Bakteriofagens evne til at flytte DNA mellem bakterieceller gør dem til effektive værktøjer til genetisk manipulation af deres bakterielle værter. Præsenteret her er en metode til at inducere, genoprette og bruge φBB-1, en bakteriofag af Borrelia burgdorferi, til at transducere heterologt DNA mellem forskellige stammer af Lyme-sygdommen spirochete.
Introduktion af fremmed DNA i spirochete Borrelia burgdorferi er næsten udelukkende opnået ved transformation ved hjælp af elektroporation. Denne proces har især lavere effektivitet i borreliose spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserede gramnegative bakterier. Transformationshastigheden er meget afhængig af at have koncentrerede mængder DNA af høj kvalitet fra specifikke baggrunde og er underlagt betydelig belastning-til-stamme-variabilitet. Alternative midler til at indføre fremmed DNA (dvs. shuttlevektorer, fluorescerende journalister og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kunne være en vigtig tilføjelse til armamentarium af nyttige værktøjer til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Bakteriofag er blevet anerkendt som naturlige mekanismer til bevægelse af DNA blandt bakterier i en proces kaldet transduktion. I denne undersøgelse er der udviklet en metode til at bruge den allestedsnærværende borreliale φBB-1 til at transducere DNA mellem B. burgdorferi-celler med både samme og forskellige genetiske baggrunde. Det transducerede DNA omfatter både borrelialt DNA og heterologt DNA i form af små shuttlevektorer. Denne demonstration antyder en potentiel anvendelse af fagmedieret transduktion som et supplement til elektroporation til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Denne rapport beskriver metoder til induktion og oprensning af φBB-1 fra B. burgdorferi, brugen af denne i transduktionsassays og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.
Udviklingen af værktøjer til genetisk manipulation af spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilføjet umådelig værdi til forståelsen af borreliosens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et usædvanligt komplekst genom bestående af et lille lineært kromosom og både lineære og cirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtab, intragen omlejring (bevægelse af gener fra et plasmid til et andet inden for samme organisme) og horisontal genoverførsel (HGT, bevægelse af DNA mellem to organismer) har givet anledning til en svimlende mængde genetisk heterogenitet blandt B. burgdorferi (for et eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotyper (eller “stammer”) er alle medlemmer af samme art, men har genetiske forskelle, der påvirker deres evne til at overføre til og inficere forskellige pattedyrværter 8,9,10,11. I denne rapport vil udtrykket “stamme” blive brugt til at henvise til B. burgdorferi med en særlig naturligt afledt genetisk baggrund; Udtrykket “klon” vil blive brugt til at henvise til en stamme, der er blevet genetisk modificeret til et bestemt formål eller som følge af eksperimentel manipulation.
Den molekylære værktøjskasse, der er tilgængelig til brug i B. burgdorferi, inkluderer valgbare markører, genreportere, shuttlevektorer, transponmutagenese, inducerbare promotorer og modvalgbare markører (for en gennemgang, se Drektrah og Samuels12). Den effektive anvendelse af disse metoder kræver kunstig introduktion af heterologt (fremmed) DNA i en B. burgdorferi-stamme af interesse. I B. burgdorferi opnås indførelsen af heterologt DNA næsten udelukkende via elektroporation, en metode, der udnytter en puls af elektricitet til at gøre en bakteriemembran forbigående gennemtrængelig for små stykker DNA, der indføres i mediet1. Størstedelen af cellerne (anslået til at være ≥99,5%) dræbes af pulsen, men de resterende celler har en høj frekvens for at bevare det heterologe DNA13. Selvom det anses for at være blandt de mest effektive metoder til at indføre DNA i bakterier, er frekvensen af elektroporation i B. burgdorferi meget lav (fra 1 transformerende i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Hindringerne for at opnå højere transformationsfrekvenser synes at være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for en vellykket elektroporation af B. burgdorferi omfatter både mængden af DNA (>10 μg), der er nødvendig, og spirocheternes krav om at være i nøjagtig den korrekte vækstfase (midt i loggen, mellem 2 × 10 7 celler · ml – 1 og 7 × 107 celler · ml – 1) ved fremstilling af elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierer kan dog være lettere at overvinde end de biologiske barrierer.
Lyme sygdomsforskere erkender, at B. burgdorferi kloner kan opdeles i to brede kategorier med hensyn til deres evne til at blive manipuleret genetisk13,14. Laboratorietilpassede isolater med høj passage transformeres ofte let, men har normalt mistet de plasmider, der er afgørende for infektivitet, opfører sig på en fysiologisk afvigende måde og er ikke i stand til at inficere en pattedyrvært eller fortsætte inden for en flåtvektor12,13. Mens disse kloner har været nyttige til at dissekere spirochetens molekylærbiologi i laboratoriet, er de af ringe værdi for at studere spirocheten inden for den biologiske kontekst af den enzootiske cyklus. Lavpassage infektiøse isolater opfører sig derimod på en fysiologisk måde, der afspejler en infektiøs tilstand og kan fuldføre den infektiøse cyklus, men er normalt genstridige over for indførelsen af heterologt DNA og er derfor vanskelige at manipulere til undersøgelse12,13. Vanskeligheden ved at omdanne isolater med lav passage er relateret til mindst to forskellige faktorer: (i) isolater med lav passage klumper sig ofte tæt sammen, især under de høje densitetsforhold, der kræves til elektroporation, og blokerer således mange celler fra enten fuld anvendelse af den elektriske ladning eller adgang til DNA’et i mediet13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for mindst to forskellige plasmidbårne begrænsningsmodifikationssystemer (R-M), der kan gå tabt i højpassageisolater14,16. R-M-systemer har udviklet sig til at tillade bakterier at genkende og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere undersøgelser i B. burgdorferi vist, at transformationseffektiviteten øges, når kilden til DNA’et er B. burgdorferi snarere end Escherichia coli13,16. Desværre er erhvervelse af den nødvendige høje koncentration af DNA til elektroporation fra B. burgdorferi et dyrt og tidskrævende perspektiv. En anden potentiel bekymring ved elektropotering og valg af isolater med lav passage er, at processen ser ud til at favorisere transformanter, der har mistet det kritiske virulensassocierede plasmid, lp2514,18,19; således kan selve handlingen med genetisk manipulation af lavpassage B. burgdorferi-isolater via elektroporation vælge for kloner, der ikke er egnede til biologisk relevant analyse inden for den enzootiske cyklus20. I betragtning af disse problemer kunne et system, hvor heterologt DNA kunne elektrotransformeres til højpassage B. burgdorferi kloner og derefter overføres til lavpassage infektiøse isolater ved en anden metode end elektroporation være en velkommen tilføjelse til den voksende samling af molekylære værktøjer, der er tilgængelige til brug i borrelia spirochete.
Ud over transformation (optagelse af nøgent DNA) er der to andre mekanismer, hvormed bakterier regelmæssigt optager heterologt DNA: konjugation, som er udveksling af DNA mellem bakterier i direkte fysisk kontakt med hinanden og transduktion, som er udveksling af DNA medieret af en bakteriofag21. Faktisk er bakteriofagens evne til at mægle HGT blevet brugt som et eksperimentelt værktøj til dissekering af de molekylære processer inden for en række bakteriesystemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturligt kompetent til optagelse af nøgent DNA, og der er få beviser for, at B. burgdorferi koder for det apparat, der er nødvendigt for at fremme en vellykket bøjning. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifikationen og den foreløbige karakterisering af φBB-1, en tempereret bakteriofag af B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider fundet i B. burgdorferi25; Medlemmerne af denne familie er blevet udpeget CP32s. I overensstemmelse med en rolle for φBB-1 ved deltagelse i HGT blandt B. burgdorferi-stammer rapporterede Stevenson et al. en identisk cp32 fundet i to stammer med ellers forskellige cp32’er, hvilket tyder på en nylig deling af denne cp32 mellem disse to stammer, sandsynligvis via transduktion29. Der er også tegn på signifikant rekombination via HGT blandt cp32’erne i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig er φBB-1’s evne til at transducere både cp32’er og heterologt shuttlevektor-DNA mellem celler af samme stamme og mellem celler med to forskellige stammer tidligere blevet påvist27,28. I betragtning af disse resultater er φBB-1 blevet foreslået som et andet værktøj, der skal udvikles til dissektion af molekylærbiologien af B. burgdorferi.
Målet med denne rapport er at detaljere en metode til inducering og rensning af φBB-1 fra B. burgdorferi samt give en protokol til udførelse af et transduktionsassay mellem B. burgdorferi-kloner og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.
Anvendelsen af transduktion kunne repræsentere en metode til at overvinde i det mindste nogle af de biologiske og tekniske barrierer forbundet med elektrotransformationen af B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte værts-DNA (ikke-prophage) mellem bakterieceller ved enten generaliseret eller specialiseret transduktion 22,23,24,49,50.<s…
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren ønsker at takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskussion og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Institut for Biomedicinsk Videnskab og fakultetets forskningsbevillinger til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |