Summary
Para projetar racionalmente adjuvantes eficientes, desenvolvemos emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-láticas-co-glicólicas (PNPE). O PNPE possuía maciez única e uma interface hidrofóbica para contato celular potente e oferecia carga de antígenos de alto conteúdo, melhorando a afinidade celular do sistema de entrega às células apresentadoras de antígenos e induzindo a internalização eficiente de antígenos.
Abstract
A afinidade celular das micro-/nanopartículas é a pré-condição para o reconhecimento celular, absorção celular e ativação, que são essenciais para a entrega de medicamentos e resposta imune. O presente estudo resultou da observação de que os efeitos da carga, tamanho e forma de partículas sólidas sobre a afinidade celular são geralmente considerados, mas raramente percebemos o papel essencial da suavidade, do fenômeno de reestruturação dinâmica e da interação de interface complexa na afinidade celular. Aqui, desenvolvemos a emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas poli-lática-co-glicólica (PLGA) que superou as deficiências de formas rígidas e simulou a flexibilidade e fluidez de patógenos. Um método foi criado para testar a afinidade do PNPE com as superfícies celulares e elaborar a subsequente internalização por células imunes. A afinidade do PNPE com vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs) - substitutas das células dendríticas da medula óssea (BMDCs) - foi determinada por meio de um microequilíbrio de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D), que permitiu o monitoramento em tempo real da adesão célula-emulsão. Posteriormente, o PNPE foi utilizado para a entrega do antígeno (ovalbumina, OVA) e a captação dos antígenos pelos BMDCs foi observada por meio de microscópio confocal de varredura a laser (CLSM). Resultados representativos mostraram que o PNPE diminuiu imediatamente a frequência (ΔF) quando encontrou os bEVs, indicando rápida adesão e alta afinidade do PNPE aos BMDCs. PNPE mostrou ligação significativamente mais forte à membrana celular do que as micropartículas PLGA (PMPs) e Adjuvante AddaVax (denotado como nanoemulsão estabilizada por surfactante [SSE]). Além disso, devido à maior afinidade celular com os imunócitos através de alterações dinâmicas de curvatura e difusões laterais, a captação de antígenos foi subsequentemente aumentada em comparação com PMPs e SSE. Este protocolo fornece insights para o projeto de novas formulações com alta afinidade celular e internalização eficiente de antígenos, fornecendo uma plataforma para o desenvolvimento de vacinas eficientes.
Introduction
Para combater doenças epidêmicas, crônicas e infecciosas, é imprescindível o desenvolvimento de adjuvantes eficazes para a vacinação profilática e terapêutica 1,2. Idealmente, os adjuvantes devem possuir excelente segurança e ativação imunológica 3,4,5. Acredita-se que a captação e o processo efetivos de antígenos por células apresentadoras de antígenos (APCs) sejam um estágio essencial nas cascatas de sinalização a jusante e no início da resposta imune 6,7,8. Assim, obter uma compreensão clara do mecanismo de interação das células imunes com antígenos e projetar adjuvantes para melhorar a internalização são estratégias eficientes para aumentar a eficiência das vacinas.
Micro/nanopartículas com propriedades únicas têm sido previamente investigadas como sistemas de liberação de antígenos para mediar a captação celular de antígenos e a interação celular com padrões moleculares associados a patógenos 9,10. Ao entrar em contato com as células, os sistemas de liberação passam a interagir com a matriz extracelular e a membrana celular, o que levou à internalização e subsequentes respostas celulares11,12. Estudos prévios trouxeram à tona que a internalização de partículas ocorre por meio da adesão membrana celular-partícula13, seguida de deformação flexível da membrana celular e difusão do receptor para a membrana superficial14,15. Nessas circunstâncias, as propriedades do sistema de entrega dependem da afinidade com as APCs, que posteriormente afetam a quantidade de captação16,17.
Para obter insights sobre o design do sistema de entrega para melhorar a resposta imune, esforços extensivos têm se concentrado na investigação da relação entre as propriedades das partículas e a absorção celular. O presente estudo decorreu da observação de que micro/nanopartículas sólidas com várias cargas, tamanhos e formas são frequentemente estudadas sob essa luz, enquanto o papel da fluidez na internalização de antígenos é pouco investigado18,19. De fato, durante a adesão, as partículas moles demonstraram mudanças dinâmicas de curvatura e difusões laterais para aumentar a área de contato para interações multivalentes, que dificilmente podem ser replicadas pelas partículas sólidas20,21. Além disso, as membranas celulares são bicamadas fosfolipídicas (esfingolípidos ou colesterol) no local da absorção, e substâncias hidrofóbicas podem alterar a entropia conformacional dos lipídios, reduzindo a quantidade de energia necessária para a captação celular22,23. Assim, amplificar a mobilidade e promover a hidrofobicidade do sistema de entrega pode ser uma estratégia eficaz para fortalecer a internalização do antígeno para melhorar a resposta imune.
A emulsão pickering, estabilizada por partículas sólidas montadas na interface entre dois líquidos imiscíveis, tem sido amplamente utilizada no campo biológico24,25. De fato, as partículas agregadas na interface óleo/água determinam a formulação de estruturas multinível, que promovem interações multinível entre sistema de entrega multinível e células e induzem ainda mais propriedades físico-químicas multifuncionais na entrega de medicamentos. Devido à sua deformabilidade e mobilidade lateral, esperava-se que as emulsões de Pickering entrassem em interação celular multivalente com os imunócitos e fossem reconhecidas pelas proteínas da membrana26. Além disso, como os núcleos de micela oleosos nas emulsões de Pickering não são completamente cobertos com partículas sólidas, as emulsões de Pickering possuem lacunas de tamanhos diferentes entre as partículas na interface óleo/água, o que causa maior hidrofobicidade. Assim, é crucial explorar a afinidade das emulsões de Pickering com APCs e elaborar a internalização subsequente para desenvolver adjuvantes eficientes.
Com base nessas considerações, projetamos uma emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas (PNPE) PLGA como um sistema de entrega de vacinas de fluidez que também ajudou a obter informações valiosas sobre a afinidade do PNPE com BMDCs e internalização celular. A adesão em tempo real de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs; uma substituição de BMDCs) ao PNPE foi monitorada por meio de um método livre de rótulo usando um microequilíbrio de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D). Após a caracterização da afinidade do PNPE com os BMDCs, a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) foi utilizada para determinar a captação do antígeno. O resultado indicou a maior afinidade do PNPE com os BMDCs e a internalização eficiente do antígeno. Antecipamos que o PNPE apresentaria maior afinidade com as APCs, o que pode estimular melhor a internalização de antígenos para melhorar as respostas imunes.
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Protocol
Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Instituto de Engenharia de Processos da Academia Chinesa de Ciências. Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com os Regulamentos para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e Diretriz para Revisão Ética de Animais (China, GB / T35892-2018).
1. Preparação e caracterização de nanopartículas de PLGA
- Preparação de nanopartículas PLGA (PNPs)
- Adicionar 0,5 g de álcool polivinílico (PVA) a 120 ml de água desionizada a 90 °C e agitar até dissolver completamente para preparar a solução de PVA. Conservar a solução no frigorífico (4 °C) após arrefecimento até à temperatura ambiente.
- Adicione 100 mg de PLGA a 10 mL de mistura de acetona e etanol (proporção de 4:1) para servir como a fase oleosa.
- Colocar 20 ml de solução aquosa de PVA por baixo do exaustor e agitar magneticamente a 400 rpm/min. Adicione 5 mL da fase oleosa à solução de PVA, gota a gota, usando uma bomba de seringa. Em seguida, mexa a mistura no exaustor até que os solventes orgânicos evaporem completamente.
NOTA: Com o aumento da concentração das partículas na fase oleosa, a solução da fase de água gradualmente se transforma em um branco azulado claro e transparente ou branco leitoso. - Após a volatilização dos solventes orgânicos (2-3 h), centrifugar a mistura a 15.000 x g. Lave três ou mais vezes até que a água de lavagem final esteja límpida e transparente.
NOTA: O objetivo desta etapa é principalmente lavar o PVA residual na superfície da partícula para evitar que ele afete a preparação da emulsão de Pickering. - Ressuscitou os PNPs lavados em 2 mL de água deionizada e congelou a mistura a -80 °C por 24 h. Subsequentemente, liofilizar as partículas em um liofilizador por 48-72 h. Os PNPs preparados são de bando branco.
- Caracterização dos PNPs
- Para caracterizar o tamanho e o potencial zeta dos PNPs, adicionar 10 μL de PNPs em 1 mL de água deionizada para obter solução diluente e transferir a solução diluente para uma célula DTS1070. Ligue o computador e o analisador dinâmico de dispersão de luz (DLS) e, em seguida, coloque a célula DTS1070 no sistema DLS.
- Clique no Zeta Size Software e crie um novo arquivo de medição para configurar o procedimento de determinação. Em seguida, inicie o procedimento de determinação para obter o tamanho da partícula e a distribuição do potencial zeta.
- Para observar a morfologia dos PNPs, espalhe uniformemente a solução de 0,1 mL de PNPs (diluída 40 vezes) em uma folha de papel alumínio de 5 cm x 5 cm e deixe a água evaporar naturalmente em um exaustor bem ventilado durante a noite.
- Recorte uma pequena parte da folha de estanho e prenda-a na mesa de amostra com fita condutora. Pulverize-o com ouro a uma corrente de 10 mA por 120 s. Posteriormente, observe a morfologia da superfície da amostra usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
2. Elaboração e caracterização do PNPE
- Para preparar o PNPE, adicione PNPs liofilizados à água deionizada a uma concentração de 4 mg/mL (a fase aquosa) e, em seguida, adicione esqualeno como a fase oleosa. Prepare o PNPE através de sonicação de uma etapa por 5 min a 100 W em um sonicator de banho de água. A relação de fase óleo-água é de 1:9.
- Caracterização do PNPE preparado
- Abra o software Mastersizer 2000 e o laser em sequência. Clique em Medida para abrir o programa predefinido e definir o nome do exemplo. Clique em Iniciar para começar a medir o fundo da amostra e, em seguida, usando um conta-gotas, adicione 1 mL de PNPE ao tanque de amostra do analisador de tamanho de partícula a laser para medir o tamanho da partícula da emulsão três vezes em paralelo.
- Diluir 20 μL de PNPE em 1 mL de água deionizada. Solte 20 μL da emulsão no slide. Observar a morfologia e homogeneidade da emulsão utilizando microscopia óptica com ampliação de 40x e obter fotografias.
- Eficiência de carregamento de antígenos
- Dissolver 200 μg de ovalbumina (OVA) em 500 mL de água deionizada. Em seguida, misture com 500 mL de PNPE preparado e agite por 1 h à temperatura ambiente. Remover o antigénio fluídico por centrifugação a 5000 x g durante 20 minutos.
- Determinar as concentrações de antígenos fluídicos usando ensaios de ácido bicinchonínico (BCA)27. A fórmula para calcular a eficiência de carregamento do antígeno é a seguinte:
Eficiência de carga do antígeno =
Use o mesmo método para determinar a eficiência de carregamento de antígenos do ESS que é usado como um grupo controle.
- Estabilidade do PNPE
- Divida 6 mL do PNPE preparado em seis porções iguais e armazene três partes cada a 4 °C e 25 °C, respectivamente. Diluir 20 μL de PNPE armazenado em 1 mL de água deionizada (1:50) nos dias 0, 3 e 6. Em seguida, medir o tamanho e o potencial zeta das soluções-tronco PNPE mantidas em diferentes temperaturas.
NOTA: As diferentes temperaturas de armazenamento são definidas para comparar o efeito de diferentes temperaturas na estabilidade do PNPE, o que pode otimizar a condição de armazenamento para alta estabilidade e longa vida útil.
- Divida 6 mL do PNPE preparado em seis porções iguais e armazene três partes cada a 4 °C e 25 °C, respectivamente. Diluir 20 μL de PNPE armazenado em 1 mL de água deionizada (1:50) nos dias 0, 3 e 6. Em seguida, medir o tamanho e o potencial zeta das soluções-tronco PNPE mantidas em diferentes temperaturas.
- Preparação de micropartículas PLGA (PMPs)
- Dissolva 500 mg de PLGA em 5 mL de diclorometano como fase oleosa e, em seguida, despeje em 50 mL de fase aquosa externa contendo 1,5% de PVA para obter a mistura óleo/água. Homogeneizar a mistura a 3000 rpm durante 1 min utilizando um homogeneizador para obter emulsões grossas.
- Manter a uniformidade do tamanho das partículas PLGA das microesferas (determinado por emulsões grossas) por emulsificação de membrana. Instale uma membrana de 5,2 μm no tubo de membrana. Ajuste a pressão para 800 kPa e mantenha-se estável.
- Abra a válvula de escape e a válvula de alimentação e, depois de adicionar as emulsões grossas ao tanque de amostra, feche a válvula de escape e a válvula de alimentação, abra a válvula de descarga e a válvula de entrada e pegue a emulsão pós-filme em um copo de 200 mL. Repita o processo três vezes para obter emulsões pré-duplas.
- Mexa as emulsões pré-duplas para evaporar o diclorometano à temperatura ambiente para curar as microesferas. Lave as microesferas usando água deionizada a 7741 x g por 3 min cinco vezes. Pré-congelar em congelador a -80 °C e, finalmente, liofilizar para obter microesferas secas.
- Caracterização dos PMPs
- Abra o software Mastersizer 2000 e o laser em sequência. Clique em Medida para abrir o programa predefinido e definir o nome do exemplo. Clique em Iniciar para começar a medir o fundo da amostra. Em seguida, adicione 1 mL de PMPs ao tanque de adição de amostra do analisador de tamanho de partícula a laser com um conta-gotas e meça o tamanho das partículas das micropartículas três vezes em paralelo.
- Análise de suavidade
NOTA: O PNPE foi revestido no sensor SiO2 para medir a suavidade.- Limpe o chip sensor de quartzo SiO 2 por tratamento de ozônio UV por 10 min, enxágue duas vezes com 5 mL de etanol (75% v/v) e seque com N2. Instale o chip sensor de quartzo SiO2 vazio na célula de fluxo.
- Ligue o computador e ative o controle de temperatura no canto inferior direito do software para garantir que a temperatura definida esteja aproximadamente 1 °C abaixo da temperatura ambiente.
- Clique no botão Aquisição na barra de ferramentas e selecione Medição de configuração para procurar as oitavas de 1, 3, 5, 7, 9 e 11 do chip no canal usado. Clique no botão Aquisição na barra de ferramentas e selecione Iniciar medição.
- Corrija a linha de base com air e, quando a linha de base estiver equilibrada, selecione Parar e salve o arquivo como um espaço em branco.
- Limpe o chip e gire 10 μg/mL de PNPE no chip. Resumidamente, ligue o revestidor giratório e defina o parâmetro de operação. Conecte o tubo N2 ao revestidor de spin, ajuste o fracionamento do cilindro de gás para 0,4 kPa e coloque o chip limpo na ventosa do revestidor de spin. Adicione 100 μL de PNPE dropwise ao centro do sensor SiO2 e feche a tampa superior do revestidor de rotação para completar o revestimento.
- Instale o chip revestido PNPE na célula de fluxo. Repita as etapas 2.7.3-2.7.4 e salve o arquivo como PNPE. Abra os arquivos em branco e PNPE e clique no botão Ponto para obter os dados relacionados de dissipação (ΔD).
3. Isolar e cultivar BMDCs 28
NOTA: Certifique-se de que todos os reagentes e amostras são colocados no gelo, pois isso tem um efeito positivo na atividade celular. Para manter a esterilidade, execute todas as etapas em uma bancada ultra-limpa usando utensílios estéreis.
- Eutanasiar os camundongos C57BL/6 (fêmea, 6-8 semanas de idade) via inalação de CO2 e mergulhá-los em etanol a 70% (v/v) para uma breve esterilização.
- Depois de mergulhar por 3-5 min, transfira os ratos para um banco super limpo. Remova os músculos das pernas usando uma tesoura de aço inoxidável para expor o fêmur e a tíbia e, em seguida, separe o fêmur e a tíbia.
- Encha uma placa de Petri com 70% (v / v) de etanol e mergulhe os ossos limpos por 5-10 s para completar a esterilização externa. Limpe todos os ossos e coloque-os em um tubo estéril com gelo ao redor deles.
- Apare o fêmur e a tíbia perto da articulação usando uma tesoura. Insira a agulha da seringa no osso para lavar a medula óssea em um tubo de centrífuga usando meio RPMI pré-resfriado (1640).
- Enxágue duas ou três vezes até que o osso esteja completamente branco. Pipete a medula óssea várias vezes para separar todos os aglomerados. Filtre as células em um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma peneira de 40 μm de diâmetro.
- Centrífuga a 4 °C e 500 x g durante 5 min. Descarte o sobrenadante e adicione 2 mL de lisado eritrocitário ao sedimento por 4 min.
- Após a lavagem duas ou três vezes, ressuspender as células em 2 mL de meio completo (1% de penicilina-estreptomicina, 10% de soro fetal bovino, 20 ng/mL de IL-4 e 10 ng/mL de GM-CSF). Em seguida, dilua 10 μL de células em 1 mL de PBS e insira o chip do contador de células automatizado portátil na diluição celular para contagem de células. Finalmente, células de sementes a uma densidade de 1 x 106 células/mL em um prato de cultura de 10 mm com um meio completo.
- Cultivar as células em uma incubadora de células com 5% de CO2 a 37 °C. Mude o meio a cada 2 dias. No dia 7, transfira as células para o tubo de 50 mL e centrifugar a 450 x g por 5 min para coletar as células.
4. Preparação de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs)
- Monte a miniextrusora em sequência de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que o invólucro da seringa não está rachado antes de usá-lo. Certifique-se de que todos os O-rings estejam em boas condições antes de cada experimento e substitua os desgastados ou danificados imediatamente. Anéis O desgastados ou danificados podem causar liberação súbita de pressão ao operar a extrusora.
- Aspirar os BMDCs repetidamente e transferi-los para um tubo de centrífuga. Colher as células por centrifugação a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Pressurizar as suspensões celulares através de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm e 1 μm por 30 passagens usando a miniextrusora29.
NOTA: Para permitir a uniformidade do tamanho do bEV, as suspensões BMDC foram empurradas através de membranas de policarbonato de 10 μm, 5 μm e 1 μm por 30 passagens. Além disso, durante a operação, certifique-se de aplicar a força uniformemente e manter a direção da força ao longo do eixo da seringa. - Centrifugar os sobrenadantes agrupados durante 5 minutos a 1000 x g e 4 °C para remover as células. Recolher o sobrenadante e centrifugar-o a 3000 x g durante 5 minutos a 4 °C para remover as restantes células e detritos celulares.
- Recolher o sobrenadante e centrifugar-o a 100.000 x g durante 90 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuscite os bEVs em 2 mL de solução salina tamponada com HEPES (HBS). Purificar os bEVs através de filtração através de uma membrana de 0,45 μm e armazenar os bEVs purificados a -80 °C.
5. bEVs aderem ao PNPE
NOTA: O sensor SiO2 foi modificado através do método de revestimento por spin.
- Sensor SiO2 modificado com poli-L-lisina (PLL).
- Limpe o chip sensor de quartzo SiO 2 usando o tratamento de ozônio UV por 10 min, enxágue duas vezes com etanol e seque com N2.
- Ligue o revestidor giratório pressionando o botão liga/desliga , pressione o botão Controle e defina o tempo e a velocidade do revestimento. A velocidade de rotação inicial é de 400 rpm, que é constantemente aumentada para 5000 rpm.
- Conecte o tubo N2 ao revestidor de rotação e ajuste o fracionamento do cilindro de gás para 0,4 kPa. Coloque o chip limpo na ventosa do revestidor de fiação. Adicione 100 μL de PLL dropwise ao centro do sensor SiO2 e feche a tampa superior do revestidor de rotação.
- Pressione o botão Iniciar para começar a revestir a amostra e parar a máquina quando terminar. Desligue a bomba de vácuo, desligue os botões de Energia e Controle e remova o sensor SiO2 modificado por PLL.
NOTA: Antes de pressionar Iniciar, certifique-se de que o tempo e a velocidade do revestimento foram definidos. Além disso, certifique-se de que o sensor SiO2 é colocado no centro da ventosa. Certifique-se de que a tampa está fechada antes de executar o processo para evitar acidentes.
- Determinação da adesão de bEVs ao PNPE
- Ligue o computador, a unidade eletrônica, a bomba peristáltica e ative o controle de temperatura no canto inferior direito do software para garantir que a temperatura definida esteja aproximadamente 1 °C abaixo da temperatura ambiente.
- Coloque os sensores SiO2 modificados por PLL na célula de fluxo de acordo com as instruções de operação e conecte a linha de medição entre a célula de fluxo e a bomba de fluxo. Coloque a célula de fluxo dentro do sistema do módulo de fluxo e lave-a com água ultrapura antes de iniciar os experimentos.
- Clique na barra de ferramentas Aquisição e selecione Medição de configuração para procurar 1, 3, 5, 7, 9 e 11 oitavas do chip no canal usado. Para corrigir a linha de base, clique em Iniciar Medição para permitir que o ar entre no módulo de fluxo até que a linha de base do ar esteja lisa. Posteriormente, o fluxo de água deionizada por 10-15 min para permitir o equilíbrio da linha de base da solução novamente.
- Bombear a solução PNPE preparada para o módulo de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 μL/min para obter adsorção de equilíbrio no sensor SiO2 .
NOTA: O ΔF não muda mais quando o PNPE é bombeado para o módulo de fluxo novamente, indicando que a superfície dos sensores SiO2 foi completamente coberta com PNPE. - Bombear a solução de bEVs preparada para o módulo de fluxo a uma taxa de fluxo de 50 μL/min para rastrear o processo de adesão do bEV à superfície do PNPE.
6. Análise CLSM da captação de antígenos
- Co-cultura PNPE-OVA com BMDCs
- Incubar os BMDCs com 1640 meios completos (1% de penicilina-estreptomicina, 10% de soro fetal bovino, 20 ng/mL de IL-4 e 10 ng/mL de GM-CSF) por 7 dias e, em seguida, semeá-los em pequenas placas de laser confocais a 1 x 106 por poço durante a noite a 37 °C em uma incubadora de CO2 a 5%.
- Misture 0,5 mL de OVA marcado com Cy5 (400 μg/mL) com 0,5 mL de PNPE por 1 h e remova o antígeno fluídico por centrifugação a 5000 x g por 20 min para desenvolver a formulação da vacina. Após a re-suspensão com 200 μL de água deionizada, adicionar 10 μL da formulação (10 μg/mL de OVA) nas pequenas placas a laser confocais sob uma bancada super-limpa e co-cultura com BMDCs por 6 h.
- Coloração do citoesqueleto de actina
- Remova o fluido de cultura das células e lave-as duas vezes com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS; pH 7,4).
- Fixar as células com solução de formaldeído a 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. Durante a fixação, evite fixadores contendo metanol, que podem destruir a actina.
- Lave as células com PBS duas ou três vezes à temperatura ambiente durante 10 minutos cada. Permeabilizar as células com 100 μL de solução de Triton X-100 a 0,5% por 5 min à temperatura ambiente. Lave as células com PBS duas ou três vezes à temperatura ambiente por 10 minutos cada novamente.
- Cubra as células no prato com fundo de vidro das pequenas placas de laser confocais com 200 μL de solução de trabalho de faloidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e incube por 30 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para reduzir o sinal de fundo, adicione albumina sérica bovina a 1% à solução de trabalho de faloidina conjugada com FITC. Além disso, cubra a tampa das pequenas placas de laser confocais durante a incubação para evitar a evaporação da solução.
- Lave as células com PBS thre vezes por 5 min cada. Re-corar os núcleos com 200 μL de solução DAPI (concentração: 100 nM) por cerca de 30 s.
- Análise de imagem
- Ligue o hardware do microscópio confocal em sequência, incluindo o laser, o confocal, o microscópio e o computador. Clique no software NIS-Elements AR 5.20.00 e selecione Nikon Confocal para entrar no sistema de teste.
- No sistema de microscópio confocal, ligue as várias unidades na ordem indicada. Primeiro, configure os canais FITC, DAPI e Cy5 e ajuste o HV e o deslocamento correspondentes. Em seguida, selecione a lente de óleo 100x e coloque uma gota de óleo de cedro na parte superior. Coloque as pequenas placas de laser confocais contendo BMDCs coradas no palco do microscópio.
- Clique no botão Digitalizar . Sob um microscópio de fluorescência, localize as células de interesse movendo os eixos X, Y e Z. Ajuste a intensidade do laser, o tamanho da imagem e outros parâmetros para permitir a digitalização de imagens confocais de alta qualidade. Finalmente, clique no botão Capturar e salve as imagens.
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Representative Results
Uma sonificação simples de uma etapa foi utilizada para a obtenção da PNPE. Primeiramente, foram preparados PNPs uniformes para uso como estabilizador sólido (Figura 1A). A morfologia das PNPs foi observada por meio da EPM, mostrando que elas são, em sua maioria, uniformes e esféricas (Figura 1B). O tamanho hidrodinâmico e o potencial zeta das formulações foram detectados via DLS. O diâmetro dos PNPs foi de 187,7 ± 3,5 nm e o potencial zeta foi de -16,4 ± 0,4 mV (Figura 1C e Tabela Suplementar 1). Para o preparo da PNPE, a mistura de solução de PNP (0,4%, p/v) e esqualeno foi simplesmente sonicada a 100 w por 5 min (Figura 1D). Após a otimização da fase contínua, a EPN obtida foi composta internamente por esqualeno e adsorvida externamente com PNPs (Figura 1 Suplementar). Um microscópio óptico foi empregado para observar as gotículas de emulsão, e o analisador de tamanho de partícula Mastersizer foi usado para determinar a distribuição de tamanho. O PNPE não exibiu menos partículas para evitar a coalescência das emulsões e não mais partículas em excesso na fase contínua que causam os agregados maiores (Figura 1E). Como mostra a Figura 1F e a Tabela Suplementar 1, o tamanho da emulsão foi de 2100 ± 300 nm e o potencial zeta foi de -27,1 ± 0,5 mV, indicando que as partículas se agregaram na interface óleo/água. Para observar a captação celular do antígeno, o OVA com lábios Cy5 foi adsorvido no PNPE. Para começar, 500 μL de PNPE foram misturados com o OVA marcado com Cy5 de 500 μL à temperatura ambiente por 1 h. A absorção de antígenos nas formulações foi testada por meio do ensaio de BCA. Devido à sua alta área de superfície específica e hidrofobicidade, mais de 70,6% dos antígenos fluídicos foram adsorvidos no PNPE em 1 h, indicando potencial substancial para o carregamento de grandes quantidades de antígenos em um curto espaço de tempo. Como grupo controle, PMPs e ESS também foram caracterizados. Os PMPs foram comparáveis em tamanho (1987 ± 310 nm) ao PNPE. O SSE foi emulsão carregada negativamente (-15,9 ± 0,8 mV) com um diâmetro de 147,2 ± 0,5 nm. Além disso, a eficiência de carga de PMPs e ESS foi de apenas 25,6% ± 0,6% e 23,4% ± 0,2%, respectivamente, devido à adsorção limitada com antígenos (Tabela Suplementar 1). Além disso, para avaliar a estabilidade da PNPE, as PNPE preparadas foram armazenadas a 4 °C e 25 °C, respectivamente. O tamanho e o potencial zeta da solução-mãe foram determinados nos dias 0-6 (diluição 1:50). Como mostrado na Figura 2 Suplementar, as gotículas permaneceram semelhantes em tamanho e o potencial zeta durante o armazenamento a 4 °C e 25 °C sugeriu maior estabilidade do PNPE para a entrega de antígenos. Em seguida, utilizou-se o QCM-D para medir a flexibilidade da PNPE. Como mostra a Figura 1G, em decorrência de sua estrutura rígida, os PMPs apresentaram menor dissipação (ΔD). Ao mesmo tempo, a EPNP apresentou um ΔD significativamente maior, demonstrando sua excelente viscoelasticidade e flexibilidade, o que pode ser uma das razões para a melhora da fixação e captação celular.
Para validar a afinidade do PNPE com a membrana dos BMDCs, os bEVs foram utilizados para substituir as células intactas devido ao seu tamanho de ajuste para a detecção precisa do QCM-D. Neste processo, os BMDCs maduros foram colhidos e extrudados em série através de filtros de membrana de policarbonato que continham tamanhos de poros de 10, 5 e 1 μm para vesículas nanométricas preparadas. Os bEVs obtidos foram coletados e purificados via ultracentrifugação e ressuspensos em solução salina tamponada com HEPES (Figura 2A). A morfologia dos bEVs corados negativamente foi então explorada por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Uma análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) foi usada para testar o tamanho dos bEVs. Os resultados revelaram que os bEVs eram formas vesiculares fechadas em bicamadas lipídicas e a distribuição foi homogênea (Figura 2B). A NTA mostrou que a distribuição de tamanho dos bEVs com diâmetro máximo dos bEVs purificados foi de 131 nm (Figura 2C). Concluímos, assim, que os bEVs eram uma estrutura de membrana típica com distribuição uniforme, o que permitiu maior acurácia no ensaio QCM-D como substituto dos BMDCs.
Em seguida, a adesão dos bEVs ao PNPE foi rastreada por meio do QCM-D. Primeiro, o sensor QCM-D SiO2 foi modificado com PLL para conferir uma carga positiva para posteriormente fixar o PNPE na superfície e simular o processo de bio-interfase. Seguiu-se imediatamente a adição da solução de bEV à câmara para elucidar a interação entre a PNPE e as bEVs (Figura 3A). Como mostra a Figura 3B, a diminuição imediata da frequência (ΔF) indicou uma rápida adesão dos bEVs ao PNPE após o encontro. Além disso, o ΔF diminuiu com o aumento da concentração de bEV, refletindo um efeito dependente da concentração. O PNPE tem uma superfície densamente compactada para suportar o ponto de pouso; além disso, apresentou alterações dinâmicas de curvatura e difusão lateral para contato celular potente, resultando em alta afinidade com BMDCs. Em contraste, PMPs e SSE foram fracamente ligados aos bEVs, mesmo em alta concentração (80 μg/mL), o que provavelmente resultou da falta de locais de contato com as células imunes (Figura 3C).
Após a confirmação do processo de adesão aos BMDCs, o PNPE foi utilizado para entregar antígeno aos BMDCs. Para visualizar diretamente os perfis de internalização de antígenos in vitro, o OVA marcado com Cy5 foi misturado com PMPs, ESE e PNPE para tratar com BMDCs, respectivamente. Após 6 h de pós-tratamento, o CLSM foi realizado para analisar a captação celular de OVA marcado com Cy5 em BMDCs. Como mostrado na Figura 4A, o sinal de fluorescência Cy5-OVA indicou que a quantidade total de antígeno internalizado nas células é significativamente maior no grupo tratado com PNPE em comparação com o grupo PMPs e tratado com SSE. A análise quantitativa da captação celular foi ainda realizada, mostrando uma intensidade relativa de fluorescência significativamente maior em BMDCs tratados com PNPE do que naqueles tratados com PMPs e SSE (p < 0,001), o que corroborou a observação acima (Figura 4B). Os resultados obtidos demonstraram que o PNPE promoveu a internalização do antígeno e efetivamente entregou o antígeno intracelularmente. Consequentemente, a eficiência de captação de antígenos foi positivamente associada à afinidade do sistema de entrega com as células-alvo, e o PNPE efetivamente aumentou a captação celular do antígeno através do contato multinível com a membrana celular.
Figura 1: Caracterização da emulsão de Pickering estabilizada por nanopartículas de PLGA. (A) Esquema do procedimento experimental utilizado para a preparação de nanopartículas de PLGA (PNPs). (B) Imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de PNPs. Barra de escala = 200 nm. (C) Distribuição de tamanho dos PNPs. (D) Esquema do procedimento experimental utilizado para a preparação da emulsão de Pickering estabilizada com nanopartículas (PNPE). (E) Micrografias ópticas do PNPE. Barra de escala = 20 μm. (F) Distribuição de tamanho da PNPE. (G) Microequilíbrio de cristal de quartzo com monitoramento de dissipação (QCM-D) análise sobre a suavidade de PNPE, micropartículas PLGA (PMPs) e emulsão estabilizada por surfactante (SSE) através de detecção de dissipação (ΔD). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização das vesículas extracelulares biomiméticas. (A) Esquema do procedimento experimental utilizado para o preparo de vesículas extracelulares biomiméticas (bEVs). (B) Imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET) de bEVs. Barra de escala = 200 nm. (C) Distribuição de tamanho dos bEVs medidos usando a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Afinidade do PNPE com os bEVs analisados por meio do QCM-D . (A) Esquema da modificação da superfície do PLL através do revestimento do PNPE. (B) Alterações na frequência (ΔF) do PNPE após o encontro com diferentes concentrações de bEVs. (C) Comparação de mudanças no ΔF em micropartículas de PLGA (PMPs), emulsão estabilizada por surfactante (SSE) e PNPE. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Absorção de antígenos. (A) Diagrama representativo da absorção celular de antígenos. Barra de escala = 20 μm. (B) Fluorescência de intensidade relativa da captação celular de antígenos. O gráfico exibe a média ± MEV de três experimentos independentes. A ANOVA one-way foi utilizada para analisar a significância das diferenças observadas. p < 0,001. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: A otimização da fase contínua. (A) Micrografias ópticas de PNPE construídas por diferentes fases contínuas. Barra de escala = 20 μm. (B) Os tamanhos das emulsões foram detectados após a preparação. Os resultados foram expressos em média ± MEV (n = 3). Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 Suplementar: A estabilidade do PNPE. Tamanho (A) e potencial zeta (B) do PNPE após 0, 3 e 6 dias de armazenamento nas temperaturas indicadas. Os dados foram demonstrados como média ± MEV (n = 3). Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Complementar 1: Caracterizações das formulações. PNPs, PNPE e ESS foram elaborados de acordo com o protocolo indicado. As distribuições de tamanho e o potencial zeta foram determinados por analisador dinâmico de dispersão de luz (DLS) ou analisador de tamanho de partícula Mastersizer. A eficiência de carga foi avaliada por meio do ensaio de BCA. Os dados foram demonstrados como média ± MEV (n = 3). Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Desenvolvemos a emulsão óleo/água estabilizada por nanopartículas PLGA como um sistema de entrega para a internalização aprimorada de antígenos. O PNPE preparado possuía uma superfície densamente embalada para suportar o ponto de pouso e suavidade e fluidez únicas para um potente contato celular com a membrana celular imune. Além disso, a interface óleo/água oferecia carga de antígenos de alto teor e o PLGA anfifílico conferia ao PNPE alta estabilidade para o transporte de antígenos para as células imunes. O PNPE poderia aderir rapidamente à superfície das células, indicando que a emulsão estabilizada por nanopartículas PLGA tem uma forte afinidade com a membrana celular para absorção celular. Além disso, o PNPE teve um alto perfil de segurança porque tanto o esqualeno quanto o PLGA são ingredientes aprovados pela Food and Drug Administration (FDA)30, o que deve alavancar a transferência segura para a clínica.
O peso molecular do PLGA e o tipo de fases contínuas e dispersas afetaram as propriedades do PNPE, incluindo estabilidade e hidrofobicidade. Neste trabalho, nanopartículas PLGA de peso molecular de 17 kDa foram selecionadas como estabilizador e esqualeno como fase de dispersão, resultando em maior estabilidade. Além disso, a água deionizada como fase contínua simplificou a composição da formulação. Sob essa condição, o PNPE permitiu a montagem eficiente de antígenos e promoveu a entrega de antígenos às células imunes. Além disso, o método de sonicação de uma etapa foi usado para preparar o PNPE, o que eliminou o processo tedioso e evitou a possibilidade de contaminação. É essencial notar que o sistema de entrega composto por PNPs e esqualeno precisa ser uma força uniforme, caso contrário, nenhuma emulsão é formada ou o PNPE preparado não é uniforme em tamanho.
Embora o estudo da afinidade do sistema de entrega às células tenha sido um desafio extraordinário realizado in vivo, estudos in vitro poderiam ajudar a elucidar o processo envolvido na adesão e internalização celular. Recentemente, esse problema tem recebido muita atenção no campo biomédico. Esforços substanciais têm sido feitos para lançar luz sobre a afinidade das partículas com as células usando citometria de fluxo e análise CLSM31,32. Embora esses métodos forneçam uma leitura média no nível celular, os processos de ligação dinâmica específicos entre células e sistemas de entrega não são facilmente monitorados. Em contraste, o QCM depende principalmente de um cristal piezoelétrico sensível que o ΔF muda com a massa. A capacidade de detectar mudanças de massa minúsculas permite que o QCM-D monitore as interações moleculares visadas. A técnica pode ser utilizada para monitorar eventos em tempo real, permitindo o estudo da afinidade da PNPE com BMDCs em diferentes condições33.
A adesão à PNPE foi investigada utilizando-se bEVs em vez de células intactas. Como as APCs simples bem controladas, acredita-se que os bEVs herdem a maioria das características das células-mãe. Em geral, vesículas extracelulares com tamanhos de partículas pequenos e homogêneos têm melhor desempenho nos ensaios de adesão. Assim, os bEVs foram preparados por extrusão através de filtros de policarbonato com poros de 10, 5 e 1 μm34. O diâmetro e o rendimento dos bEVs podem ser controlados regulando o número de extrusões e o tamanho dos poros das membranas de policarbonato. Recomenda-se fazer 30 passagens através das membranas de policarbonato. No entanto, esse método também apresentou uma limitação em que parte da membrana pode ser inversa, fazendo com que as proteínas na superfície DC sejam encapsuladas nos bEVs, o que diminuiu ligeiramente a afinidade às emulsões.
Demonstrou-se que a modificação das superfícies do sensor SiO2 utilizando proteínas carregadas positivamente foi adequada para o subsequente revestimento PNPE. A implementação descrita do PLL (polipeptídeo de policação) como camada intermediária entre as superfícies do sensor SiO2 e o PNPE mostrou-se uma melhoria para o método de revestimento rápido. Alterações na massa causadas por qualquer evento, por exemplo, adsorções inespecíficas de qualquer componente a partir do fluxo de solução no sensor SiO2 , podem afetar a precisão dos resultados experimentais35. Portanto, era necessário garantir que o PLL mantivesse uma qualidade consistente no chip após o revestimento por spin e que sua superfície fosse completamente coberta pelo PNPE para evitar o erro de medição causado por adsorção inespecífica. Ao mesmo tempo, quando ΔF não se alterou mais durante o contato com a fase móvel contendo PNPE, a superfície do chip foi considerada completamente coberta. Isso garantiu que os sinais detectados fossem gerados pela adesão dos bEVs ao PNPE. Demonstramos que o QCM-D foi um bom método para mostrar a adesão dos bEVs ao PNPE em tempo real, refletindo a alta afinidade do PNPE aos APCs. Infelizmente, esse método não pôde refletir a interação entre células individuais e o sistema de entrega. Portanto, uma determinação mais precisa exigirá um projeto adicional do protocolo e otimização do procedimento de medição.
Após o ensaio da alta afinidade do PNPE com os bEVs, verificou-se ainda mais a internalização aprimorada. Demonstramos que a potente captação celular de antígenos correlacionou-se com a alta afinidade da PNPE. O PNPE possuía a estrutura multinível para o carregamento efetivo de antígenos e flexibilidade para o contato multinível com a membrana celular para melhorar a entrega. Portanto, a emulsão de Pickering racionalmente projetada estimulou a internalização celular e as vias intracelulares através da interação robusta com a membrana celular. Tendo demonstrado essas vantagens, o PNPE pode lançar luz sobre o desenvolvimento de sistemas de entrega de antígenos novos, seguros e eficientes para melhorar as vacinas.
Este protocolo demonstrou com sucesso a alta afinidade do PNPE com a bicamada fosfolipídica de células imunes e subsequente entrega intracelular do antígeno às células imunes in vitro. Portanto, vários tipos de antígenos de diferentes patógenos podem ser entregues e caracterizados usando o protocolo proposto para conferir proteção contra doenças infecciosas.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Projeto apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento de Chaves da China (2021YFE020527, 2021YFC2302605, 2021YFC2300142), De 0 a 1 Projeto de Inovação Original do Programa de Pesquisa Científica de Fronteira Básica da Academia Chinesa de Ciências (ZDBS-LY-SLH040), da Fundação para Grupos de Pesquisa Inovadores da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No. 21821005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AddVax | InvivoGen | Vac-adx-10 | |
| Cell Strainer | Biosharp | BS-70-CS | 70 μm |
| Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM) | Nikon | A1 | |
| Cy3 NHS Ester | YEASEN | 40777ES03 | |
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| FITC Phalloidin | Solarbio | CA1620 | |
| Mastersizer 2000 Particle Size Analyzer | Malvern | ||
| Micro BCA protein Assay Kit | Thermo Science | 23235 | |
| Membrane emulsification equipment | Zhongke Senhui Microsphere Technology | FM0201/500M | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| NANO ZS | Malvern | JSM-6700F | |
| Polycarbonate membranes | Avanti Polar Lipids, Inc | ||
| Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) | Sigma-Aldrich | 26780-50-7 | Mw 7,000-17,000 |
| Poly-L-lysine Solution | Solarbio | P2100 | |
| Poly (vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Aldrich | 9002-89-5 | |
| QSense Silicon dioxide sensor | Biolin Scientific | QSX 303 | Surface roughness < 1 nm RMS |
| Quartz Crystal Microbalance | Biosharp | Q-SENSE E4 | |
| RPMI Medium 1640 basic | Gibco | C22400500BT | L-Glutamine, 25 mM HEPES |
| Scanning Electron Microscopy (SEM) | JEOL | JSM-6700F | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | 111-02-4 |
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