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Misurazione transdermica della velocità di filtrazione glomerulare nei suinetti ventilati meccanicamente

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology, College of Medicine University of Tennessee Health Science Center
* These authors contributed equally

Summary

La velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il marker ideale per valutare la funzionalità renale. Tuttavia, il metodo di misurazione standard che utilizza l'iniezione di inulina con analisi seriale del sangue e delle urine non è pratico. Questo articolo delinea un metodo pratico per misurare la GFR transdermica nei suinetti.

Abstract

La misurazione transdermica della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è stata utilizzata per valutare la funzionalità renale negli animali coscienti. Questa tecnica è ben consolidata nei roditori per studiare il danno renale acuto e la malattia renale cronica. Tuttavia, la misurazione della GFR utilizzando il sistema transdermico non è stata convalidata nei suini, una specie con un sistema renale simile a quello umano. Quindi, abbiamo studiato l'effetto della sepsi sulla GFR transdermica in suini neonatali anestetizzati e ventilati meccanicamente. La sepsi polimicrobica è stata indotta dalla legatura e puntura cecale (CLP). Il sistema di misurazione transdermica della GFR costituito da un sensore di fluorescenza miniaturizzato è stato collegato alla pelle rasata del maiale per determinare la clearance della sinistrina coniugata con fluoresceina-isotiocianato (FITC), un tracciante GFR iniettato per via endovenosa. I nostri risultati mostrano che a 12 ore post-CLP, la creatinina sierica è aumentata con una diminuzione della GFR. Questo studio dimostra, per la prima volta, l'utilità dell'approccio transdermico GFR nel determinare la funzionalità renale nei suini neonatali ventilati meccanicamente.

Introduction

Una valutazione pratica e quantitativa della funzionalità renale è la misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR), che indica quanto bene i reni filtrano il sangue in base al principio di clearance1. Un metodo precedente di misurazione della GFR prevedeva l'iniezione endovenosa di composti esogeni come l'inulina o la sinistrina, conducendo misurazioni seriali dei livelli plasmatici/urinari per rilevarne la clearance 2,3. Questo metodo è macchinoso e richiede la raccolta seriale di campioni di plasma e urina4. Un'alternativa è la misurazione dei prodotti metabolici endogeni come la creatinina. Tuttavia, questo richiede tempo e, a volte, è impreciso, in quanto non solo viene filtrato dal glomerulo ma anche secreto dai tubuli 5,6. Inoltre, il livello di creatinina è influenzato dal sesso, dall'età, dalla dieta e dalla massa muscolare 7,8,9.

Una misura più precisa, minimamente invasiva e ampiamente utilizzata della GFR è l'uso di monitor GFR transdermici, che misurano la GFR in tempo reale negli animali 4,10. La sinistrina, un marcatore renale esogeno altamente solubile e liberamente filtrato, è marcata con fluoresceina-isotiocianato (FITC). Questo composto coniugato viene iniettato per via endovenosa e la funzionalità renale in tempo reale può essere valutata senza raccogliere campioni di sangue e urina11. L'uso della misurazione transdermica della GFR è stato convalidato nei roditori12, nei cani 13 e nei gatti14, ma non nei suini.

Le specie suine condividono diverse caratteristiche anatomiche e fisiologiche con l'uomo, rendendole animali ideali per lo studio di varie malattie umane15. L'uso dei maiali nella ricerca biomedica traslazionale è diventato sempre più popolare e preferito rispetto ai modelli di roditori perché imita la fisiologia umana e la fisiopatologia16. I maiali neonatali sono di interesse per comprendere i meccanismi delle malattie uniche per i pazienti pediatrici17. Inoltre, i recenti progressi nel trapianto di organi da suino a organo umano sollecitano ad ampliare gli strumenti diagnostici per gli studi preclinici e clinici 18,19,20,21. Questo documento, per la prima volta, fornisce una guida per l'uso del dispositivo transdermico nella misurazione della GFR nei suini neonatali.

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Protocol

Le procedure sono scritte secondo gli standard nazionali per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Tennessee Health Science Center (UTHSC).

NOTA: I suinetti nel gruppo sperimentale sono sottoposti a legatura cecale e puntura, mentre il gruppo fittizio subisce solo l'apertura dell'addome senza legatura o puntura cecale. I suinetti di entrambi i gruppi sono tenuti sotto anestesia per 12 ore dopo la procedura per consentire il tempo sufficiente per la sepsi e il danno renale acuto (AKI) nel gruppo sperimentale. La misurazione transdermica della GFR avverrà a 8 ore dopo la procedura per un totale di 12 ore.

