Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Fagmedieret genmanipulation af borreliose Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

Bakteriofagens evne til at flytte DNA mellem bakterieceller gør dem til effektive værktøjer til genetisk manipulation af deres bakterielle værter. Præsenteret her er en metode til at inducere, genoprette og bruge φBB-1, en bakteriofag af Borrelia burgdorferi, til at transducere heterologt DNA mellem forskellige stammer af Lyme-sygdommen spirochete.

Abstract

Introduktion af fremmed DNA i spirochete Borrelia burgdorferi er næsten udelukkende opnået ved transformation ved hjælp af elektroporation. Denne proces har især lavere effektivitet i borreliose spirochete i forhold til andre, bedre karakteriserede gramnegative bakterier. Transformationshastigheden er meget afhængig af at have koncentrerede mængder DNA af høj kvalitet fra specifikke baggrunde og er underlagt betydelig belastning-til-stamme-variabilitet. Alternative midler til at indføre fremmed DNA (dvs. shuttlevektorer, fluorescerende journalister og antibiotikaresistensmarkører) i B. burgdorferi kunne være en vigtig tilføjelse til armamentarium af nyttige værktøjer til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Bakteriofag er blevet anerkendt som naturlige mekanismer til bevægelse af DNA blandt bakterier i en proces kaldet transduktion. I denne undersøgelse er der udviklet en metode til at bruge den allestedsnærværende borreliale φBB-1 til at transducere DNA mellem B. burgdorferi-celler med både samme og forskellige genetiske baggrunde. Det transducerede DNA omfatter både borrelialt DNA og heterologt DNA i form af små shuttlevektorer. Denne demonstration antyder en potentiel anvendelse af fagmedieret transduktion som et supplement til elektroporation til genetisk manipulation af borreliose spirochete. Denne rapport beskriver metoder til induktion og oprensning af φBB-1 fra B. burgdorferi, brugen af denne i transduktionsassays og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

Introduction

Udviklingen af værktøjer til genetisk manipulation af spirochetalbakterien Borrelia burgdorferi har tilføjet umådelig værdi til forståelsen af borreliosens natur 1,2,3,4. B. burgdorferi har et usædvanligt komplekst genom bestående af et lille lineært kromosom og både lineære og cirkulære plasmider 5,6. Spontant plasmidtab, intragen omlejring (bevægelse af gener fra et plasmid til et andet inden for samme organisme) og horisontal genoverførsel (HGT, bevægelse af DNA mellem to organismer) har givet anledning til en svimlende mængde genetisk heterogenitet blandt B. burgdorferi (for et eksempel, se Schutzer et al.7). De resulterende genotyper (eller "stammer") er alle medlemmer af samme art, men har genetiske forskelle, der påvirker deres evne til at overføre til og inficere forskellige pattedyrværter 8,9,10,11. I denne rapport vil udtrykket "stamme" blive brugt til at henvise til B. burgdorferi med en særlig naturligt afledt genetisk baggrund; Udtrykket "klon" vil blive brugt til at henvise til en stamme, der er blevet genetisk modificeret til et bestemt formål eller som følge af eksperimentel manipulation.

Den molekylære værktøjskasse, der er tilgængelig til brug i B. burgdorferi, inkluderer valgbare markører, genreportere, shuttlevektorer, transponmutagenese, inducerbare promotorer og modvalgbare markører (for en gennemgang, se Drektrah og Samuels12). Den effektive anvendelse af disse metoder kræver kunstig introduktion af heterologt (fremmed) DNA i en B. burgdorferi-stamme af interesse. I B. burgdorferi opnås indførelsen af heterologt DNA næsten udelukkende via elektroporation, en metode, der udnytter en puls af elektricitet til at gøre en bakteriemembran forbigående gennemtrængelig for små stykker DNA, der indføres i mediet1. Størstedelen af cellerne (anslået til at være ≥99,5%) dræbes af pulsen, men de resterende celler har en høj frekvens for at bevare det heterologe DNA13. Selvom det anses for at være blandt de mest effektive metoder til at indføre DNA i bakterier, er frekvensen af elektroporation i B. burgdorferi meget lav (fra 1 transformerende i 5 × 104 til 5 × 106 celler)13. Hindringerne for at opnå højere transformationsfrekvenser synes at være både tekniske og biologiske. Tekniske barrierer for en vellykket elektroporation af B. burgdorferi omfatter både mængden af DNA (>10 μg), der er nødvendig, og spirocheternes krav om at være i nøjagtig den korrekte vækstfase (midt i loggen, mellem 2 × 10 7 celler · ml - 1 og 7 × 107 celler · ml - 1) ved fremstilling af elektrokompetente celler12,13. Disse tekniske barrierer kan dog være lettere at overvinde end de biologiske barrierer.

Lyme sygdomsforskere erkender, at B. burgdorferi kloner kan opdeles i to brede kategorier med hensyn til deres evne til at blive manipuleret genetisk13,14. Laboratorietilpassede isolater med høj passage transformeres ofte let, men har normalt mistet de plasmider, der er afgørende for infektivitet, opfører sig på en fysiologisk afvigende måde og er ikke i stand til at inficere en pattedyrvært eller fortsætte inden for en flåtvektor12,13. Mens disse kloner har været nyttige til at dissekere spirochetens molekylærbiologi i laboratoriet, er de af ringe værdi for at studere spirocheten inden for den biologiske kontekst af den enzootiske cyklus. Lavpassage infektiøse isolater opfører sig derimod på en fysiologisk måde, der afspejler en infektiøs tilstand og kan fuldføre den infektiøse cyklus, men er normalt genstridige over for indførelsen af heterologt DNA og er derfor vanskelige at manipulere til undersøgelse12,13. Vanskeligheden ved at omdanne isolater med lav passage er relateret til mindst to forskellige faktorer: (i) isolater med lav passage klumper sig ofte tæt sammen, især under de høje densitetsforhold, der kræves til elektroporation, og blokerer således mange celler fra enten fuld anvendelse af den elektriske ladning eller adgang til DNA'et i mediet13,15; og (ii) B. burgdorferi koder for mindst to forskellige plasmidbårne begrænsningsmodifikationssystemer (R-M), der kan gå tabt i højpassageisolater14,16. R-M-systemer har udviklet sig til at tillade bakterier at genkende og eliminere fremmed DNA17. Faktisk har flere undersøgelser i B. burgdorferi vist, at transformationseffektiviteten øges, når kilden til DNA'et er B. burgdorferi snarere end Escherichia coli13,16. Desværre er erhvervelse af den nødvendige høje koncentration af DNA til elektroporation fra B. burgdorferi et dyrt og tidskrævende perspektiv. En anden potentiel bekymring ved elektropotering og valg af isolater med lav passage er, at processen ser ud til at favorisere transformanter, der har mistet det kritiske virulensassocierede plasmid, lp2514,18,19; således kan selve handlingen med genetisk manipulation af lavpassage B. burgdorferi-isolater via elektroporation vælge for kloner, der ikke er egnede til biologisk relevant analyse inden for den enzootiske cyklus20. I betragtning af disse problemer kunne et system, hvor heterologt DNA kunne elektrotransformeres til højpassage B. burgdorferi kloner og derefter overføres til lavpassage infektiøse isolater ved en anden metode end elektroporation være en velkommen tilføjelse til den voksende samling af molekylære værktøjer, der er tilgængelige til brug i borrelia spirochete.

Ud over transformation (optagelse af nøgent DNA) er der to andre mekanismer, hvormed bakterier regelmæssigt optager heterologt DNA: konjugation, som er udveksling af DNA mellem bakterier i direkte fysisk kontakt med hinanden og transduktion, som er udveksling af DNA medieret af en bakteriofag21. Faktisk er bakteriofagens evne til at mægle HGT blevet brugt som et eksperimentelt værktøj til dissekering af de molekylære processer inden for en række bakteriesystemer22,23,24. B. burgdorferi er ikke naturligt kompetent til optagelse af nøgent DNA, og der er få beviser for, at B. burgdorferi koder for det apparat, der er nødvendigt for at fremme en vellykket bøjning. Tidligere rapporter har imidlertid beskrevet identifikationen og den foreløbige karakterisering af φBB-1, en tempereret bakteriofag af B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 pakker en familie på 30 kb plasmider fundet i B. burgdorferi25; Medlemmerne af denne familie er blevet udpeget CP32s. I overensstemmelse med en rolle for φBB-1 ved deltagelse i HGT blandt B. burgdorferi-stammer rapporterede Stevenson et al. en identisk cp32 fundet i to stammer med ellers forskellige cp32'er, hvilket tyder på en nylig deling af denne cp32 mellem disse to stammer, sandsynligvis via transduktion29. Der er også tegn på signifikant rekombination via HGT blandt cp32'erne i et ellers relativt stabilt genom30,31,32,33. Endelig er φBB-1's evne til at transducere både cp32'er og heterologt shuttlevektor-DNA mellem celler af samme stamme og mellem celler med to forskellige stammer tidligere blevet påvist27,28. I betragtning af disse resultater er φBB-1 blevet foreslået som et andet værktøj, der skal udvikles til dissektion af molekylærbiologien af B. burgdorferi.

Målet med denne rapport er at detaljere en metode til inducering og rensning af φBB-1 fra B. burgdorferi samt give en protokol til udførelse af et transduktionsassay mellem B. burgdorferi-kloner og udvælgelse og screening af potentielle transduktanter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ved hjælp af rekombinant DNA og BSL-2 organismer blev gennemgået og godkendt af Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee.

1. Forberedelse af B. burgdorferi-kultur til produktion af φBB-1

  1. Forbered Barbour-Stoenner-Kelly medium suppleret med 6,6% varmeinaktiveret normalt kaninserum (BSK)15. For 1 liter 1x BSK kombineres komponenterne i tabel 1 i 900 ml vand, pH justeres til 7,6 med 1 N natriumhydroxid, og blandes langsomt ved 4 °C i 2-4 timer. Når blandingen er afsluttet, skal du kontrollere og justere pH til 7,6 om nødvendigt og øge volumenet til 1 liter med vand. Steriliser mediet ved at passere gennem et 0,22 μM filter (se Materialetabel) og brug frisk eller opbevares ved 4 °C i ≤2 måneder.
  2. Tre til fem dage før transduktionsprotokollen påbegyndes, podes 150 μL af den eller de relevante B. burgdorferi-kloner i 15 ml 1x BSK i sterile koniske centrifugerør med tæt låg (se Materialetabel). Mediet suppleres med en passende koncentration af antibiotika eller en kombination af antibiotika til udvælgelse og vedligeholdelse af heterologt DNA i B. burgdorferi-klonen (-klonen) (tabel 2).
    BEMÆRK: B. burgdorferi er en organisme på biosikkerhedsniveau 2. Tag alle passende forholdsregler, mens du arbejder med denne organisme. Udfør alt arbejde med levende kulturer af B. burgdorferi i et certificeret og korrekt desinficeret klasse II biosikkerhedsskab. Bortskaf alt materiale, der kontakter B. burgdorferi og organismerne selv baseret på CDC-retningslinjer34.
  3. Inkubere kulturerne ved 33 °C uden at ryste, indtil kulturerne når en tæthed på ≥5 × 107 spirochetes·mL-1, hvilket tager ca. 3-5 dage.

2. Bestem tætheden af B. burgdorferi-kulturen (-erne) (modificeret fra Samuels)15

  1. For tætheder, der forventes at være over 5 × 106 celler · ml-1, bestemmes celletætheden ved hjælp af spektroskopi.
    1. Der overføres 1 ml kultur til et 1,7 ml mikrocentrifugerør og centrifuge ved 8.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Supernatanten kasseres, og cellepelleten gensuspenderes i 1 ml fosfatbufferet saltvand (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 og 1,8 mM KH2PO4). Overfør hele cellesuspensionen til en halvmikro UV gennemsigtig kuvette.
    3. Den optiske tæthed af den resuspenderede prøve bestemmes ved en bølgelængde på 600 nm (A600). Nul spektrofotometeret (se Materialetabel) mod PBS.
    4. For at beregne koncentrationen af spirochetes·mL−1 i den oprindelige kultur multipliceres den optiske tæthed ved A600 med 1,4 × 109.
  2. For tætheder, der forventes at være mellem 5 × 104 celler · ml - 1 og 5 × 106 celler · ml - 1, bestemmes celletætheden ved hjælp af et Petroff-Hausser tællekammer (se Materialetabel) for direkte at tælle antallet af spirocheter. Denne metode kan også anvendes til højere tætheder efter passende fortynding.
    BEMÆRK: Visualiseringen af levende spirocheter kræver et mikroskop modificeret med en darkfield kondensator.
    1. Der påføres 10 μL prøve på tællekammeret, og der dækkes med passende dækglas. For densiteter, der er højere end 1 × 107, fortyndes prøven i PBS for at give 50-100 spirocheter pr. Mark.
    2. Tæl cellerne ved hjælp af et darkfield-mikroskop ved en forstørrelse på 200x-400x. Tæl hele feltet på 25 grupper af 16 små firkanter i alle fly.
    3. Multiplicer det tal, der tælles med fortyndingsfaktoren (hvis nogen) og 5 × 104 for at give celler · ml - 1 af oprindelig kultur.

3. Induktion af B. burgdorferi φBB-1

BEMÆRK: Steriliser alle glasvarer og plastvarer ved autoklavering; steriliser alle opløsningerne ved autoklavering eller filtrering gennem et 0,22 μM filter. Trinene nedenfor præsenteres baseret på volumener på 15 ml, men metoden er skalerbar til mindre eller større volumener afhængigt af eksperimentets individuelle behov.

  1. For B. burgdorferi-kulturen , hvorfra vil blive produceret (donoren), anvendes koncentrationen beregnet ved begge metoder i trin 2 til at bestemme det volumen af starterkultur, der er nødvendigt for at give 4 ml 2 × 108 spirochetes·mL−1. Dette vil give en endelig koncentration på 5 × 107 spirocheter·ml−1 ud af 15 ml i genopretningsfasen (trin 3.6 nedenfor).
  2. Kulturvolumenet beregnet i trin 3.1 centrifugeres ved 6.000 x g i 10 min. Dekantér supernatanten, og resuspender pelleten i 4 ml frisk BSK. Prøven overføres til det mindste sterile rør, der er til rådighed, for at holde prøven med minimal hovedplads.
  3. Tilsæt den passende mængde inducerende middel til den anbefalede koncentration (tabel 3) baseret på et dyrkningsvolumen på 4 ml for at inducere fagproduktion. Dæk røret tæt og bland grundigt.
  4. Prøven inkuberes ved 33 °C i 2-4 timer.
  5. Efter inkubation overføres prøven til et 15 ml centrifugerør. Prøven centrifugeres ved 6.000 x g i 10 min. Dekanter supernatanten.
  6. Resuspender cellepelleten i 15 ml 1x BSK.
    BEMÆRK: Efter induktion af fagen er der to forskellige måder at fortsætte med transduktionsanalysen på. Disse metoder er vist i figur 1 og i trin 4 og trin 6.

4. Transduktion under samdyrkning efter donorens eksponering for induceringsmidlet (figur 1A)

BEMÆRK: Denne protokol kan kun bruges, når den fagproducerende stamme (donor) har resistens over for et bestemt antibiotikum, og stammen, der skal transduceres (modtager), har resistens over for et andet antibiotikum.

  1. Forbered en B. burgdorferi-kultur , der skal bruges som modtager i transduktionsassays, som beskrevet for donorstammen i trin 1 ovenfor. Baseret på densiteten bestemt som i trin 2 beregnes det volumen, der er nødvendigt for at give 15 ml 1 × 107 spirochetes·mL−1.
  2. Kulturvolumenet beregnet i trin 4.1 centrifugeres ved 6.000 x g i 10 min. Dekanter supernatanten.
  3. Resuspender pelleten i 1 ml kultur fra trin 3.6 (resuspenderet fagdonor). Tilføj den suspenderede modtager tilbage i kulturen med donoren. Suppler ikke med antibiotika. Det samlede volumen indeholdende begge kulturer er 15 ml.
  4. Inkuberes ved 33 °C i 72-96 timer.
  5. Udfør udvælgelse af transduktanter ved fastfasebelægning efter samkultur som beskrevet i trin 7.

5. Polyethylenglycol (PEG) udfældning til genvinding af til brug i transduktionsassay

BEMÆRK: Denne protokol kan anvendes i tilfælde, hvor den fagproducerende stamme (donor) har resistens over for et bestemt antibiotikum, og den stamme, der skal transduceres (modtager), enten ikke har nogen antibiotikaresistens eller resistens over for et andet antibiotikum.

  1. Kulturen fra trin 3.6 suppleres med det relevante antibiotikum i den koncentration, der er angivet i tabel 2. Prøven inkuberes ved 33 °C i 72-96 timer.
  2. Forbered opløsninger til PEG-nedbør.
    1. Forbered 500 ml 5 M NaCl. Steriliser ved autoklavering og lad afkøle inden brug. Opbevares ved stuetemperatur.
    2. Forbered 500 ml 40% PEG ved at opløse 200 g PEG8000 i 400 ml vand; Varm forsigtigt under omrøring, indtil opløsningen er godt blandet. Bring volumenet op til 500 ml med vand. For fuldstændigt at opløse PEG8000 og sterilisere opløsningen, autoklave opløsningen og afkøle inden brug. Opbevares ved stuetemperatur.
    3. Der fremstilles 100 ml suspensionsmedium (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 og 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Steriliser ved autoklavering. Opbevares ved 4 °C.
  3. Til PEG-udfældning af fra donoren B. burgdorferi-klonen (fra trin 3.6) centrifugeres prøverne efter 72-96 timers inkubation ved 8.000 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  4. Dekanter supernatanten i et rent 50 ml konisk rør; bortskaf cellepellet. Tilsæt 5 M NaCl til en endelig koncentration på 1 M. Bland godt. Rock forsigtigt ved stuetemperatur i 1 time.
  5. Prøverne centrifugeres ved 8 000 x g i 10 minutter ved 4 °C. Dekanter supernatanten i et rent 50 ml konisk rør; Pelleten kan være lille eller fraværende. Tilsæt 40% PEG8000-opløsning til supernatanten til en endelig koncentration på 10%. Bland godt og sæt på is i mere end 1 time op til natten.
    BEMÆRK: Længere tider synes ikke at korrelere med signifikant øget faggendannelse.
  6. Prøverne centrifugeres ved 8 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten og fjern så meget overskydende væske som muligt uden at miste pellet, som indeholder fagpartiklerne.
  7. Resuspender pelleten i et minimalt volumen SM ved hjælp af SM til at vaske ned på siden af flasken og samle eventuelle fagpartikler. Det anbefalede forhold er 400 μL SM pr. 10 ml original supernatant, men afhængigt af pellets størrelse kan mere eller mindre SM være påkrævet for fuldstændig resuspension.
  8. Den genvundne fagprøve behandles med et tilsvarende volumen chloroform baseret på resuspensionsvolumenet. Prøven blandes godt, og centrifugeres derefter ved 8.000 x g i 10 min. Fjern det vandige (øverste) lag til et rent rør, og undgå noget af det tykke grænsefladelag.
    BEMÆRK: φBB-1 er en ikke-indhyllet bakteriofag og er ikke modtagelig for chloroformbehandling25. Dette trin udføres for yderligere at forstyrre eventuelle membranbundne strukturer (dvs. celler eller blebs) og for at dræbe potentielle cellulære forurenende stoffer. Chloroform er et flygtigt organisk stof og må kun anvendes i en godt ventileret røghætte; kassere materiale indeholdende chloroform som organisk affald.
  9. Det genvundne volumen bestemmes efter den første chloroformbehandling, og prøven behandles igen med en mængde chloroform svarende til 10 % af dette volumen. Bland godt og centrifuge ved 8.000 x g i 10 min. Fjern det vandige (øverste) lag, og pas på at undgå noget af grænsefladen eller det organiske lag. Overfør det vandige lag til et rent rør.
  10. Brug fagen med det samme (som beskrevet i trin 6) eller opbevar den ved 4 °C.
    BEMÆRK: Frysning af φBB-1 fagprøver anbefales ikke. Selv om stabiliteten af φBB-1 ved 4 °C ikke er blevet grundigt undersøgt, er prøver, der opbevares ved 4 °C i op til 1 måned efter gendannelsen, blevet anvendt med succes i transduktionsassays.

6. Transduktionsassay efter PEG-udfældning af φBB-1 (figur 1B)

  1. Forbered B. burgdorferi-kulturer , der skal bruges som modtager i transduktionsassays, som beskrevet for donorstammen i trin 1 ovenfor. Baseret på densiteten bestemt som i trin 2 beregnes mængden af kultur af modtageren, der er nødvendig for at give 15 ml af 1 × 107 spirochetes · ml-1.
  2. Kulturvolumenet beregnet i trin 6.1 centrifugeres ved 6.000 x g i 10 min. Dekanter supernatanten og suspenderer pelleten i 14,5 ml frisk BSK.
  3. Der tilsættes ≤500 μL PEG-udfældet fagprøve (fra trin 5) til dyrkningen af modtagerklonen. Bland godt og inkuber ved 33 °C i 72-96 timer.
    BEMÆRK: Mængden af fag, der genvindes under PEG-nedbør, kan variere afhængigt af en række faktorer. Men fra 15 ml kultur af induceret B. burgdorferi stamme CA-11.2A indeholder 500 μL typisk 50-1.000 levedygtig28. Volumener af fagindvinding ≥500 μL påvirker B. burgdorferi-væksten negativt, sandsynligvis på grund af det øgede forhold mellem SM og BSK.
  4. Udfør udvælgelsen af transduktanter ved fastfasebelægning efter blanding med PEG-udfældet som beskrevet i trin 7.

7. Udvælgelse af transduktanter

BEMÆRK: Fastfasebelægning af potentielle transduktanter udføres ved hjælp af en enkeltlagsmodifikation af protokollen, der først blev beskrevet af Samuels15. B. burgdorferi-kolonier vokser inden for agaren, så til udvælgelse af transduktanter ved fastfasebelægning skal prøverne tilsættes til mediet, mens pladerne hældes. En alternativ metode til udvælgelse af transformanter ved hjælp af en fortyndingsmetode i 96-brøndsplader er også beskrevet tidligere35. Denne teknik kan også være effektiv til udvælgelse af transduktanter, men er endnu ikke blevet afprøvet til dette formål.

  1. Bestem antallet af plader, der er nødvendige for udvælgelsen af transduktanter, baseret på antallet af prøver fra transduktionsassays og kontroller, der skal beskrives.
    BEMÆRK: Typisk hældes to plader pr. Prøve, en svarende til ca. 10% af kulturvolumenet og en, der inkluderer resten af kulturen. Derudover hældes plader, der tjener som negative kontroller, for individuelt at teste, at fagpræparatet og / eller forældreklonerne, der anvendes som donor og modtager, ikke vokser i nærværelse af det eller de antibiotika, der anvendes under udvælgelsen. Forberedelse af belægningsmateriale til mindst to ekstra plader anbefales også. For eksempel, hvis antallet af prøver og kontroller, der skal belagtes, er otte, skal du forberede nok pletteringsblanding til 10 plader.
  2. Forbered løsninger til plettering som beskrevet nedenfor.
    BEMÆRK: Hver plade vil være 30 ml, bestående af 20 ml 1,5x BSK til plettering og 10 ml 2,1% agarose (2: 1-forhold). Dette vil give en plade med endelige koncentrationer på 1x BSK og 0,7% agarose. For eksempel til 10 plader fremstilles en samlet belægningsblanding på 300 ml, bestående af 200 ml 1,5x BSK og 100 ml 2,1% agarose.
    1. Forbered 1 L 1,5x BSK som beskrevet for 1x BSK i trin 1.1 ved hjælp af mængderne af hver komponent, der er anført for 1,5x BSK i tabel 1. Opbevares som beskrevet for 1x BSK.
    2. Forbered 2,1% agarose i vand og autoklave. Brug agaroseopløsningen frisk eller opbevares ved stuetemperatur. Hvis den opbevares ved stuetemperatur, mikrobølgeovn med låget løst på, indtil den er helt smeltet inden plettering.
    3. Det eller de antibiotikamængder, der er nødvendige for at opnå den passende koncentration (tabel 2), bestemmes ud fra hele belægningsblandingen.
      BEMÆRK: Hvis det samlede volumen af den endelige belægningsopløsning er 300 ml, blandes 200 ml 1,5x BSK og nok antibiotika til at sikre, at hele 300 ml har den korrekte endelige antibiotikakoncentration. Hvis både donor og modtager i transduktionsanalysen har forskellige antibiotikaresistensgener, skal pletteringsblandingen indeholde begge antibiotika. Hvis den PEG-udfældede fra donoren (som forberedt i trin 5) koder for en antibiotikaresistensmarkør, og modtageren ikke har nogen, bør pletteringsblandingen kun indeholde det ene antibiotikum.
  3. Baseret på antallet af plader, der skal hældes, overføres den passende mængde 1,5x BSK og antibiotika til en steril flaske, der er stor nok til at rumme hele pletteringsblandingen. Ligevægt i et vandbad ved 56 °C i ≥15 min.
  4. Ligevægt smeltet agarose fra autoklaven eller mikrobølgeovnen i et 56 °C vandbad i ≥15 min.
  5. Efter ækvilibrering tilsættes den bestemte mængde på 2,1% agarose til flasken med 1,5x BSK (med antibiotikum) og anbringes pletteringsopløsningen tilbage i vandbadet ved 42 °C i 10-15 min.
    BEMÆRK: Højere temperaturer kan beskadige eller dræbe spirocheterne36. Hvis du bruger det samme vandbad som ovenfor, afkøles vandbadet til 42-45 °C, inden timeren for ligevægten startes. Pletteringsopløsningen må ikke balancere ved 42 °C i mere end 20 minutter, ellers begynder den at størkne, mens pladerne hældes.
  6. Under ækvilibrering fremstilles B. burgdorferi-prøverne , der skal belægges. Overfør den mængde, der skal belagtes, til et sterilt 50 ml konisk centrifugerør (se Materialetabel).
    1. Hvis der pletteres en mængde på under 1,5 ml (<5 % af det endelige pladevolumen på 30 ml), overføres prøven til det nye rør, og pletteringsblandingen tilsættes direkte til prøven under pletteringen.
    2. Ved større volumener overføres det ønskede dyrkningsvolumen til det nye rør og centrifugeres derefter ved 6.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Dekanter alle undtagen 100-500 μL af supernatanten og brug resten til at resuspendere pelleten fuldstændigt inden plettering.
    3. Til kontrolplader efter samdyrkning tilsættes ≥107 celler fra donor- eller recipientkloner til sterile 50 ml koniske centrifugerør. Hvis rumfanget er over 1,5 ml, centrifugeres pelleten og resuspenderes som i trin 7.6.2. Hvis et transduktionsassay blev udført ved hjælp af den PEG-udfældede, tilsættes 100-250 μL af fagprøven ud over modtagerklonen i et sterilt 50 ml konisk rør til plettering.
  7. Efter at pletteringsopløsningen er afbalanceret ved 42-45 °C i 10-15 minutter, overføres 30 ml af pletteringsopløsningen til et rør med den relevante prøve; Dispenser straks pletteringsblandingen og prøven i en mærket plade. Gentag med en frisk pipette for hver prøve, der skal belægges på plade.
  8. Lad pladerne størkne i 15-20 minutter, og læg dem derefter i en 33 °C inkubator suppleret med 5% CO2. Vend ikke pladerne i mindst 48 timer efter hældning.
  9. Afhængigt af baggrunden for modtagerklonen skal du kontrollere, at kolonierne vises inden for agarosen på udvælgelsespladerne efter 10-21 dages inkubation. Vælg mindst 5-10 kolonier, der vokser på pladen i nærværelse af begge antibiotika ved hjælp af en steriliseret bomuldstilsluttet 5,75 i borosilikatpipette (se Materialetabel) og pod dem i 1,5 ml 1x BSK med det eller de relevante antibiotika.
  10. De podede kolonier dyrkes ved 33 °C som i trin 1,3 i 3-5 dage, eller indtil de når en massefylde på ca. 20-40 spirocheter pr. felt ved 200x forstørrelse ved hjælp af darkfieldmikroskopi.
    BEMÆRK: Når spirocheterne er screenet (se trin 8), kan de fryses til langtidsopbevaring ved -80 °C ved at blande et lige stort volumen kultur med en blanding af 60% glycerol og 40% 1x BSK steriliseret ved filtrering gennem et 0,22 μm filter.

8. Verifikation af potentielle transduktanter

BEMÆRK: Screen klonerne, der vokser på plader i nærværelse af to antibiotika for at kontrollere, at de repræsenterer ægte transduktanter i den forventede (modtager) baggrund. Disse metoder er baseret på amplifikation og potentielt sekventering af specifikke regioner ved polymerasekædereaktionen. Detaljerede protokoller og praksis for udførelse af PCR i B. burgdorferi er beskrevet andetsteds (for et nyligt eksempel, se Seshu et al.37). Vælg de primere, der bruges til screening af transduktanterne baseret på de anvendte stammer. Nogle forslag til, hvordan man griber screening af transduktanterne an, er beskrevet nedenfor.

  1. Forbered B. burgdorferi lysater til PCR-screening.
    BEMÆRK: Følgende protokol anvendes til fremstilling af vaskede B. burgdorferi-lysater fra dyrkede celler dyrket som i trin 7.9 til øjeblikkelig analyse af DNA'et ved PCR. Denne metode er designet til at minimere interferensen fra potentielle hæmmere i BSK, men anbefales ikke til fremstilling af DNA af høj kvalitet til sekventering eller opbevaring. Til dette formål skal du bruge en protokol eller et sæt til total genomekstraktion (se Materialetabel). Det anbefales stærkt, at lysater fra moderklonerne (både donor- og recipientstammer) også fremstilles på samme tid for at inkludere i hver analyse.
    1. 500 μL af hver potentiel transduktant udvalgt og dyrket som i trin 7.10 overføres til et rent mikrocentrifugerør.
    2. Centrifuge kulturerne i 10 minutter ved 8.000 x g ved stuetemperatur.
    3. Supernatanten fjernes, og hver pellet resuspenderes i 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifuge i 5 minutter ved 8.000 x g ved stuetemperatur.
    4. Supernatanten fjernes, og hver pille suspenderes i 50 μL vand af PCR-kvalitet. Kog prøverne i 10 min. Lad dem køle af kort, og centrifuger derefter ved 8.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
    5. For hver PCR skal der straks anvendes 2 μL fra toppen af den centrifugerede prøve; undgå at forstyrre pelleten.
  2. Screen de potentielle transduktanter for de specifikke gener, der koder for antibiotikaresistens ved hjælp af PCR. Se tabel 4 for primere til screening af antibiotikaresistensmarkører, der almindeligvis anvendes i transduktionsassays.
    BEMÆRK: Selvom det er sjældent i vores erfaring, kan spontan mutation til aminoglycosidantibiotika, der anvendes til udvælgelse af heterologt DNA i B. burgdorferi , forekomme.
  3. Screen de potentielle transduktanter også ved hjælp af en anden stamme eller klonmarkør for at bekræfte, at baggrunden er modtagerens. Medtag både donor- og modtagerforældrekloner i disse analyser. Skærm for stammespecifikke markører ved hjælp af sekvenser baseret på de anvendte stammer og individuelle laboratorieprotokoller til bestemmelse af belastningsintegritet.
  4. Hvis man forsøger at transducere til virulente kloner til brug inden for flåtvektoren eller pattedyrsværten eller til direkte sammenligning med en anden klon, skal man bestemme det komplette plasmidindhold i transduktanterne og moderklonerne. Dette gøres for at sikre det samme plasmidindhold som indholdet af den sammenlignende stamme eller tilstedeværelsen af de genetiske elementer, der er nødvendige for formering inden for den enzootiske cyklus, som beskrevet andetsteds 18,19,37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Brugen af bakteriofag til at flytte DNA mellem lettere transformerbare B. burgdorferi-stammer eller kloner, der er genstridige over for elektrotransformation, repræsenterer et andet værktøj til fortsat molekylær undersøgelse af determinanterne for borreliose. Transduktionsassayet beskrevet heri kan ændres efter behov for at lette bevægelsen af DNA mellem eventuelle kloner af interesse ved hjælp af enten et eller to antibiotika til udvælgelse af potentielle transduktanter. Transduktionen af både prophage-DNA og heterologe E. coli/B. burgdorferi-shuttlevektorer mellem en højpassagestamme CA-11.2A-klon og både en højpassagestamme B31-klon og en virulent klon med lav passage af stamme 297 er tidligere blevet påvist28. Resultaterne præsenteret nedenfor viser bevægelsen af prophage DNA mellem to højpassage, avirulent kloner. Donorklonen, c1673, er en B. burgdorferi stamme CA-11.2A klon, der koder for et kanamycinresistensgen på prophage-DNA'et27,28. Modtageren er en klon af B. burgdorferi stamme B31, betegnet c1706, som koder for en gentamicin-resistensmarkør på kromosom28. Transduktionsanalysen blev udført som illustreret i figur 1B; den PEG-udfældede, der blev genvundet fra supernatanterne af c1673 udsat for 5% ethanol, blev blandet med c1706 som beskrevet i trin 6 i protokollen.

Efter blanding af ca. 20% af fagen genvundet ved PEG-udfældning fra supernatanterne af ethanoleksponeret c1673 (kodningsresistens over for kanamycin) med c1706 (kodningsresistens over for gentamicin) blev blandingen belagt i nærværelse af begge antibiotika; kolonidannende enheder (CFU'er), der er i stand til at vokse i nærværelse af både kanamycin og gentamicin, er tegn på transduktionshændelser (figur 2) 27,28. Antallet af CFU'er rapporteres som transduktionsfrekvensen pr. indledende modtagercelle. I dette repræsentative eksperiment blev ca. 275 transduktanter genvundet efter inkubation af fagen med 1 × 107 modtagerceller, hvilket gav en transduktionsfrekvens på 2,75 × 10-5 CFU'er pr. modtagercelle.

Efter genfinding af de potentielle transduktanter blev PCR-amplifikation af generne, der koder for kanamycin- og gentaminresistens, udført på 10 af klonerne, med to repræsentative prøver vist i figur 3. Kanamycinresistensgenet kunne forstærkes fra donoren (c1673) og de potentielle transduktanter, men ikke modtagerne (c1706). På samme måde kunne gentamicinresistensgenet forstærkes fra modtageren (c1706) og de potentielle transduktanter, men ikke donoren. Således koder de genvundne kloner specifikt for både antibiotikaresistensgener og repræsenterer transduktionshændelser, ikke spontane mutanter.

For at påvise, at kanamycinresistenskassetten blev transduceret af φBB-1 fra donoren til modtageren, blev transduktanternes baggrund bestemt ved hjælp af stammespecifikke markører, som beskrevet tidligere28. Dette er især vigtigt, hvis transduktanterne er genereret ved co-kulturmetoden til transduktion. Kort fortalt blev tidligere offentliggjorte primere28 brugt til at forstærke specifikke regioner af forskellige borreliale plasmider og generere en profil, der kan bruges til at identificere klonens baggrund (figur 4). C1673-klonen i CA-11.2A-baggrunden koder for specifikke ampliconer 4, 5 og 6, mens c1706, som har en B31-baggrund med høj passage, ikke gør det. På samme måde mangler de to transduktanter ampliconer 4, 5 og 6; Disse kloner har således C1706-baggrunden og har erhvervet kanamycinresistensgenet fra C1673.

