-doble emulsjoner for å fordampe diklormetan ved romtemperatur for å kurere mikrosfærene. Vask mikrosfærene med avionisert vann ved 7741 x g i 3 minutter fem ganger. Forfrys i en fryser ved -80 °C og til slutt frysetørk for å få tørkede mikrosfærer.
- Karakterisering av PMP-er
- Åpne Mastersizer 2000-programvaren og laseren i rekkefølge. Klikk på Mål for å åpne det forhåndsinnstilte programmet og angi eksempelnavnet. Klikk på Start for å begynne å måle bakgrunnen til prøven. Deretter tilsetter du 1 ml PMP-er til prøvetanken til laserpartikkelstørrelsesanalysatoren med en dropper og måler partikkelstørrelsen til mikropartiklene tre ganger parallelt.
- Mykhet analyse
MERK: PNPE ble belagt på SiO2-sensoren for å måle mykheten.- Rengjør SiO 2 kvartssensorbrikken med UV-ozonbehandling i 10 minutter, skyll to ganger med 5 ml etanol (75 % v/v) og tørk med N2. Installer den tomme SiO2 kvartssensorbrikken i strømningscellen.
- Slå på datamaskinen og aktiver temperaturkontrollen nederst til høyre i programvaren for å sikre at den innstilte temperaturen er ca. 1 °C under romtemperatur.
- Klikk på Acquisition-knappen i verktøylinjen og velg Setup Measurement for å søke etter 1, 3, 5, 7, 9 og 11 oktaver av brikken i kanalen som brukes. Klikk på Anskaffelse-knappen i verktøylinjen og velg Start måling.
- Korriger grunnlinjen med luft, og når grunnlinjen er balansert, velger du Stopp og lagrer filen som en tom fil.
- Rengjør brikken og spinn belegget 10 μg/ml PNPE på brikken. Slå på spinnbeleggeren kort og still inn driftsparameteren. Koble N2-røret til spinnbeleggeren, juster fraksjoneringen av gassflasken til 0,4 kPa, og plasser den rene brikken på sugekoppen til spinnbeleggeren. Tilsett 100 μL PNPE dråpevis i midten av SiO 2-sensoren og lukk toppdekselet på spinnbeleggeren for å fullføre belegget.
- Installer PNPE-belagt chip i strømningscellen. Gjenta trinn 2.7.3-2.7.4 og lagre filen som PNPE. Åpne både de tomme filene og PNPE-filene, og klikk på Stitch-knappen for å få de relaterte spredningsdataene (ΔD).
3. Isoler og dyrk BMDC 28
MERK: Pass på at alle reagenser og prøver er plassert på is, da dette har en positiv effekt på celleaktiviteten. For å opprettholde steriliteten, utfør alle trinnene på en ultra-ren benk ved hjelp av sterile redskaper.
- Avlive C57BL / 6 (kvinne, 6-8 uker gammel) mus via CO2 innånding og suge dem i etanol 70% (v / v) for en kort sterilisering.
- Etter bløtlegging i 3-5 min, overfør musene til en super ren benk. Fjern benmusklene ved hjelp av rustfritt stål saks for å eksponere lårbenet og tibia, og skille deretter lårbenet og tibia.
- Fyll en petriskål med 70% (v / v) etanol og suge de rene beinene i den i 5-10 s for å fullføre ekstern sterilisering. Rengjør alle beinene og legg dem i et sterilt rør med is rundt dem.
- Trim lårbenet og tibia nær leddet ved hjelp av saks. Stikk sprøytekanylen inn i beinet for å skylle ut benmargen i et sentrifugerrør ved bruk av forkjølt RPMI-medium (1640).
- Skyll to eller tre ganger til beinet er helt hvitt. Pipette benmargen flere ganger for å skille alle klumper. Filtrer cellene i et 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en sil på 40 μm diameter.
- Sentrifuge ved 4 °C og 500 x g i 5 min. Kast supernatanten og tilsett 2 ml erytrocytlysat til sedimentet i 4 minutter.
- Etter vask to eller tre ganger, re-suspendere cellene i 2 ml av komplett medium (1 % penicillin-streptomycin, 10 % føtalt bovint serum, 20 ng / ml av IL-4, og 10 ng / ml av GM-CSF). Fortynn deretter 10 μL celler til 1 ml PBS og sett brikken til den håndholdte automatiserte celletelleren inn i cellefortynningen for celletelling. Til slutt, frøceller med en tetthet på 1 x 106 celler / ml i en 10 mm kulturskål med et komplett medium.
- Dyrk cellene i en celleinkubator med 5% CO2 ved 37 °C. Bytt medium hver 2. På dag 7, overfør cellene til 50 ml rør og sentrifuge ved 450 x g i 5 minutter for å samle cellene.
4. Fremstilling av bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV)
- Monter miniekstruderen i rekkefølge i henhold til produsentens instruksjoner. Forsikre deg om at sprøytehuset ikke er sprukket før du bruker det. Forsikre deg om at alle O-ringer er i god stand før hvert eksperiment, og bytt ut slitte eller skadede omgående. Slitte eller skadede O-ringer kan forårsake plutselig trykkavlastning ved bruk av ekstruderen.
- Aspirer BMDC-ene gjentatte ganger og overfør dem til et sentrifugerør. Høst cellene ved sentrifugering ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Trykk cellesuspensjonene gjennom 10 μm, 5 μm og 1 μm polykarbonatmembraner i 30 passeringer ved bruk av mini-ekstruderen29.
MERK: For å muliggjøre bEV-størrelsesuniformitet ble BMDC-suspensjonene presset gjennom 10 μm, 5 μm og 1 μm polykarbonatmembraner i 30 passeringer. I tillegg, under drift, sørg for å bruke kraft jevnt og opprettholde kraftretningen langs sprøytens akse. - Sentrifuger de samlede supernatantene i 5 minutter ved 1000 x g og 4 °C for å fjerne cellene. Samle supernatanten og sentrifuger den ved 3000 x g i 5 minutter ved 4 ° C for å fjerne gjenværende celler og celleavfall.
- Samle supernatanten og sentrifuger den ved 100 000 x g i 90 minutter ved 4 °C. Kast supernatant og suspendere bEV-ene på nytt i 2 ml HEPES-bufret saltvann (HBS). Rens bEV-ene via filtrering gjennom en 0,45 μm membran og oppbevar de rensede bEV-ene ved -80 °C.
5. bEV-er holder seg til PNPE
MERK: SiO2-sensoren ble modifisert via spin-coating-metoden.
- SiO2-sensor modifisert med poly-L-lysin (PLL).
- Rengjør SiO 2 kvartssensorbrikken med UV-ozonbehandling i 10 minutter, skyll to ganger med etanol og tørk med N2.
- Slå på spinnbeleggeren ved å trykke på strømknappen , trykk på kontrollknappen og still inn beleggets tid og hastighet. Den opprinnelige rotasjonshastigheten er 400 o / min, som økes jevnt til 5000 o / min.
- Koble N2-røret til spinnbelegget og juster fraksjoneringen av gassflasken til 0,4 kPa. Plasser den rene brikken på sugekoppen på spinnbeleggeren. Tilsett 100 μL PLL dråpevis til midten av SiO 2-sensoren og lukk toppdekselet på spinnbeleggeren.
- Trykk på Start-knappen for å begynne å belegge prøven og stoppe maskinen når den er ferdig. Slå av vakuumpumpen, slå av strøm- og kontrollknappene, og fjern den PLL-modifiserte SiO2-sensoren.
MERK: Før du trykker på Start, må du kontrollere at beleggets tid og hastighet er angitt. I tillegg må du sørge for at SiO2-sensoren er plassert i midten av sugekoppen. Forsikre deg om at lokket er lukket før løpeprosessen for å forhindre ulykker.
- Bestemmelse av adhesjon av bEV til PNPE
- Slå på datamaskinen, den elektroniske enheten, den peristaltiske pumpen, og aktiver temperaturkontrollen nederst til høyre i programvaren for å sikre at den innstilte temperaturen er ca. 1 °C under romtemperatur.
- Plasser de PLL-modifiserte SiO2-sensorene i strømningscellen i henhold til bruksanvisningen, og koble målelinjen mellom strømningscellen og strømningspumpen. Plasser strømningscellen inne i strømningsmodulsystemet og skyll dem med ultrarent vann før du begynner eksperimentene.
- Klikk på Acquisition-verktøylinjen , og velg Setup Measurement for å søke etter 1, 3, 5, 7, 9 og 11 oktaver av brikken i kanalen som brukes. For å korrigere grunnlinjen, klikk på Start måling for å la luft komme inn i strømningsmodulen til luftgrunnlinjen er jevn. Deretter strømmer avionisert vann i 10-15 minutter for å muliggjøre løsningen baseline likevekt igjen.
- Pump den klargjorte PNPE-løsningen inn i strømningsmodulen med en strømningshastighet på 50 μL/min for å oppnå likevektsadsorpsjon på SiO2-sensoren .
MERK: ΔF endres ikke lenger når PNPE pumpes inn i strømningsmodulen igjen, noe som indikerer at overflaten på SiO2-sensorene er fullstendig dekket med PNPE. - Pump den forberedte bEVs-løsningen inn i strømningsmodulen med en strømningshastighet på 50 μL / min for å spore prosessen med bEV-adhesjon til PNPE-overflaten.
6. CLSM-analyse av antigenopptak
- Felles kultur PNPE-OVA med BMDC
- Inkuber BMDC-ene med 1640 komplette medier (1 % penicillin-streptomycin, 10 % føtalt bovint serum, 20 ng/ml IL-4 og 10 ng/ml GM-CSF) i 7 dager, og frø dem deretter til små konfokale laserskåler ved 1 x 106 per brønn over natten ved 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator.
- Bland 0,5 ml Cy5-merket OVA (400 μg/ml) med 0,5 ml PNPE i 1 time og fjern fluidantigenet ved sentrifugering ved 5000 x g i 20 minutter for å utvikle vaksineformulering. Etter re-suspensjon med 200 μL avionisert vann, tilsett 10 μL av formuleringen (10 μg / ml OVA) i de små konfokale laserskålene under en superren benk og co-kultur med BMDC i 6 timer.
- Aktin cytoskjelett flekk
- Fjern kulturvæsken fra cellene og vask dem to ganger med forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS; pH 7,4).
- Fest cellene med 4% formaldehydoppløsning i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Under fiksering, unngå fikseringsmidler som inneholder metanol, noe som kan ødelegge aktin.
- Vask cellene med PBS to eller tre ganger ved romtemperatur i 10 minutter hver. Permeabiliser cellene med 100 μL 0,5% Triton X-100-løsning i 5 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med PBS to eller tre ganger ved romtemperatur i 10 minutter hver igjen.
- Dekk cellene på glassbunnskålen til de små konfokale laserskålene med 200 μL fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugert phalloidin-arbeidsløsning og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur i mørket. For å redusere bakgrunnssignalet, tilsett 1% bovint serumalbumin til den FITC-konjugerte phalloidin-arbeidsløsningen. I tillegg dekker lokket på de små konfokale laserskålene under inkubasjon for å forhindre fordampning av løsningen.
- Vask cellene med PBS tre ganger i 5 minutter hver. Re-flekk kjernene med 200 μL DAPI-løsning (konsentrasjon: 100 nM) i rundt 30 s.
- Bilde analyse
- Slå på den konfokale mikroskopmaskinvaren i rekkefølge, inkludert laser, konfokal, mikroskop og datamaskin. Klikk på NIS-Elements AR 5.20.00-programvaren og velg Nikon Confocal for å gå inn i testsystemet.
- I det konfokale mikroskopsystemet, slå på de forskjellige enhetene i den angitte rekkefølgen. Først konfigurerer du FITC-, DAPI- og Cy5-kanalene og justerer den tilsvarende HV-en og forskyvningen. Velg deretter 100x oljelinsen og legg en dråpe sedertreolje på toppen. Plasser de små konfokale laserskålene som inneholder fargede BMDC-er på mikroskopstadiet.
- Klikk på Skanne knapp. Under et fluorescensmikroskop, finn celler av interesse ved å flytte X-aksen, Y-aksen og Z-aksen. Juster laserintensiteten, bildestørrelsen og andre parametere for å muliggjøre skanning av konfokale bilder av høy kvalitet. Til slutt klikker du på Capture-knappen og lagrer bildene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En enkel ett-trinns sonifisering ble brukt til å oppnå PNPE. Først utarbeidet vi ensartede PNP-er til bruk som solidstabilisator (figur 1A). Morfologien til PNP ble observert gjennom SEM, noe som viser at de for det meste er ensartede og sfæriske (figur 1B). Formuleringenes hydrodynamiske størrelse og zetapotensial ble påvist via DLS. Diameteren på PNPene var 187,7 ± 3,5 nm og zetapotensialet var -16,4 ± 0,4 mV (figur 1C og supplerende tabell 1). For å fremstille PNPE ble blandingen av PNP-løsning (0, 4%, w / v) og squalen ganske enkelt sonikert ved 100 w i 5 minutter (figur 1D). Etter optimalisering av den kontinuerlige fasen ble den oppnådde PNPE internt sammensatt av squalen og eksternt adsorbert med PNP (supplerende figur 1). Et optisk mikroskop ble brukt til å observere emulsjonsdråpene, og Mastersizer partikkelstørrelsesanalysator ble brukt til å bestemme størrelsesfordelingen. PNPE viste ikke mindre partikler for å forhindre koalescens av emulsjonene og ikke flere partikler til overskudd i den kontinuerlige fasen som forårsaker de større aggregatene (figur 1E). Som vist i figur 1F og supplerende tabell 1 var emulsjonsstørrelsen 2100 ± 300 nm og zetapotensialet var -27,1 ± 0,5 mV, noe som indikerer at partiklene aggregerte på olje/vann-grensesnittet. For å observere det cellulære opptaket av antigen ble Cy5-labled OVA adsorbert på PNPE. Til å begynne med ble 500 μL PNPE blandet med 500 μL Cy5-merket OVA ved romtemperatur i 1 time. Absorpsjonen av antigener på formuleringene ble testet ved hjelp av BCA-analyse. På grunn av det høye spesifikke overflatearealet og hydrofobisiteten ble mer enn 70,6% av fluidantigenene adsorbert på PNPE innen 1 time, noe som indikerer betydelig potensial for lasting av store mengder antigener på kort tid. Som kontrollgruppe ble også PMP og SSE karakterisert. PMP-ene var sammenlignbare i størrelse (1987 ± 310 nm) med PNPE. SSE var negativt ladet emulsjon (-15,9 ± 0,8 mV) med en diameterstørrelse på 147,2 ± 0,5 nm. I tillegg var belastningseffektiviteten til PMP og SSE bare 25,6 % ± henholdsvis 0,6 % og 23,4 % ± 0,2 % på grunn av begrenset adsorpsjon med antigener (supplerende tabell 1). I tillegg, for å evaluere stabiliteten til PNPE, ble den tilberedte PNPE lagret ved henholdsvis 4 °C og 25 °C. Lagerløsningens størrelse og zetapotensial ble bestemt på dagene 0-6 (1:50 fortynning). Som vist i supplerende figur 2, forble dråpene like i størrelse og zetapotensial under lagring ved 4 ° C og 25 ° C antydet høyere stabilitet av PNPE for levering av antigener. Deretter ble QCM-D brukt til å måle fleksibiliteten til PNPE. Som vist i figur 1G, som et resultat av sin stive struktur, viste PMP-ene lavere spredning (ΔD). Samtidig hadde PNPE en betydelig høyere ΔD, noe som viser sin utmerkede viskoelastisitet og fleksibilitet, noe som kan være en av årsakene til forbedret cellefeste og opptak.
For å validere PNPEs affinitet til BMDC-membranen, ble bEV-ene brukt til å erstatte de intakte cellene på grunn av deres tilpasningsstørrelse for nøyaktig QCM-D-deteksjon. I denne prosessen ble de modne BMDC-ene høstet og serielt ekstrudert gjennom polykarbonatmembranfiltre som inneholdt 10, 5 og 1 μm porestørrelser til fremstilte nanostørrelsesvesikler. De oppnådde bEV-ene ble samlet og renset via ultracentrifugation og re-suspendert i HEPES-bufret saltvann (figur 2A). Morfologien til de negativt fargede bEV-ene ble deretter utforsket ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM). En nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) ble brukt til å teste størrelsen på bEVs. Resultatene viste at bEV var lukkede lipid-tolags vesikulære former og fordelingen var homogen (figur 2B). NTA viste at størrelsesfordelingen av bEV-ene med toppdiameter av de rensede bEV-ene var 131 nm (figur 2C). Vi konkluderte derfor med at bEV-ene var en typisk membranstruktur med jevn fordeling, noe som tillot mer nøyaktighet i QCM-D-analysen som erstatning for BMDC-er.
Deretter ble vedheft av bEV til PNPE sporet ved hjelp av QCM-D. Først ble QCM-D SiO2-sensoren modifisert med PLL for å gi en positiv ladning for senere å fikse PNPE på overflaten og simulere bio-interfaseprosessen. Det ble umiddelbart etterfulgt av tilsetning av bEV-oppløsningen i kammeret for å belyse interaksjonen mellom PNPE og bEV (figur 3A). Som vist i figur 3B, indikerte den umiddelbare reduksjonen i frekvens (ΔF) en rask vedheft av bEV til PNPE etter treff. Videre ble ΔF redusert med økende bEV-konsentrasjon, noe som gjenspeiler en konsentrasjonsavhengig effekt. PNPE har en tettpakket overflate for å støtte landingsstedet; Videre viste den dynamiske krumningsendringer og lateral diffusjon for potent cellulær kontakt, noe som resulterte i høy affinitet til BMDC. PMP og SSE var derimot svakt bundet til bEV, selv ved høy konsentrasjon (80 μg/ml), noe som trolig skyldtes manglende kontaktpunkter med immuncellene (figur 3C).
Etter å ha bekreftet prosessen med adhesjon til BMDC, ble PNPE brukt til å levere antigen til BMDC. For å visualisere antigen-internaliseringsprofilene in vitro direkte, ble Cy5-merket OVA blandet med henholdsvis PMP, SSE og PNPE for å behandle med BMDC. Etter 6 timer etter behandling ble CLSM utført for å analysere det cellulære opptaket av Cy5-merket OVA i BMDC. Som vist i figur 4A indikerte Cy5-OVA-fluorescenssignalet at den totale mengden antigen internalisert i celler er betydelig høyere i PNPE-behandlede gruppen sammenlignet med den i PMP- og SSE-behandlede gruppen. Den kvantitative analysen av cellulært opptak ble videre utført, og viste en signifikant høyere relativ intensitet av fluorescens i BMDC behandlet med PNPE enn hos de som ble behandlet med PMP og SSE (p < 0,001), noe som bekreftet observasjonen ovenfor (figur 4B). De oppnådde resultatene viste at PNPE fremmet antigen-internaliseringen og effektivt leverte antigenet intracellulært. Følgelig var opptakseffektiviteten til antigener positivt assosiert med leveringssystemets affinitet til målrettede celler, og PNPE økte effektivt antigencellulært opptak via flernivåkontakt med cellemembranen.
Figur 1: Karakterisering av PLGA nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon. (A) Skjematisk av den eksperimentelle prosedyren som brukes til fremstilling av PLGA nanopartikler (PNPs). (B) Skanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av PNPs. Skala bar = 200 nm. (C) Størrelsesfordeling av PNPs. (D) Skjematisk av eksperimentell prosedyre som brukes til fremstilling av nanopartikkelstabilisert Pickering-emulsjon (PNPE). (E) Optiske mikrografer av PNPE. Skalalinje = 20 μm. (F) Størrelsesfordeling av PNPE. (G) Kvartskrystallmikrobalanse med spredningsovervåking (QCM-D) analyse av mykheten til PNPE, PLGA-mikropartikler (PMP) og overflateaktivt middelstabilisert emulsjon (SSE) gjennom påvisning av spredning (ΔD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakterisering av bio-mimetiske ekstracellulære vesikler. (A) Skjematisk av den eksperimentelle prosedyren som brukes til fremstilling av bio-mimetiske ekstracellulære vesikler (bEV). (B) Transmisjonselektronmikroskopi (TEM) bilder av bEVs. Skala bar = 200 nm. (C) Størrelsesfordeling av bEV målt ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: PNPEs affinitet til bEV-er analysert ved hjelp av QCM-D . (A) Skjematisk modifisering av PLL-overflaten gjennom PNPE-belegg. (B) Endringer i frekvens (ΔF) av PNPE etter møte med forskjellige konsentrasjoner av bEVs. (C) Sammenligning av endringer i ΔF i PLGA-mikropartikler (PMP), overflateaktivt middelstabilisert emulsjon (SSE) og PNPE. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Opptak av antigener. (A) Representativt diagram over det cellulære opptaket av antigener. Skalabar = 20 μm. (B) Relativ intensitetsfluorescens av cellulært opptak av antigener. Grafen viser gjennomsnittlig ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter. Enveis ANOVA ble brukt til å analysere betydningen av de observerte forskjellene. s < 0,001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Optimalisering av kontinuerlig fase. (A) Optiske mikrografer av PNPE konstruert av forskjellige kontinuerlige faser. Skalabar = 20 μm. (B) Størrelsene på emulsjonene ble detektert etter preparatet. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 2: Stabiliteten til PNPE. Størrelse (A) og zetapotensial (B) av PNPE etter 0, 3 og 6 dagers lagring ved de angitte temperaturene. Data ble vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Karakteriseringer av formuleringene. PNPs, PNPE og SSE ble utarbeidet i henhold til den angitte protokollen. Størrelsesfordelingene og zetapotensialet ble bestemt av dynamisk lysspredningsanalysator (DLS) eller Mastersizer partikkelstørrelsesanalysator. Lasteeffektiviteten ble evaluert ved hjelp av BCA-analysen. Data ble vist som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi utviklet PLGA nanopartikkelstabilisert olje / vannemulsjon som et leveringssystem for forbedret antigen internalisering. Den forberedte PNPE hadde en tettpakket overflate for å støtte landingsstedet og unik mykhet og fluiditet for potent cellulær kontakt med immuncellemembranen. Videre tilbød olje/vann-grensesnittet antigenbelastning med høyt innhold, og amfifil PLGA ga PNPE med høy stabilitet for transport av antigener til immunceller. PNPE kan raskt feste seg til overflaten av cellene, noe som indikerer at PLGA nanopartikkelstabilisert emulsjon har en sterk affinitet til cellemembranen for cellulært opptak. Videre hadde PNPE en høy sikkerhetsprofil fordi både squalen og PLGA er Food and Drug Administration (FDA) godkjente ingredienser30, som forventes å utnytte sikker overføring til klinikken.
Molekylvekten til PLGA og typen kontinuerlige og dispergerte faser påvirket PNPE-egenskapene, inkludert stabilitet og hydrofobisitet. I denne undersøkelsen ble 17 kDa molekylvekt PLGA nanopartikler valgt som stabilisator og squalen som dispergeringsfase, noe som resulterte i økt stabilitet. I tillegg forenklet avionisert vann som en kontinuerlig fase sammensetningen av formuleringen. Under denne tilstanden tillot PNPE effektiv montering av antigener og fremmet levering av antigener til immunceller. Videre ble metoden for en-trinns sonikering brukt til å forberede PNPE, som eliminerte den kjedelige prosessen og unngikk muligheten for forurensning. Det er viktig å merke seg at leveringssystemet sammensatt av PNPs og squalen må være en jevn kraft, ellers dannes ingen emulsjon eller den fremstilte PNPE er ikke jevn i størrelse.
Mens studier av leveringssystemets affinitet til celler var en ekstraordinær utfordring utført in vivo, kan in vitro-studier bidra til å belyse prosessen involvert i cellulær adhesjon og internalisering. Nylig har dette problemet fått mye oppmerksomhet på det biomedisinske feltet. Det er gjort en betydelig innsats for å belyse partiklenes affinitet til celler ved hjelp av flowcytometri og CLSM-analyse31,32. Selv om disse metodene gir en gjennomsnittlig avlesning på mobilnivå, blir de spesifikke dynamiske bindingsprosessene mellom celler og leveringssystemer ikke lett overvåket. I motsetning til dette er QCM hovedsakelig avhengig av en sensitiv piezoelektrisk krystall som ΔF endres med masse. Evnen til å oppdage små masseendringer gjør det mulig for QCM-D å overvåke de målrettede molekylære interaksjonene. Teknikken kan brukes til å overvåke sanntidshendelser, noe som gjør det mulig å studere PNPE-affinitet med BMDC-er under forskjellige forhold33.
Adhesjonen til PNPE ble undersøkt ved hjelp av bEV i stedet for intakte celler. Som de velkontrollerte enkle APC-ene, antas bEV-er å arve de fleste egenskapene til foreldrecellene. Generelt fungerer ekstracellulære vesikler med små og homogene partikkelstørrelser bedre i adhesjonsanalyser. Dermed ble bEV-ene fremstilt via ekstrudering gjennom polykarbonatfiltre medporestørrelsene 10, 5 og 1 μm 34. Diameteren og utbyttet av bEV-er kan kontrolleres ved å regulere antall profiler og porestørrelsen til polykarbonatmembraner. Det anbefales å lage 30 passerer gjennom polykarbonatmembranene. Imidlertid hadde denne metoden også en begrensning ved at en del av membranen kan være omvendt, noe som førte til at proteinene på DC-overflaten ble innkapslet i bEV-ene, noe som reduserte affiniteten til emulsjoner litt.
Det ble vist at modifikasjonen av SiO 2-sensoroverflatene ved bruk av positivt ladede proteiner var egnet for det påfølgende PNPE-belegget. Den beskrevne implementeringen av PLL (Polycation polypeptide) som mellomlag mellom SiO2 sensoroverflater og PNPE viste seg å være en forbedring for hurtigbeleggmetoden. Endringer i masse forårsaket av en hendelse, for eksempel ikke-spesifikke adsorpsjoner av en hvilken som helst komponent fra løsningsflyten på SiO2-sensoren, kan påvirke nøyaktigheten av eksperimentelle resultater35. Derfor var det nødvendig å sikre at PLL beholdt en konsistent kvalitet på brikken etter spinnbelegg, og overflaten ville bli fullstendig dekket av PNPE for å unngå målefeil forårsaket av ikke-spesifikk adsorpsjon. Samtidig, da ΔF ikke lenger endret seg under kontakten med den PNPE-holdige mobile fasen, ble chipoverflaten ansett som helt dekket. Dette sikret at de oppdagede signalene ble generert ved vedheft av bEV til PNPE. Vi viste at QCM-D var en god metode for å vise vedheft av bEV til PNPE i sanntid, noe som gjenspeiler den høye affiniteten til PNPE til APCer. Dessverre kunne denne metoden ikke gjenspeile samspillet mellom individuelle celler og leveringssystemet. Derfor vil en mer nøyaktig bestemmelse kreve ytterligere utforming av protokollen og optimalisering av måleprosedyren.
Etter å ha analysert PNPEs høye affinitet til bEV-er, ble forbedret internalisering ytterligere verifisert. Vi viste at det potente cellulære opptaket av antigener korrelerte med den høye affiniteten til PNPE. PNPE hadde flernivåstrukturen for effektiv lasting av antigener og fleksibilitet for flernivåkontakt med cellemembranen for å forbedre leveransen. Derfor stimulerte den rasjonelt utformede Pickering-emulsjonen cellulær internalisering og intracellulære veier gjennom den robuste interaksjonen med cellemembranen. Etter å ha demonstrert disse fordelene, kan PNPE kaste lys over utviklingen av nye, sikre og effektive antigenleveringssystemer for å forbedre vaksiner.
Denne protokollen demonstrerte vellykket PNPEs høye affinitet til fosfolipid-dobbeltlaget av immunceller og påfølgende intracellulær levering av antigenet til immunceller in vitro. Derfor kan ulike typer antigener fra forskjellige patogener leveres og karakteriseres ved hjelp av den foreslåtte protokollen for å gi beskyttelse mot smittsomme sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Project støttet av National Key Research and Development Program of China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), From 0 to 1 Original Innovation Project of Basic Frontier Scientific Research Program of Chinese Academy of Sciences (ZDBS-LY-SLH040), Foundation for Innovative Research Groups of the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
References
- Ma, G., Gu, Z., Wei, W. Advanced vaccine delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 183, 114170 (2022).
- Sharma, J., Carson, C. S., Douglas, T., Wilson, J. T., Joyce, S. Nano-particulate platforms for vaccine delivery to enhance antigen-specific cd8(+) t-cell response. Methods in Molecular Biology. 2412, 367-398 (2022).
- Nguyen, T. P., et al. Safety and immunogenicity of nanocovax, a sars-cov-2 recombinant spike protein vaccine: interim results of a double-blind, randomised controlled phase 1 and 2 trial. The Lancet Regional Health. Western Pacific. 24, 100474 (2022).
- Coates, E. E., et al. Safety and immunogenicity of a trivalent virus-like particle vaccine against western, eastern, and venezuelan equine encephalitis viruses: a phase 1, open-label, dose-escalation, randomised clinical trial. The Lancet Infectious Diseases. 22 (8), 1210-1220 (2022).
- Wei, L., et al. Efficacy and safety of a nanoparticle therapeutic vaccine in patients with chronic hepatitis b: a randomized clinical trial. Hepatology. 75 (1), 182-195 (2022).
- Krishnan, R., Kim, J. O., Qadiri, S. S. N., Kim, J. O., Oh, M. J. Early viral uptake and host-associated immune response in the tissues of seven-band grouper following a bath challenge with nervous necrosis virus. Fish & Shellfish Immunology. 103, 454-463 (2020).
- Mishra, D., Mishra, P. K., Dubey, V., Dabadghao, S., Jain, N. K. Evaluation of uptake and generation of immune response by murine dendritic cells pulsed with hepatitis b surface antigen-loaded elastic liposomes. Vaccine. 25 (39-40), 6939-6944 (2007).
- Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., Mccullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
- Jing, H., et al. Fluorescent artificial antigens revealed extended membrane networks utilized by live dendritic cells for antigen uptake. Nano Letters. 22 (10), 4020-4027 (2022).
- Meena, J., Goswami, D. G., Anish, C., Panda, A. K. Cellular uptake of polylactide particles induces size dependent cytoskeletal remodeling in antigen presenting cells. Biomaterials Science. 9 (23), 7962-7976 (2021).
- Yang, J., et al. Drug delivery via cell membrane fusion using lipopeptide modified liposomes. ACS Central Science. 2 (9), 621-630 (2016).
- Rawle, R., Kasson, P., Boxer, S. Disentangling viral membrane fusion from receptor binding by using synthetic dna-lipid conjugates totether influenza virus to model lipid membranes. Biophysical Journal. 111 (1), 123-131 (2016).
- Ha, H. K., Kim, J. W., Lee, M. R., Jun, W., Lee, W. J. Cellular uptake and cytotoxicity of β-lactoglobulin nanoparticles: the effects of particle size and surface charge. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 28 (3), 420-427 (2015).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Dankovich, T. M., et al. Extracellular matrix remodeling through endocytosis and resurfacing of tenascin-r. Nature Communications. 12 (1), 7129 (2021).
- Evans, E., Buxbaum, K. Affinity of red-blood-cell membrane for particle surfaces measured by the extent of particle encapsulation. Biophysical Journal. 34 (1), 1-12 (1981).
- Rohner, N. A., Purdue, L. N., Von Recum, H. A. Affinity-based polymers provide long-term immunotherapeutic drug delivery across particle size ranges optimal for macrophage targeting. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (4), 1693-1700 (2021).
- Zhou, X., Liu, Y., Wang, X. F., Li, X. M., Xiao, B. Effect of particle size on the cellular uptake and anti-inflammatory activity of oral nanotherapeutics. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 187, 110880 (2020).
- Zhang, D., et al. The morphology and surface charge-dependent cellular uptake efficiency of upconversion nanostructures revealed by single-particle optical microscopy. Chemical Science. 13 (12), 3610 (2022).
- Xi, Y. K., et al. Co2-responsive pickering emulsions stabilized by soft protein particles for interfacial biocatalysis. Chemical Science. 13 (10), 2884-2890 (2022).
- Trivedi, R. P., Klevets, I. I., Senyuk, B., Lee, T., Smalyukh, I. I. Reconfigurable interactions and three-dimensional patterning of colloidal particles and defects in lamellar soft media. Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 109 (13), 4744-4749 (2012).
- De Araujo, A. D., Hoang, H. N., Lim, J., Mak, J. Y. W., Fairlie, D. P. Tuning electrostatic and hydrophobic surfaces of aromatic rings to enhance membrane association and cell uptake of peptides. Angewandte Chemie. 61 (29), 03995 (2022).
- Waku, T., et al. Effect of the hydrophilic-hydrophobic balance of antigen-loaded peptide nanofibers on their cellular uptake, cellular toxicity, and immune stimulatory properties. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3781 (2019).
- Meng, X., et al. A soft pickering emulsifier made from chitosan and peptides endows stimuli-responsiveness, bioactivity and biocompatibility to emulsion. Carbohydrate Polymers. 277, 118768 (2022).
- Wang, Z., et al. Fabrication and in vitro/vivo evaluation of drug nanocrystals self-stabilized pickering emulsion for oral delivery of quercetin. Pharmaceutics. 14 (5), 897 (2022).
- Ji, J., et al. Core-shell-structured silica/polyacrylate particles prepared by pickering emulsion: influence of the nucleation model on particle interfacial organization and emulsion stability. Nanoscale Research Letters. 9 (1), 534 (2014).
- Chen, l, et al. Quantitative evaluation of proteins with bicinchoninic acid (bca): resonance raman and surface-enhanced resonance raman scattering-based methods. Analyst. 137 (24), 5834-5838 (2012).
- Colino, J., Shen, Y., Snapper, C. M. Dendritic cells pulsed with intact streptococcus pneumoniae elicit both protein- and polysaccharide-specific immunoglobulin isotype responses in vivo through distinct mechanisms. The Journal of Experimental Medicine. 195 (1), 1-13 (2002).
- Zhang, Y., Wu, J., Zhang, H., Wei, J., Wu, J. Extracellular vesicles-mimetic encapsulation improves oncolytic viro-immunotherapy in tumors with low coxsackie and adenovirus receptor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 574007 (2020).
- Cappellano, G., Abreu, H., Casale, C., Dianzani, U., Chiocchetti, A. Nano-microparticle platforms in developing next-generation vaccines. Vaccines. 9 (6), 606 (2021).
- McClelland, R. D., Culp, T. N., Marchant, D. J. Imaging flow cytometry and confocal immunofluorescence microscopy of virus-host cell interactions. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 11, 749039 (2021).
- Konry, T., Sarkar, S., Sabhachandani, P., Cohen, N. Innovative tools and technology for analysis of single cells and cell-cell interaction. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 18 (1), 259-284 (2016).
- D'Aurelio, R., et al. A comparison of EIS and QCM nanoMIP-based sensors for morphine. Nanomaterials. 11 (12), 3360 (2021).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. Journal of Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Rydell, G. E., Dahlin, A. B., Hook, F., Larson, G. QCM-D studies of human norovirus VLPs binding to glycosphingolipids in supported lipid bilayers reveal strain-specific characteristics. Glycobiology. 19 (11), 1176-1184 (2009).