1. Fornitura e stabulazione dei suinetti

  1. Identificare un allevamento di maiali locali in grado di fornire suinetti neonatali di età compresa tra 3 e 5 giorni. Pianifica la consegna all'inizio della settimana per completare la sperimentazione prima che i suinetti abbiano più di 7 giorni.
    NOTA: Il fornitore ha fornito da tre a cinque suinetti il lunedì per questo esperimento; entro venerdì, i maialini avrebbero subito l'esperimento. L'uso dello stesso sesso e quasi di età simile è essenziale per evitare fattori confondenti.
  2. All'arrivo del maialino, assicurati che abbia un documento di identità individuale (ad esempio, un marchio auricolare e un record che includa peso ed età).
  3. Ospitare i suinetti in un'unità di cura degli animali da laboratorio (LACU) sotto la cura di un veterinario autorizzato. Gli animali sono alloggiati in gruppo in un ampio recinto con un solido pavimento in cemento che può essere facilmente lavato con acqua per mantenere una buona igiene.
  4. Aggiungi un mobile come una palla pesante per consentire l'arricchimento e la stimolazione ambientale.
  5. Assicurarsi che la terapia intensiva fornisca condizioni ambientali ottimali, compresi i seguenti elementi chiave: servizi igienico-sanitari, nutrizione, controllo della temperatura, ventilazione e ciclo giorno-notte controllando l'illuminazione.
  6. Chiedere al veterinario di controllare quotidianamente il suinetto, compresa la misurazione del peso, per informare lo sperimentatore se un suinetto sembra malato, il che potrebbe richiedere l'esclusione dall'esperimento.
  7. Lasciare i maialini per almeno 1 giorno per acclimatarsi all'ambiente, il che aiuta a ridurre al minimo lo stress.

2. Preparazione preoperatoria

  1. Preparare la stazione chirurgica prima di iniziare l'esperimento. Questo include una piastra riscaldante, cateteri, un ventilatore, un tubo endotracheale, soluzione salina eparinizzata e una sacca di liquido lattato ringer.
    NOTA: I suinetti hanno scarsa capacità termoregolatrice e sono inclini all'ipotermia che altera l'emodinamica22,23. Pertanto, è essenziale concedere abbastanza tempo per riscaldare il termoforo.
  2. Preparare 10 mg/ml di α cloralosio mescolandolo con soluzione salina a 60 °C fino a quando la miscela è limpida. Non surriscaldare la soluzione per evitare la cristallizzazione del farmaco al momento del raffreddamento. Filtrare con un filtro a siringa (dimensione 0,22 μm) prima di somministrare ai suinetti.
  3. Redigere farmaci anestetici basati sul peso animale: ketamina: 20 mg / kg e xilazina: 2,2 mg / kg. Utilizzare α cloralosio (5 ml/kg) per mantenere l'anestesia.
    NOTA: α cloralosio viene utilizzato a causa della facilità di somministrazione endovenosa rispetto a quella inalatoria
    anestetici, poiché questi ultimi richiedono una macchina per anestesi e un sistema di scavenging appropriato da erogare attraverso un tubo endotracheale.

3. Anestesia

  1. Eseguire l'induzione dell'anestesia nel recinto dei maiali, un ambiente familiare per i suinetti, per evitare stress eccessivo.
  2. Prelevare delicatamente il maialino per le zampe posteriori e somministrare Ketamina: 20 mg/kg e Xilazina: 2,2 mg/kg nella zampa posteriore del muscolo semimembranoso/semitendinoso, utilizzando un ago da 23 G 3/4.
  3. Attendere alcuni minuti affinché i farmaci abbiano effetto. Verificare il livello di anestesia adeguato assicurandosi che l'animale sia abbastanza rilassato da essere immobile, con perdita del riflesso palpebrale e del tono della mascella per consentire un trasporto facile e sicuro alla stazione chirurgica. Valutare il riflesso palpebrale toccando l'angolo interno dell'occhio; L'assenza di battito delle palpebre indica un'anestesia adeguata.

4. Tracheostomia

NOTA: Questo esperimento non è di sopravvivenza, quindi viene eseguita una tracheotomia per stabilire una via aerea per la ventilazione meccanica. La tracheostomia è una procedura semplice e veloce, al contrario dell'intubazione endotracheale, che è impegnativa nei suinetti data la loro anatomia della testa e delle vie aeree superiori24,25. Inoltre, il laringospasmo è comunemente riportato durante l'intubazione, con conseguente periodo prolungato di ipossia e ipercarbia che può compromettere i risultati26.

  1. Posizionare il maialino in posizione dorsale sdraiata. Identificare la cartilagine cricotiroidea palpando la prominenza della cartilagine tiroidea che si sente ferma. Sterilizzare l'area utilizzando iodio povidone e etanolo al 70% prima di applicare un drappo sterile.
  2. Utilizzando una lama chirurgica, praticare un'incisione della linea mediana ventrale di 2-3 cm inferiore all'estremità caudale della cartilagine tiroidea.
  3. Utilizzando un emostatico di zanzara curvo, sezionare senza mezzi termini i tessuti e i muscoli sottocutanei sovrastanti (sternohyoideus e coli cutanei) fino a visualizzare la membrana cricotiroidea e i primi anelli tracheali. Quando si seziona, prestare attenzione per evitare di ferire i vasi sanguigni.
  4. Ottenere una visione chiara della membrana cricotiroidea e degli anelli tracheali24, quindi utilizzare un paio di pinze ad angolo retto lungo mixter per elevare le strutture.
    1. Con un paio di piccole forbici, fai un piccolo taglio alla membrana cricotiroidea o al primo anello tracheale. Estendere il taglio orizzontalmente a ~ 0,5 cm per passare un tubo endotracheale di 3,0 mm.
    2. Inserire il tubo al segno di 5 cm. Garantire l'espansione bilaterale del torace e i suoni del respiro prima di fissare il tubo.
  5. Passare il nastro ombelicale intorno alla trachea per fissarlo in posizione. Il nastro aggiuntivo viene utilizzato per fissare il tubo alla base della mascella.
  6. Accendere il ventilatore, collegare il tubo endotracheale e ruotare le manopole specifiche (es. Manopole SIMV, manopole PEEP, ecc.) per selezionare le seguenti impostazioni di base. Modalità di controllo della pressione: ventilazione meccanica intermittente sincronizzata (SIMV); pressione inspiratoria di picco (PIP) - 15; pressione positiva di fine espirazione (PEEP) - 5; Tasso- 20; I-time - 0.6. Dopo la prima emogasanalisi, regolare le impostazioni del ventilatore in base ai risultati dei gas ematici, con l'obiettivo di mantenere un'adeguata ossigenazione e ventilazione.

5. Incannulamento dei vasi femorali

  1. Stabilire le vie aeree e la ventilazione, prima di spostare l'attenzione sui vasi femorali per l'accesso venoso e il monitoraggio invasivo della pressione sanguigna. L'arteria femorale è identificata sentendo un polso al solco tra i muscoli sartorio e gracilis, e la vena può essere trovata appena mediale all'arteria.
  2. Mentre il maialino giace in posizione dorsale sdraiata, sterilizzare la zona inguinale usando povidone-iodio ed etanolo e applicare un drappeggio di dimensioni appropriate.
  3. Utilizzare una lama chirurgica per creare un'incisione longitudinale di 3-4 cm, iniziando cranialmente dalla piega inguinale e estendendosi distalmente lungo il canale femorale.
  4. Applicare una dissezione smussata e affilata, usando rispettivamente una pinza curva e delle forbici per zanzara per sezionare fino al livello del fascio neurovascolare femorale. Il fascio può essere trovato in profondità nel corpo del muscolo gracillis27. Sezionare circonferenzialmente l'arteria femorale e la vena nel corso di 2-3 cm per consentire l'incannulamento. Argare piccoli rami laterali se necessario.
  5. Applicare una cravatta di seta 3.0 su entrambe le estremità prossimale e distale dell'arteria e della vena per applicare la trazione. Legare la sutura di seta distale sia sulla vena che sull'arteria, legando i vasi.
  6. Iniziando con la vena femorale, mantenere la trazione distale e prossimale sulle cravatte di seta e quindi utilizzare un paio di micro forbici per creare una venotomia.
  7. Successivamente, utilizzare un introduttore di catetere venoso per aprire il recipiente durante l'inserimento di un catetere in poliuretano pre-misurato con un diametro interno x diametro esterno di 0,86 mm x 1,32 mm. Una volta inserito, legare la sutura di seta prossimale 3.0 per fissare il catetere. Lavare il catetere con 3 mL di soluzione salina eparinizzata (1 U/mL). Questa soluzione può essere fatta aggiungendo 0,5 ml di eparina a 50 ml di soluzione salina normale.
  8. Inserire un catetere per la pressione sanguigna invasivo utilizzando lo stesso approccio sopra per creare un'arteriotomia e passare il catetere.
    NOTA: Mantenere la trazione distale e prossimale è essenziale per ridurre al minimo la perdita di sangue quando si accede all'arteria.
  9. Una volta fissati i cateteri, coprire il sito con una garza imbevuta di soluzione salina e, se necessario, la pelle può essere suturata utilizzando una sutura di seta 3.0 per prevenire l'infezione.

6. Mantenimento di anestesia, fluidi e gas ematici

  1. Monitorare la profondità dell'anestesia durante l'esperimento, utilizzando il tono della mascella e il riflesso palpebrale, e somministrare α-cloralosio, per via endovenosa, se necessario per mantenere l'animale in anestesia profonda. Utilizzare una dose di carico iniziale di 50 mg/kg e 20 mg/kg per ulteriori boli.
  2. Infondere lattato di suoneria ad una velocità di 4 ml/kg/h durante l'esperimento come fluido di mantenimento. Ad esempio, se il peso del suinetto è di 3 kg, la velocità di infusione del fluido è di 12 ml / h.
  3. Per l'analisi dei gas al posto letto, prelevare un campione di sangue arterioso in una siringa di gas eparinizzato e presentare il campione alla macchina analizzatrice. Selezionare l'opzione gas del sangue arterioso e attendere ~ 2-3 s affinché l'analizzatore presenti l'ago per il prelievo di sangue.
    1. Inserire con cautela l'ago nell'estremità della siringa contenente il campione di sangue. Attendere che l'analizzatore aspiri il campione richiesto e prelevare la siringa. Consentire alla macchina di analizzare il gas del sangue e presentare i risultati.
    2. Sulla base dei risultati, regolare il ventilatore per mantenere il pH tra 7,35--7,45, la pressione parziale di anidride carbonica (PCO2) tra 35-45 mmHg e la pressione parziale di ossigeno (PaO2) tra 80-150 mmHg. Le impostazioni differiscono in base al tipo di ventilatore, ma comportano in gran parte l'aumento o la riduzione della frequenza respiratoria utilizzando manopole appropriate per compensare l'ipossia e / o l'ipercapnia.
  4. Aspirare 3 ml di sangue in un tubo verde chiaro (eparina di litio). Centrifugare il campione a 2000 xg per 15 minuti, mantenuto a 4 °C per estrarre il plasma. Una volta completato, il plasma può essere analizzato immediatamente per il livello di creatinina sierica con l'analizzatore chimico al posto letto o conservato a -80 °C per analisi successive.
  5. Monitorare continuamente la temperatura utilizzando un termometro a sonda rettale e regolare la temperatura della piastra riscaldante per mantenere la temperatura dei suinetti tra 101 e 103 ° F.

7. Gruppo di esperimento; legatura cecale e perforazione (CLP) 25,28,29

NOTA: Per i suinetti nel gruppo sperimentale, eseguire il CLP per indurre la sepsi polimicrobica28 e monitorare l'animale per 12 ore dopo l'intervento chirurgico per consentire il tempo sufficiente per la sepsi grave. La registrazione GFR transdermica inizia a 8 ore dopo la legatura cecale per consentire 4 ore di registrazione.

  1. Utilizzare una lama chirurgica per creare un'incisione verticale paramediana sinistra di 5-6 cm, poiché il cieco nei maiali si trova nella fossa paralombare sinistra30. Sezionare gli strati della parete addominale, evitando lesioni ai vasi epigastrici superficiali.
  2. Una volta inciso lo strato peritoneale, utilizzare un divaricatore per migliorare l'accesso alle strutture traddominali.
  3. Identificare il colon a spirale nel quadrante in alto a sinistra dell'addome. Tracciare il colon a spirale, caudalmente e dorsalmente, per localizzare il cieco. L'ileo è visto unirsi al colon a spirale alla base del cieco.
  4. Ligare il cieco appena distale alla giunzione ileocecale (Figura 1).
  5. Usando un ago da 18 G, fai sette forature nel cieco ed estrudi le feci nell'area peritoneale.
  6. Chiudere l'addome a strati con una sutura di seta 3.0 utilizzando semplici punti interrotti o continui. Una cucitrice può anche essere utilizzata per chiudere lo strato di pelle, se disponibile.

8. Gruppo fittizio

  1. Seguire i passaggi 7.2-7.4 come sopra. Dopo aver identificato il cieco, riposizionarlo intatto e chiudere la parete addominale in modo simile.
  2. Monitorare i suinetti nel gruppo fittizio per 12 ore per eliminare qualsiasi pregiudizio confondente attribuito all'esposizione prolungata all'anestesia.

9. Configurazione del dispositivo GFR transdermico

  1. Dopo 8 ore di legatura cecale, prepararsi ad iniziare la misurazione transdermica della GFR.
  2. Utilizzare il software di servizio MB versione 3.0 per regolare la frequenza di campionamento sul dispositivo GFR. In breve, collegare il dispositivo GFR transdermico al software del computer utilizzando il connettore USB. Aprire il software, fare clic su Connetti e regolare la temporizzazione a 4000 ms. Fare clic su Scrivi per salvare le impostazioni.
    NOTA: Questo dà fino a 6 ore di tempo totale di campionamento. Nei suini, la GFR transdermica viene completata in 4 ore. Per gli esperimenti che richiedono un campionamento fino a 12 ore, scegliere l'opzione 8000 ms.
  3. Fissare i cerotti adesivi fronte-retro con una finestra trasparente al dispositivo. Collegare il dispositivo su un lato, assicurandosi che il diodo a emissione luminosa si sovrapponga alla finestra trasparente per consentire il rilevamento del tracciante.
  4. Radere l'area sovrastante la parete toracica laterale. Collegare la batteria al dispositivo e attaccare immediatamente il cerotto adesivo con il dispositivo in posizione e assicurarsi che sia ben fissato (Figura 2). Poiché i suinetti sono profondamente anestetizzati, il nastro adesivo potrebbe non essere necessario per tenere il dispositivo in posizione.
    NOTA: Il cerotto adesivo da solo è sufficiente per fissare. Tuttavia, nelle procedure in cui l'animale verrebbe manipolato, diventerebbe attivo o in cui l'anestesia potrebbe essere interrotta, potrebbe essere importante applicare un nastro. Una benda potrebbe anche essere un approccio alternativo31.
  5. È necessaria una registrazione basale di 3-5 minuti prima di somministrare FITC-sinistrin.

10. Preparazione e iniezione di FITC-sinistrina

  1. Preparare una miscela di FITC-sinistrina con soluzione salina ad una concentrazione finale di 50 mg/ml. La dose somministrata al suinetto è di 20 mg/kg. FITC-sinistrin è fornito in polvere.
    NOTA: La FITC-sinistrina può anche essere somministrata attraverso un catetere venoso periferico inserito nella vena auricolare. È essenziale raggiungere un livello di picco elevato somministrando FITC-sinistrin come bolo di spinta attraverso il catetere venoso della vena femorale.
  2. Attaccare la siringa con il farmaco su un lato di un rubinetto di arresto a tre vie e un filo salino sull'altro lato del rubinetto di arresto. Spingere la FITC-sinistrina e seguire immediatamente con un bolo salino da 5 ml prima di chiudere il rubinetto di arresto a tre vie nella vena del maialino.

11. Registrazione transdermica GFR

  1. Tenere il dispositivo attaccato al maialino per 4 ore. Durante questo periodo, tenere il suinetto sotto anestesia usando dosi intermittenti di α-cloralosio ad una concentrazione di 20 mg / kg per evitare qualsiasi artefatto di movimento.
  2. Al termine delle 4 ore, rimuovere il dispositivo e scollegare immediatamente la batteria.

12. Misurazione GFR

  1. Collegare il dispositivo GFR transdermico al computer utilizzando il connettore USB fornito dal fornitore.
  2. Aprire il software di lettura per recuperare i dati dal dispositivo. Salvare i dati non elaborati facendo clic sulla sequenza: connetti, leggi, rinomina e salva. Come indicato nel manuale, elaborare e valutare i dati salvati nel software di analisi.
  3. Aprire brevemente la versione 3.0 del software e importare i dati. Regolare le posizioni di offset, iniziale e finale utilizzando i marcatori automatici. Se necessario, rimuovete gli artefatti e fate clic su Adatta. Questo dà una lettura che mostra la clearance FITC-sinistrin in minuti (t1/2). Il t1/2 viene successivamente utilizzato per calcolare il tGFR32,33 come segue:
    Equation 1
    NOTA: In consultazione con il produttore, il fattore di conversione utilizzato per i suini è 20 (indicando che il 20% del peso corporeo è costituito da spazio extracellulare), rispetto a 21,33 nei ratti (tGFR in ml/min) e 14.616,8 nei topi (tGFR in μL/min). Questo perché la GFR è accuratamente misurata in funzione del fluido extracellulare 34,35, che a sua volta dipende dal peso corporeo36.

13. Eutanasia dei maialini

  1. Raccogliere 3 ml di sangue dopo 12 ore di CLP per ulteriori analisi biochimiche.
  2. Eutanasia del suinetto somministrando 0,2 ml/kg di miscela premiscelata di pentobarbital di sodio al 20% e fenitoina sodica per via endovenosa.
  3. Raccogliere il rene destro per lo studio istopatologico prima di portare il maialino all'obitorio.

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Representative Results

In questa sezione, presentiamo per la prima volta i dati rappresentativi dell'uso della GFR transdermica nei suini neonatali. Abbiamo usato un modello di legatura cecale e puntura che ha precedentemente dimostrato di ridurre la funzionalità renale28. Di conseguenza, abbiamo ipotizzato che nei nostri suini CLP, ci dovrebbe essere un calo acuto della GFR corrispondente all'AKI, e questo dovrebbe essere rilevato sul dispositivo GFR transdermico come aumento del tempo di clearance (t1/2), convalidando così il suo uso nei suini. Sono stati inclusi sette suinetti maschi, tre finti e quattro sepsi. I due gruppi avevano pesi comparabili (Figura 3A). Come previsto28, 12 h sepsi ha aumentato i livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP), un marcatore di batteriemia e sepsi (Figura 3B). Sono mostrate le curve rappresentative di clearance FITC-sinistrina nei suinetti sham rispetto a quelli settici (Figura 4 A,B), con AKI mostrato sovrapponendo le curve sham e sepsi (Figura 4C). L'AKI è dimostrata da una maggiore area sotto la curva per i suini CLP. Questo può essere visto visibilmente quando la curva fittizia viene posizionata sulla curva CLP. L'emivita media per FITC-sinistrin nei gruppi sham e sepsi è stata rispettivamente di 114 e 537 minuti (Figura 5A). Il GFR medio nel gruppo sham era di 5,1 ml / min / 100 g del peso corporeo, mentre nel gruppo sepsi era di 1,06 ml / min / 100 g del peso corporeo (Figura 5B). Un altro animale è stato escluso quando la sonda è stata spostata, il che ha disturbato la curva di gioco e il tempo. Mentre la creatinina sierica 12 h (un biomarcatore di danno renale acuto) non è cambiata nel gruppo sham, è stata aumentata da ~ 0,6 a 1,08 mg / dL nei suini settici (Figura 6).

Figure 1
Figura 1: Chirurgia della legatura del cieco. (A) Cieco identificato e portato all'esterno. (B) Cieco legato alla base con una cravatta di seta prima di perforare con un ago. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Attacco del dispositivo transdermico alla pelle. (A) Pelle rasata prima dell'applicazione del cerotto adesivo. (B) Dispositivo GFR transdermico attaccato al cerotto adesivo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Risultati rappresentativi. (A) Peso dei suinetti utilizzati in questo studio e ( B ) livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP) nei suinetti maschi sham e settici ventilati meccanicamente (test t spaiato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Curve rappresentative di clearance della FITC-sinistrina nei suinetti maschi finti e settici ventilati meccanicamente. (A ) 12 h sham, (B) 12 h sepsi. I suini settici presentano funzionalità renale compromessa, come dimostrato da un'aumentata area sotto la curva. I punti dati neri rappresentano i dati grezzi, le linee blu l'adattamento a tre scomparti, le linee verdi gli intervalli di confidenza del 95% e la linea rossa i dati filtrati. (C) Sovrapposizione di curve rappresentative per riflettere il grado di divergenza rispetto al basale nei suini settici. La curva della sepsi (rossa) ha mostrato una clearance minima di FITC-sinistrina, indicando AKI. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Risultati rappresentativi. (A ) emivita FITC-sinistrina e ( B) grafici GFR in suinetti maschi fittizi e settici ventilati meccanicamente (test t spaiato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Creatinina sierica in suinetti maschi sham e settici ventilati meccanicamente. (Test ANOVA unidirezionale). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Questo articolo descrive i passaggi pratici per determinare la funzionalità renale nei suini utilizzando i monitor GFR transdermici miniaturizzati e la sinistrina FITC in un modello di suino neonatale anestetizzato ventilato meccanicamente. Articoli precedenti hanno stabilito protocolli sperimentali transdermici GFR nei roditori11,12,14, ma non esistono protocolli nei suini.

Recentemente, c'è stata una spinta a esplorare modelli animali alternativi per risolvere malattie intrattabili e alleviare il peso delle malattie renali negli esseri umani. Sfortunatamente, molti di questi approcci hanno avuto limitazioni traslazionali a causa delle dimensioni, delle differenze anatomiche e fisiologiche. L'anatomia renale e la fisiopatologia dei roditori presentano importanti differenze rispetto agli esseri umani37. Poiché i sistemi umano e suino condividono caratteristiche anatomiche e funzionali simili, il modello suino può essere un modello fisiopatologico più realistico delle malattie umane38,39. I maiali sono ora ampiamente utilizzati per delineare la fisiopatologia e nello sviluppo di farmaci. Con la pubblicazione del genoma suino, accanto al successo della produzione transgenica di modelli specifici per malattia, il modello suino assumerà un ruolo più critico nella ricerca traslazionale40,41.

La clearance dell'inulina rimane il mezzo più accettato per la determinazione della GFR, ma è poco pratica nei modelli animali di grandi dimensioni a causa della necessità di infusione continua di inulina, del cateterismo della vescica e della sua natura lunga e ingombrante42. La creatinina sierica e l'azoto ureico nel sangue (BUN) sono comunemente usati per misurare la funzionalità renale negli studi preclinici, ma poiché la creatinina è secreta nei tubuli e l'urea è sempre più riassorbita nella disidratazione, questi marcatori si sono dimostrati scarsi nella stima della funzionalità renale 5,43. Fondamentalmente, la secrezione tubulare di creatinina è stata trovata per causare sovrastima della GFR quando usata come marker della funzionalità renale nei suini6. Inoltre, a causa del loro habitus corporeo, è più probabile che un aumento della creatinina sia visto in modelli animali di grandi dimensioni rispetto ai roditori. Uno studio sui topi ha rivelato un aumento di 1,5 volte della creatinina sierica 6 ore dopo la legatura cecale44. In precedenza, abbiamo mostrato un aumento della creatinina nei suini neonatali a 6 ore dopo CLP28. In questo studio, abbiamo tenuto gli animali per una durata più lunga, ~ 12 ore dopo la legatura cecale per consentire un tempo sufficiente per un significativo AKI e un successivo aumento della creatinina. Come nel nostro studio precedente, abbiamo confermato l'induzione della sepsi da un aumento dei livelli sierici di CRP, un marker di infiammazione e sepsi. In questo studio, e come mostrano articoli precedenti, la gravità della sepsi dopo CLP dipende dalla lunghezza della legatura e dal numero di punture44.

Un protocollo per misurare la GFR nei suini che utilizzano Iohexol è stato precedentemente convalidato nei suini37, ma al contrario, la procedura transdermica GFR è un netto miglioramento. È meno ingombrante, evita ripetuti prelievi di sangue o urina e offre una finestra in tempo reale sulla funzione renale e la possibilità di misurazioni seriali ripetute nello stesso animale45. Questo studio fornisce linee guida pratiche per la determinazione transdermica della GFR nei suini.

Come stabilito da altri gruppi, i passaggi più critici sono la corretta fissazione del dispositivo all'animale e l'iniezione in bolo di FITC-sinistrina. Il dispositivo di misurazione deve essere ben fissato alla superficie della pelle per evitare artefatti di movimento sulla traccia. Poiché i maiali sono meno pelosi dei roditori, non è richiesto l'uso di una crema depilatoria. Una rasatura pulita con un tagliacapelli potrebbe essere tutto ciò che serve. Ciò riduce al minimo l'aumento associato alla depilazione dell'emivita della FITC-sinistrina, il cui meccanismo è sconosciuto12. Per una corretta fissazione, sono necessari un cerotto biadesivo e un nastro adesivo per tenere il dispositivo in posizione. Le posizioni ottimali di posizionamento del dispositivo sono la parete toracica laterale e la regione addominale ventrale. Queste aree sono correlate con un minor numero di artefatti di movimento.

Quando si inietta la FITC-sinistrina, la dose corretta e completa deve essere iniettata con un movimento fluido nella vena. Quando l'iniezione viene interrotta e riavviata, crea più "mini-picchi" sulla curva di gioco. La vena della coda viene abitualmente utilizzata per i piccoli roditori, ma la vena auricolare dell'orecchio offre un percorso più accessibile e prominente nei maiali. Una cannula può essere posizionata nella vena dell'orecchio per misurazioni multiple nei maiali coscienti. Una distinzione importante da notare nel tempo di campionamento è che, a differenza dei roditori (~1-2 ore), i suini durano più a lungo (~4 ore), il che si avvicina al tempo necessario affinché la FITC-sinistrina venga eliminata dalla circolazione. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo documento che descrive in dettaglio la GFR transdermica tramite clearance FITC-sinistrina nei suini. Quindi, non esistono citazioni come riferimento. Il tempo di misurazione utilizzato ~ 4h è stato raggiunto, tramite consultazioni con il produttore. Questo tempo di campionamento è paragonabile a uno studio precedente che convalida la GFR transdermica in altri mammiferi non roditori14.

Nella valutazione della GFR transdermica nei suinetti, ci sono alcuni fattori che devono essere considerati. È noto che i modelli a un compartimento sovrastimano significativamente il GFR46; Usiamo il modello cinetico a tre compartimenti che è più accurato, fornendo una comunicazione a tre vie del marcatore iniettato per via endovenosa tra il plasma, lo spazio extracellulare e i componenti più profondi46. Inoltre, questi sono suinetti ventilati meccanicamente in anestesia molto profonda per ~ 12 ore. Poiché l'anestesia influenza la funzionalità renale47,48, potrebbe valere la pena tenerne conto nelle procedure che richiedono una lunga sedazione o in cui le manovre sperimentali richiedono un'anestesia aggiuntiva insieme al monitoraggio GFR. Infine, e forse la cosa più importante, i suinetti neonatali hanno sistemi renali ancora in via di sviluppo con nefroni immaturi che funzionano a una frazione dell'animale adulto49. Quindi, dimostrano GFR inferiore e funzionalità renale50.

Come indicato in precedenza, la GFR transdermica nei suini non è una misura assoluta delle concentrazioni di sinistrina nel sangue. È solo una stima del decadimento della fluorescenza nel tempo12. L'uso di un fattore di conversione tenta di mitigare questo, esprimendo GFR in ml/min. Tuttavia, poiché il fattore di conversione dipende dallo spazio extracellulare, che a sua volta si basa sul peso corporeo34,35,36, è possibile che esistano ampie variazioni se il peso non è controllato o se lo spazio extracellulare non è definito con precisione 51,52.

Inoltre, la pigmentazione cutanea sembra influenzare la clearance transdermica FITC-sinistrina12,31. Nei nostri studi, abbiamo scoperto che i maiali pigmentati mostravano una diminuzione del segnale. In un caso, non abbiamo rilevato il segnale in un maiale di colore intensamente scuro. Tuttavia, poiché il segnale di fondo tende a essere ridotto negli animali pigmentati12, abbiamo scoperto che i valori di GFR erano ampiamente comparabili. Una soluzione a questo è optare per aree di colore più chiaro della pelle quando si posiziona il dispositivo. Poiché questi suini sono stati ampiamente utilizzati in un modello chirurgico di malattia, con diverse forme di illuminazione e fonti di calore coinvolte, è necessario tenere conto dei potenziali artefatti di movimento sulle tracce GFR attraverso la luce riflessa assorbita dalla pelle circostante12. Una soluzione a questo potrebbe essere quella di ridurre al minimo la luce infrarossa durante la registrazione o coprire i dispositivi in un foglio.

In sintesi, questo studio offre un metodo semplice e affidabile per misurare la velocità di filtrazione glomerulare nei suini neonatali utilizzando la misurazione transdermica della clearance della FITC-sinistrina. Inoltre, i nostri dati supportano l'utilità del sistema nella valutazione della funzionalità renale nelle impostazioni del danno renale acuto.

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Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health R01 DK120595 e R01 DK127625 assegnate al Dr. Adebiyi. Il contenuto di questo documento è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. Grazie al Dr. Daniel Schock-Kusch, direttore del sito presso MediBeacon GmbH, per i suoi consigli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

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Medicina Numero 187
Misurazione transdermica della velocità di filtrazione glomerulare nei suinetti ventilati meccanicamente
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Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,… More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

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