Komponent 1x BSK (til dyrkning) (1 L) 1,5x BSK (til plettering) (1 L)
Bovin serumalbumin (fraktion V) 35 g 52,5 g
10x CMRL-1066 (uden L-glutamin) 8 g 12 g
Neopeptone 4 g 6 g
gær 1,6 g 2,4 g
HEPES 4,8 g 7,2 g
Glukose 4 g 6 g
Natriumcitrat 0,56 g 0,84 g
Natriumpyruvat 0,64 g 0,96 g
N-acetyl-glucosamin 0,32 g 0,48 g
Natriumbicarbonat 1,76 g 2,64 g
Varmeinaktiveret normalt kaninserum (INRS) 66 ml 99 ml

Tabel 1: BSK til dyrkning og udvælgelse af B. burgdorferi-kloner til transduktionsassays. Formuleringen og forberedelsen af 1x BSK til dyrkning af B. burgdorferi og 1,5x BSK til fastfasevalg af B. burgdorferi-kloner, der er beskrevet her, er baseret på Samuels15. Forskellige formuleringer af BSK (eller MKP)37,40,41, der understøtter væksten af B. burgdorferi, er endnu ikke blevet testet ved hjælp af transduktionsanalysen.

Antibiotikum Koncentration af lagre Endelig koncentration i kultur af Bb
Kanamycin 100 mg.mL-1 (i vand) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicin 50 mg.mL-1 (i vand) 50 μ g.mL-1
Streptomycin 50 mg.mL-1 (i vand) 50 μ g.mL-1
Erythromycin 2 mg.mL-1 (i EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabel 2: Potentielle antibiotika og koncentrationer, der skal anvendes til udvælgelse og vedligeholdelse af heterologt DNA i B. burgdorferi. Denne liste er baseret på nuværende antibiotikaresistente markører, der almindeligvis anvendes i Borrelia burgdorferi42,43,44,45. Kanamycin, gentamicin og streptomycin fremstilles i vand, filtreres gennem et 0,22 μM filter og opbevares ved -20 °C. Erythromycin fremstilles i 95% ethanol og opbevares ved -20 °C. Mange laboratorier rapporterer om vellykket anvendelse af kanamycin til udvælgelse i en koncentration på 200 μg·mL−1; ved anvendelse af både gentamicin og kanamycin til udvælgelse i transduktionsassays anvendes 400 μg·mL-1 kanamycin. AadA-genet giver resistens over for både streptomycin og spectinomycin44. Til udvælgelse af konstruktioner indeholdende aadA-genet i E. coli, 100 μg·mL−1 spectinomycin anvendes. Bemærk, at aminoglycosiderne (kanamycin, gentamicin og streptomycin) ikke er klinisk relevante til behandling af borreliose; Erythromycin anvendes dog klinisk i visse situationer46. Selvom naturlig resistens over for dette antibiotikum i B. burgdorferi er blevet rapporteret47, er denne resistensmarkør hidtil ikke blevet brugt i de transduktionsassays, der er rapporteret her.

Inducerende middel Stamkoncentration (opløsningsmiddel) Endelig koncentration i prøven
Ethanol 100% (ingen) 5%
Mitomycin C 2 mg.mL-1 (vand) 20 μ g.mL-1
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

Tabel 3: Potentielle inducerende stoffer og koncentrationer anvendt til induktion af φBB-1 fra B. burgdorferi. N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), mitomycin C og ethanol samt methanol og isopropanol er alle blevet påvist at inducere φBB-1 over konstitutive niveauer i B. burgdorferi stamme CA.11-2A25,26,28. MNNG er mistænkt for at være kræftfremkaldende og miljøfarlig. Brug med forsigtighed, opløs i et brændbart opløsningsmiddel, og forbrændes til bortskaffelse. Mitomycin C er mistænkt for at være kræftfremkaldende og potentielt miljøfarligt; Brug med forsigtighed under en kemisk røghætte og bortskaf korrekt. Mens offentliggjorte data tyder på, at MNNG er det mest effektive middel til at inducere φBB-126, gør farerne ved at arbejde med dette kemikalie og vanskeligheder med at erhverve det dets anvendelse kompliceret48, især med studerende. Induktion med ethanol er konsekvent bedre end med methanol eller isopropanol28 og har været mest almindeligt anvendt i transduktionsassayet.

Gennavn eller betegnelse Antibiotikaresistens Henvisning Grundnavn Primersekvens (5 ́ til 3 ́)
Kan R fra Tn903 Kanamycin 42 KanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
KanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
AACC1 Gentamicin 43 AacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
AAC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA Streptomycin 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabel 4: Primere anvendt til foranalyse af transduktion af antibiotikaresistensmarkører. De primere, der er angivet her, er til påvisning af antibiotikaresistensgener, der almindeligvis anvendes i transduktionsassays. Disse primere anvendes i PCR med følgende betingelser gentaget i 28 cyklusser: denaturering ved 92 °C i 15 s, primerglødning ved 56 °C i 15 s og mål-DNA-forlængelse ved 72 °C i 30 s.

Figure 1
Figur 1: Transduktionsassay til overvågning af den fagmedierede bevægelse (transduktion) af DNA. Transduktionsassayet kan udføres ved hjælp af enten (A) samkulturmetoden eller (B) genvundet fra kultursupernatant ved PEG-udfældning. Til samkulturmetoden (A) dyrkes en induceret B. burgdorferi-klon (donoren), der koder for et antibiotikaresistensgen på DNA'et, der skal transduceres af φBB-1 (grøn cirkel), med en ikke-induceret B. burgdorferi-klon (modtageren), som koder for et andet antibiotikaresistensgen på kromosomet eller andet stabilt genetisk element (rød cirkel). Denne metode kræver brug af to forskellige antibiotikaresistensmarkører (i dette eksempel gener, der koder for kanamycin og gentamicinresistens). For at anvende den oprensede i transduktionsassayet (B) blandes fagpartikler, der genvindes ved PEG-udfældning af supernatanten fra den inducerede donor, med modtageren. Mens vist her ved hjælp af to forskellige antibiotika, kan denne metode udføres ved brug af kun en antibiotikaresistensmarkør kodet på φBB-1 prophage-DNA, som tidligere demonstreret27. Efter inkubation vælges transduktanter ved fastfasebelægning i nærværelse af begge antibiotika; hvis metode B anvendes med kun en antibiotikaresistensmarkør kodet på-DNA'et, udføres udvælgelsen kun ved hjælp af dette antibiotikum under fastfasebelægning. Transduktanterne vil indeholde både antibiotikaresistensmarkører og have modtagerens baggrund. Denne figur er genoptrykt fra Eggers et al.28 med tilladelse fra Oxford University Press. I det modellerede eksperiment repræsenterer c1673 og c1650 to forskellige CA-11.2A kloner; c1673 bærer en φBB-1 prophage, der koder for kanamycinresistens, og c1650 koder for en gentamicin-modstandsmarkør på en ikke-fagplacering28. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kolonidannende enheder udvalgt ved fastfasebelægning efter transduktionsassayet. Kolonier, der vokser i nærværelse af begge antibiotika efter blanding af fagen fra c1673 med c1706, repræsenterer potentielle transduktanter. Ingen kolonier bør vokse på kontrolplader, der indeholder de enkelte donor- og modtagerkloner eller en prøve af fagforberedelse (ikke vist). Det mindste antal produktive fager i den oprindelige prøve kan bestemmes ved at tælle antallet af CFU'er og multiplicere med fortyndingsfaktoren. I dette tilfælde gav 20% af fagprøven PEG-udfældet fra en 15 ml kultur af donoren ca. 275 kolonier. Således var den oprindelige koncentration af produktiv genvundet ved PEG-udfældning ≥1,3 × 103 virioner. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: PCR-forstærkning af generne, der giver kanamycinresistens og gentaminresistens fra to potentielle transduktanter. PCR ved hjælp af primere til kanamycin- og gentamicinresistensgenerne (tabel 4) blev udført for at screene lysaterne genereret fra to kolonier (transduktant 1 og transduktant 2). Disse kolonier blev udvalgt på en plade indeholdende både kanamycin og gentamicin efter blanding af c1673 (donor) og c1706 (modtager). Ampliconerne blev opløst på en 1% agarosegel elektroforesat i 60 minutter ved 120 V i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer og farvet med 0,5 μg · ml-1 ethidiumbromid. Tallene angiver størrelsesmarkører i kilobasepar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Bekræftelse af transduktanternes baggrund. Regioner af specifikke genetiske elementer blev forstærket fra c1673, c1706, og de to transduktanter, som beskrevet tidligere28, for at bekræfte, at baggrunden for transduktanterne var modtagerklonens, c1706. De valgte regioner var baseret på sekvenserne af gener på specifikke lineære eller cirkulære plasmider (henholdsvis lp eller cp) inden for B. burgdorferi-typestammen , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) og 8 = fla-genet (kromosom). Ampliconerne blev opløst på en 1% agarosegel elektroforesat i 60 minutter ved 120 V i 1x TAE-buffer og farvet med 0,5 μg · ml-1 ethidiumbromid. Tallene angiver størrelsesmarkører i kilobasepar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anvendelsen af transduktion kunne repræsentere en metode til at overvinde i det mindste nogle af de biologiske og tekniske barrierer forbundet med elektrotransformationen af B. burgdorferi 1,4,13,37. I mange systemer kan bakteriofag flytte værts-DNA (ikke-prophage) mellem bakterieceller ved enten generaliseret eller specialiseret transduktion 22,23,24,49,50. I specialiseret transduktion pakkes altid nogle få værtsgener inden for fagkapsidet sammen med prophage-DNA'et49,50. For eksempel pakker φBB-1 altid de dele af cp32, der er bakterielle, fordi de er uløseligt forbundet på plasmidet til de dele af cp32, der er faggenomet. I generaliseret transduktion menes bakteriofagens emballeringsmekanisme at låse sig fast på homologe ikke-fagsekvenser og "ved et uheld" pakke tilfældigt værts-DNA i stedet for-DNA; disse stykker DNA er derefter i stand til at blive introduceret i en anden celle49,50. Lidt er endnu kendt om generaliseret transduktion af i B. burgdorferi; i bedre karakteriserede bakteriesystemer kan så mange som 1% af bakteriofagen frigivet fra en celle imidlertid indeholde tilfældige bakterielle gener i stedet for-DNA51. Indtil videre er der ikke observeret kromosomale markører at blive transduceret mellem forskellige B. burgdorferi-kloner, men den tidligere påvisning af, at både cp32'er og små heterologe shuttlevektorer kan pakkes og transduceres af φBB-1, indikerer, at denne kan deltage i både specialiseret og generaliseret transduktion28. Derfor foreslås en brugssag for transduktion i laboratoriet, hvor elektrotransformation, der genererer en kromosomal mutation, stadig udføres i baggrunden af interesse; Imidlertid kunne introduktionen af shuttlevektorer til komplementering i trans- eller ekspressionsundersøgelser ved hjælp af reporterkonstruktioner i stammer, der er genstridige over for elektrotransformation, ske via transduktion mellem en mere transformerbar højpassageklon og mindre transformerbare stammer. Hvis fremtidige undersøgelser viser φBB-1's evne til også at pakke og flytte kromosomale loci, kan de metoder, der er beskrevet heri, også vise sig nyttige til at flytte modificeret kromosomalt DNA mellem lettere transformerbare stammer og stammer, der ellers er vanskelige at elektrotransformere. De cp32-lignende plasmider er gennemgribende blandt alle B. burgdorferi-stammer og langt størstedelen af de andre borrelia-sygdomme spirochetes52,53; der er også tegn på homologer i andre Borrelia-arter, herunder B. mayonii, B. miyamotoi, og dem, der forårsager tilbagefaldende feber54,55,56. Om homologerne i andre Borrelia-arter også er prophage vides endnu ikke, men i så fald kan transduktion også være et redskab til molekylær dissektion af disse arter, hvoraf nogle endnu ikke er blevet genmanipuleret med succes.

To metoder til transducering af DNA er blevet præsenteret her: samdyrkning af donor- og recipientkloner sammen inden selektion (figur 1A) eller PEG-udfældende fra donoren og kun blanding af denne med modtageren (figur 1B). Antallet af transduktionshændelser pr. modtagercelle er højere efter samkultur, end det er ved hjælp af PEG-udfældet28, men samkultur kræver, at både donor og modtager bærer forskellige antibiotikaresistensmarkører, og at baggrunden for eventuelle transduktanter screenes omhyggeligt. Da φBB-1-prophagen er allestedsnærværende blandt Borrelia52,53, er der en teoretisk chance for, at en antibiotikaresistensmarkør eller andet heterologt DNA ved blanding af aktivt voksende kloner kan bevæge sig fra modtageren til donoren (snarere end fra donoren til modtageren, som tilsigtet). Brug af PEG-udfældet i transduktionsanalysen eliminerer denne mulighed, da donoren ikke er til stede i/recipient-blandingen. Derudover kræves PEG-udfældning af fagen, hvis fagen og dens genomiske indhold skal bruges både til analyse (dvs. strukturanalyse, kvantificering, identifikation af emballeret materiale osv.) og transduktion. På trods af disse fordele har brugen af PEG-udfældet sine potentielle ulemper; Ud over ikke at give så mange transduktanter som med samkultur kan PEG-nedbør være tidskrævende, kan føre til betydeligt fagtab og resulterer i prøver, der har forurenende stoffer, der kan forstyrre nedstrøms applikationer57,58.

Transduktion er blevet demonstreret fra tre B. burgdorferi stammer hidtil: CA-11.2A, en højpassage B31 klon og en lav-passage 297 klon28. Af disse tre producerer B. burgdorferi-stammen CA-11.2A den højeste mængde efter induktion25,26,28; selv efter induktion er antallet af fager, der er genvundet fra B. burgdorferi, dog stadig størrelsesordener lavere end fagen, der er genvundet i bedre karakteriserede systemer, såsom coliphage λ25,28,59. Et problem, der kan opstå ved anvendelse af transduktion via enten samkultur eller blanding af efter PEG-udfældning, er således det lille antal bakteriofager, der frigives fra B. burgdorferi, selv når de udsættes for inducerende midler. Derudover er batch-til-batch-variation i fagproduktion signifikant, selv når alle forhold, mediekomponenter og metoder ser ud til at være konsistente mellem eksperimenter. Af denne grund er det vigtigt at bestemme, at mindst et minimum antal produceres fra en given klon eller under en given tilstand. Traditionelle assays til bestemmelse af antallet af fager i en prøve kræver blanding af en lille mængde prøve indeholdende med en tilladelig bakteriel vært, hvor bakteriofagen er lytisk; Antallet af produktive fagpartikler i prøven bestemmes af antallet af lytiske hændelser, der forekommer i den baggrund, hvilket resulterer i dannelse af plaques på en græsplæne af bakterierne60,61. Antallet af fager rapporteres som plaquedannende enheder (PFU'er)61. Kvantificering af antallet af produktive φBB-1 frigivet efter induktion ved hjælp af et plaqueassay hindres af manglende evne til at dyrke Borrelia burgdorferi i en tæt græsplæne og en nuværende mangel på forståelse af de mekanismer, der styrer skiftet mellem de lysogene og lytiske replikationscyklusser af φBB-1. Mens anekdotiske rapporter om lyserede kulturer af B. burgdorferi er talrige, har der hidtil ikke været nogen offentliggjorte undersøgelser, der korrelerer observationen af lysis af en hel kultur med produktionen af. Erfaringsmæssigt synes kun et lille antal celler i en given kultur spontant at producere, formodentlig ved lysis, og denne produktion kan kun øges beskedent med eksponering for de kendte inducerende midler25,28,62. Således er et plaque-assay i øjeblikket ikke muligt at kvantificere φBB-1 fra B. burgdorferi.

For at kvantificere antallet af produktive fager produceret efter induktionen af B. burgdorferi kan transduktionsanalysen som beskrevet i denne rapport udføres ved hjælp af en tilladelig B. burgdorferi-klon med et andet antibiotikum end det, der er pakket af bakteriofagen. Denne analyse resulterer i kolonier, der skyldes transduktion, hvor hver koloni repræsenterer en bekræftet. Således kan det mindste antal i en prøve rapporteres som CFU snarere end PFU. Dette tal er sandsynligvis (langt) lavere end det faktiske samlede antal producerede fager på grund af ineffektivitet, der er forbundet med genopretning af ved PEG-udfældning (hvis det anvendes), vedhæftning og injektion af DNA ved og fastfasebelægning af B. burgdorferi.

En potentiel metode til at bestemme den samlede mængde prophage-DNA inden for supernatanterne af B. burgdorferi-kulturer er kvantitativ PCR (qPCR), men qPCR-protokoller for cp32-DNA fra B. burgdorferi er ikke godt repræsenteret i litteraturen, og qPCR er endnu ikke en metode, der er meget udbredt til dette formål. For kvalitativt at bestemme, at der er mindst et moderat niveau af-DNA i en given prøve, kan det samlede DNA ekstraheres fra de PEG-udfældede supernatanter af B. burgdorferi-kulturerne efter DNase-behandling inden ekstraktion; -DNA'et vil blive beskyttet af en intakt fagkapsid25. Det genvundne DNA opløses derefter i en agarosegel og visualiseres med en DNA-plet; denne protokol giver typisk et svagt 30 kb bånd, der repræsenterer det lineære DNA pakket i faghovedet25. Baseret på plettens følsomhed og intensiteten af det korrekt dimensionerede-DNA-bånd i forhold til en markør kan det omtrentlige antal samlede genvundne fager bestemmes25,27. En stærk positiv korrelation mellem niveauerne af total-DNA, der blev genvundet fra supernatanten, og antallet af transduktanter, der blev genvundet efter transduktionsassayet, er tidligere påvist28.

Valget af donor- og recipientstammer er afgørende for succesen med brugen af transduktion som molekylært værktøj. Vores forståelse af cp32'er som en prophage af φBB-1 kompliceres både af udbredelsen af cp32'erne i borreliosen spirochetes52,53 og af det faktum, at en individuel B. burgdorferi-celle kan indeholde flere homologer af disse plasmider. Alle cp32'erne i en celle ser ud til at være pakket i faghoveder i de fagproducerende stammer, der er blevet undersøgt27. Det er imidlertid ikke klart, om alle B. burgdorferi-stammer, der indeholder cp32'er, kan producere bakteriofag, og stammer bør testes for denne evne inden brug. Tilsvarende er der intet kendt om receptorerne, der tillader en bestemt stamme at blive transduceret af φBB-1, selvom allestedsnærværende prophageplasmid i hele slægten antyder en stor sandsynlighed for, at en bestemt stamme kan transduceres. Som det kan udledes af tilstedeværelsen af flere cp32 plasmider i en individuel B. burgdorferi-celle, synes der ikke at være nogen fagimmunitet63 tildelt ved tilstedeværelsen af en eksisterende prophage; stammerne CA.11-2A, B31 og 297 er blevet anvendt i transduktionsassays og producerer og kan transduceres med φBB-127,28. Mens tidligere rapporter viste, at transduktion kun var mulig i et begrænset antal stammer ved hjælp af PEG-udfældet27, kan det have været på grund af tekniske vanskeligheder med denne metode, da alle de stammer, der hidtil er testet, med succes er blevet transducerbar ved hjælp af samkulturmetoden28.

Når man designer et eksperiment til at bruge transduktionsassayet, bør de vigtigste overvejelser for valget af donorstamme være den genetiske baggrund, dens evne til let at blive transformeret via elektroporation og dens evne til at producere. Selvom der ikke er foretaget en udtømmende undersøgelse af kloner med høj passage af hver stamme, producerer stammen CA-11.2A konstitutivt på påviselige niveauer, selv i fravær af induktion. Tilsvarende producerer højpassagekloner af B31, den første B. burgdorferi-stamme, der er fuldstændigt sekventeret5 og en almindeligt anvendt stamme i molekylære undersøgelser, også konstitutivt påviselige mængder φBB-1 og er generelt meget transformerbare 1,4,25,27,37,64 . Hvis undersøgelser kræver andre stammer, anbefales det, at højpassagekloner af denne stamme først testes for deres transformerbarhed ved at indføre et plasmid indeholdende en antibiotikaresistensmarkør via elektroporation og derefter vurderes for deres evne til at blive transduceret ved at udføre et transduktionsassay med en tilladelig modtager, såsom CA-11.2A eller B31, der koder for en anden antibiotikaresistensmarkør. For at sikre, at en modtagerstamme eller klon er tilladt for transduktion, kan en fagproducerende stamme, såsom CA-11.2A, der bærer en prophage, der koder for resistens over for et antibiotikum, blandes med klonen af interesse for at sikre, at transduktion finder sted.

Meget er stadig at forstå om molekylærbiologien af φBB-1 og dens rolle i HGT inden for B. burgdorferi, især da den passerer den enzootiske cyklus. ΦBB-1's evne til eksperimentelt at transducere både og heterologt DNA i laboratoriet giver imidlertid mulighed for at tilføje et andet værktøj til molekylær dissektion af B. burgdorferi og dets rolle i patogenesen af Lyme-sygdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatteren ønsker at takke Shawna Reed, D. Scott Samuels og Patrick Secor for deres nyttige diskussion og Vareeon (Pam) Chonweerawong for deres tekniske bistand. Dette arbejde blev støttet af Institut for Biomedicinsk Videnskab og fakultetets forskningsbevillinger til Christian H. Eggers fra School of Health Sciences ved Quinnipiac University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

Immunologi og infektion udgave 187 Borrelia burgdorferi bakteriofag vandret genoverførsel transduktion
Fagmedieret genmanipulation af borreliose Spirochete <em>Borrelia burgdorferi</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter