Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Transdermal mätning av glomerulär filtreringshastighet hos mekaniskt ventilerade grisar

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64413
* These authors contributed equally

Summary

Glomerulär filtreringshastighet (GFR) är den perfekta markören för bedömning av njurfunktionen. Standardmätmetoden med inulininjektion med seriell blod- och urinanalys är emellertid opraktisk. Denna artikel avgränsar en praktisk metod för att mäta GFR transdermalt hos grisar.

Abstract

Transdermal mätning av glomerulär filtreringshastighet (GFR) har använts för att utvärdera njurfunktionen hos medvetna djur. Denna teknik är väl etablerad hos gnagare för att studera akut njurskada och kronisk njursjukdom. GFR-mätning med transdermalt system har dock inte validerats hos svin, en art med ett liknande njursystem som människor. Därför undersökte vi effekten av sepsis på transdermal GFR hos bedövade och mekaniskt ventilerade neonatalgrisar. Polymikrobiell sepsis inducerades av cekal ligering och punktering (CLP). Det transdermala GFR-mätsystemet bestående av en miniatyriserad fluorescenssensor fästes på grisens rakade hud för att bestämma clearance av fluorescein-isotiocyanat (FITC) konjugerat sinistrin, ett intravenöst injicerat GFR-spårämne. Våra resultat visar att vid 12 timmar efter CLP ökade serumkreatinin med en minskning av GFR. Denna studie visar för första gången nyttan av den transdermala GFR-metoden för att bestämma njurfunktionen hos mekaniskt ventilerade, neonatala grisar.

Introduction

En praktisk och kvantitativ utvärdering av njurfunktionen är mätningen av glomerulär filtreringshastighet (GFR), som berättar hur väl njurarna filtrerar blod baserat på clearanceprincipen1. En tidigare metod för att mäta GFR innebär intravenös injektion av exogena föreningar såsom inulin eller sinistrin, genom att utföra seriella mätningar av plasma/urinnivåer för att detektera deras clearance 2,3. Denna metod är besvärlig och kräver seriell insamling av plasma- och urinprover4. Ett alternativ är mätning av endogena metaboliska slutprodukter såsom kreatinin. Detta är dock tidskrävande och ibland felaktigt, eftersom det inte bara filtreras av glomerulus utan också utsöndras av tubulerna 5,6. Dessutom påverkas kreatininnivån av kön, ålder, kost och muskelmassa 7,8,9.

Ett mer exakt, minimalt invasivt och allmänt använt mått på GFR är användningen av transdermala GFR-monitorer, som mäter GFR i realtid hos djur 4,10. Sinistrin, en mycket löslig och fritt filtrerad exogen njurmarkör, är märkt med fluorescein-isotiocyanat (FITC). Denna konjugerade förening injiceras intravenöst och njurfunktionen i realtid kan bedömas utan att samla in blod- och urinprover11. Användningen av transdermal GFR-mätning har validerats hos gnagare 12, hundar13 och katter14, men inte hos svin.

Svinarter delar flera anatomiska och fysiologiska egenskaper med människor, vilket gör dem till idealiska djur för att studera olika mänskliga sjukdomar15. Användningen av grisar i translationell biomedicinsk forskning har blivit alltmer populär och föredragen framför gnagarmodeller eftersom den efterliknar mänsklig fysiologi och patofysiologi16. Neonatala grisar är av intresse för att förstå mekanismerna för sjukdomar som är unika för pediatriska patienter17. Dessutom sätter de senaste framstegen inom transplantation av gris till människa en uppmaning att utöka de diagnostiska verktygen för prekliniska och kliniska prövningar 18,19,20,21. Detta papper ger för första gången en guide för användningen av transdermalanordningen vid mätning av GFR hos neonatala grisar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Förfarandena är skrivna enligt nationella standarder för vård och användning av försöksdjur och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Tennessee Health Science Center (UTHSC).

OBS: Smågrisar i experimentgruppen utsätts för cecal ligering och punktering, medan skengruppen endast genomgår öppning av buken utan cecal ligering eller punktering. Smågrisar i båda grupperna hålls under anestesi i 12 timmar efter proceduren för att ge tillräckligt med tid för sepsis och akut njurskada (AKI) att uppstå i experimentgruppen. Transdermal GFR-mätning kommer att följa vid 8 timmar efter proceduren i totalt 12 timmar.

1. Smågrisförsörjning och inhysning

  1. Identifiera en lokal svingård som kan ge neonatalgrisar i åldern 3-5 dagar. Planera leveransen tidigt i veckan för att slutföra experimentet innan några grisar är äldre än 7 dagar.
    OBS: Leverantören tillhandahöll tre till fem grisar på måndagar för detta experiment; på fredagen skulle grisarna ha genomgått experimentet. Att använda samma kön och nästan samma ålder är viktigt för att undvika förvirrande faktorer.
  2. När grisen anländer, se till att de har en individuell identifiering (t.ex. ett öronmärke och en post som innehåller vikt och ålder).
  3. Inhys smågrisarna på en djurvårdsenhet (LACU) under vård av en legitimerad veterinär. Djuren är inrymda som en grupp i en rymlig hage med ett massivt betonggolv som lätt tvättas med vatten för att upprätthålla god sanitet.
  4. Lägg till en möbel som en tung boll för att möjliggöra miljöberikning och stimulans.
  5. Se till att LACU ger optimala miljöförhållanden, inklusive följande nyckelelement: sanitet, näring, temperaturkontroll, ventilation och dag-natt-cykel genom att styra belysningen.
  6. Låt veterinären kontrollera smågrisen dagligen, inklusive viktmätning, för att informera utredaren om någon gris verkar sjuk, vilket kan kräva uteslutning från experimentet.
  7. Lämna grisarna i minst 1 dag för att acklimatisera sig till miljön, vilket hjälper till att minimera stressen.

2. Preoperativ förberedelse

  1. Förbered den kirurgiska stationen innan du påbörjar experimentet. Detta inkluderar en värmedyna, katetrar, en ventilator, ett endotrakealt rör, hepariniserad saltlösning och en påse med ringerlaktatvätska.
    OBS: Smågrisar har dålig termoregulatorisk kapacitans och är benägna att hypotermi som förändrar hemodynamiken22,23. Därför är det viktigt att ge tillräckligt med tid för värmedynan att värmas upp.
  2. Bered 10 mg/ml α-kloralos genom att blanda den med saltlösning vid 60 °C tills blandningen är klar. Överhett inte lösningen för att undvika kristallisering av medicinen vid kylning. Filtrera med ett sprutfilter (storlek 0,22 μm) innan det administreras till grisarna.
  3. Utarbeta narkosmedicin baserad på djurvikt-Ketamin: 20 mg / kg och Xylazin: 2,2 mg / kg. Använd α -kloralos (5 ml/kg) för att upprätthålla anestesi.
    OBS: α -kloralos används på grund av enkel administrering av IV jämfört med inhalerad
    anestetika, eftersom de senare kräver en bedövningsmaskin och ett lämpligt rensningssystem som ska levereras via ett endotrakealt rör.

3. Anestesi

  1. Utför induktion av anestesi i grispennan, en miljö som är bekant för grisar, för att undvika onödig stress.
  2. Plocka försiktigt smågrisen vid bakbenen och administrera Ketamin: 20 mg/kg och Xylazin: 2,2 mg/kg i bakbenet vid semimembranosus/semitendinosusmuskeln, med en 23 G 3/4 nål.
  3. Låt några minuter för medicinerna träda i kraft. Kontrollera om det finns tillräcklig anestesinivå genom att se till att djuret är tillräckligt avslappnat för att vara orörligt, med förlust av palpebral reflex och käkton för att möjliggöra enkel och säker transport till operationsstationen. Bedöm den palpebrala reflexen genom att röra vid det inre hörnet av ögat; frånvaro av blinkande indikerar adekvat anestesi.

4. Trakeostomi

OBS: Detta experiment är icke-överlevnad, så en trakeotomi utförs för att upprätta en luftväg för mekanisk ventilation. Trakeostomi är ett snabbt och enkelt förfarande, i motsats till endotrakeal intubation, vilket är utmanande hos smågrisar med tanke på deras huvud och övre luftvägsanatomi24,25. Dessutom rapporteras laryngospasm vanligen under intubation, vilket resulterar i en längre period av hypoxi och hyperkarbi som kan äventyra resultaten26.

  1. Placera grisen i dorsal recumbency. Identifiera cricothyroid brosk genom att palpera framträdandet av sköldkörtelbrosket som känns fast. Sterilisera området med povidon-jod och 70% etanol innan du applicerar ett sterilt draperi.
  2. Använd ett kirurgiskt blad, gör ett 2-3 cm ventralt mittlinjesnitt sämre än den kaudala änden av sköldkörtelbrosket.
  3. Använd en krökt mygghemostat, dissekera trubbigt de överliggande subkutana vävnaderna och musklerna (sternohyoideus och kutan coli) tills cricothyroidmembranet och de första trakealringarna visualiseras. När du dissekerar, var försiktig så att du inte skadar några blodkärl.
  4. Få en tydlig bild av cricothyroidmembranet och trakealringarna24, använd sedan ett par långa mixter rätvinkliga pincett för att höja strukturerna.
    1. Med en liten sax, gör ett litet snitt vid cricothyroidmembranet eller den första trakealringen. Förläng snittet horisontellt till ~ 0,5 cm för att passera ett 3,0 mm endotrakealt rör.
    2. Sätt i röret till 5 cm-märket. Se till att bröstet expanderar och andas ljud innan du säkrar röret.
  5. Passera naveltejp runt luftstrupen för att säkra den på plats. Ytterligare tejp används för att fästa röret på käkens botten.
  6. Slå på ventilatorn, anslut endotrakealröret och rulla de specifika vreden (t.ex. SIMV-vred, PEEP-vred etc.) för att välja följande baslinjeinställningar. Tryckkontrollläge: synkroniserad intermittent mekanisk ventilation (SIMV); topp inandningstryck (PIP) - 15; positivt slut-expiratoriskt tryck (PEEP) - 5; Ränta- 20; I-tid - 0,6. Efter den första blodgasanalysen, justera ventilatorinställningarna enligt blodgasresultaten, med målet att upprätthålla tillräcklig syresättning och ventilation.

5. Foderkärlskanullering

  1. Upprätta luftvägarna och ventilationen innan du byter uppmärksamhet till lårbenskärlen för venös åtkomst och invasiv blodtrycksövervakning. Lårbensartären identifieras genom att känna en puls vid spåret mellan sartorius- och gracilismusklerna, och venen kan hittas bara medial mot artären.
  2. Medan grisen ligger i ryggläge sterilisera ljumskområdet med povidonjod och etanol och applicera ett draperi av lämplig storlek.
  3. Använd ett kirurgiskt blad för att skapa ett 3-4 cm längsgående snitt, som börjar kranialt vid inguinalvecket och sträcker sig distalt längs lårbenskanalen.
  4. Applicera trubbig och skarp dissektion, med myggböjda pincett respektive sax för att dissekera ner till nivån på lårbenets neurovaskulära bunt. Bunten finns djupt i kroppen av gracillismuskeln27. Omkrets dissekera lårbensartären och venen under 2-3 cm för att möjliggöra cannulation. Ligate små sidogrenar om det behövs.
  5. Applicera en 3.0 silkeslips på både artären och venens proximala och distala ändar för att applicera dragkraft. Bind den distala silkesutsuturen på både venen och artären och ligera kärlen.
  6. Börja med lårbensvenen, behåll distal och proximal dragkraft på silkesbanden och använd sedan ett par mikrosaxar för att skapa en venotomi.
  7. Använd sedan en venplockkateterintroducerare för att öppna kärlet medan du sätter in en förmätt polyuretankateter med en inre diameter x ytterdiameter på 0,86 mm x 1,32 mm. När den väl har satts in, binda den proximala 3.0 silkessuturen för att fixera katetern. Spola katetern med 3 ml hepariniserad saltlösning (1 U/ml). Denna lösning kan göras genom att tillsätta 0,5 ml heparin till 50 ml normal saltlösning.
  8. Sätt in en invasiv blodtryckskateter med samma tillvägagångssätt ovan för att skapa en arteriotomi och passera katetern.
    OBS: Att upprätthålla distal och proximal dragkraft är viktigt för att minimera blodförlusten vid åtkomst till artären.
  9. När katetrarna är säkrade, täck platsen med saltlösningsindränkt gasväv, och vid behov kan huden sutureras med en 3,0 silkessutur för att förhindra infektion.

6. Underhåll av anestesi, vätska och blodgas

  1. Övervaka anestesidjupet under hela experimentet, med hjälp av käftton och palpebral reflex, och administrera α-kloralos, intravenöst, efter behov för att hålla djuret under djup anestesi. Använd en initial laddningsdos på 50 mg/kg och 20 mg/kg för ytterligare boluser.
  2. Infusera ringerlaktat med en hastighet av 4 ml/kg/h under hela experimentet som underhållsvätska. Till exempel, om grisens vikt är 3 kg, är vätskeinfusionshastigheten 12 ml / h.
  3. För analys av sänggas, dra ett arteriellt blodprov i en hepariniserad blodgasspruta och presentera provet för analysatormaskinen. Välj alternativet arteriell blodgas och vänta i ~ 2-3 s för att analysatorn ska presentera bloddragningsnålen.
    1. För försiktigt in nålen i änden av sprutan som innehåller blodprovet. Vänta tills analysatorn aspirerar det önskade provet och dra tillbaka sprutan. Låt maskinen analysera blodgasen och presentera resultaten.
    2. Baserat på resultaten, justera ventilatorn för att bibehålla pH mellan 7,35--7,45, partiellt tryck av koldioxid (PCO2) mellan 35-45 mmHg och partiellt tryck av syre (PaO2) mellan 80-150 mmHg. Inställningarna skiljer sig åt beroende på ventilatortyp, men innebär till stor del att öka eller minska andningsfrekvensen med lämpliga vred för att kompensera för hypoxi och / eller hyperkapni.
  4. Dra 3 ml blod i ett ljusgrönt rör (litiumheparin). Centrifugera provet vid 2000 xg i 15 minuter, bibehållet vid 4 °C för att extrahera plasma. När plasmat är färdigt kan det analyseras omedelbart för serumkreatininnivå med kemianalysatorn vid sängen eller förvaras vid -80 °C för senare analys.
  5. Övervaka temperaturen kontinuerligt med en rektal sondtermometer och justera värmedynans temperatur för att hålla gristemperaturen mellan 101 och 103 ° F.

7. Experimentgrupp; cecal ligering och perforering (CLP) 25,28,29

OBS: För smågrisar i experimentgruppen, utför CLP för att inducera polymikrobiell sepsis28 och övervaka djuret i 12 timmar efter operationen för att ge tillräckligt med tid för svår sepsis att uppstå. Transdermal GFR-inspelning börjar vid 8 timmar efter cecal ligering för att möjliggöra 4 timmars inspelning.

  1. Använd ett kirurgiskt blad för att skapa ett 5-6 cm vänster paramedian vertikalt snitt, eftersom cecum hos grisar ligger i vänster paralumbar fossa30. Dissekera ner bukväggskikten och undvik skada på de ytliga epigastriska kärlen.
  2. När peritonealskiktet är snittat, använd en retraktor för att förbättra tillgången till intrabdominala strukturer.
  3. Identifiera spiralkolon i övre vänstra kvadranten i buken. Spåra spiralkolon, kaudalt och dorsalt, för att lokalisera cecum. Ileum ses gå med i spiralkolon vid basen av cecum.
  4. Ligate cecum bara distal till ileocecal korsningen (Figur 1).
  5. Använd en 18 G nål, gör sju punkteringar i cecum och extrudera avföring i bukhinnan.
  6. Stäng buken i lager med en 3,0 silkessutur med antingen enkla avbrutna eller kontinuerliga stygn. En häftapparat kan också användas för att stänga hudskiktet om det finns tillgängligt.

8. Sham-grupp

  1. Följ stegen 7.2-7.4 som ovan. Efter att ha identifierat cecum, placera den tillbaka orörd och stäng bukväggen på samma sätt.
  2. Övervaka smågrisar i skengruppen i 12 timmar för att eliminera eventuell förvirrande bias som tillskrivs långvarig exponering för anestesi.

9. Transdermal GFR-enhetsinställning

  1. Efter 8 timmars cecal ligering, gör dig redo att initiera transdermal mätning av GFR.
  2. Använd MB-serviceprogramvaran version 3.0 för att justera samplingsfrekvensen på GFR-enheten. Anslut kortfattat den transdermala GFR-enheten till datorprogramvaran med USB-kontakten. Öppna programvaran, klicka på anslut och justera tidpunkten till 4000 ms. Klicka på skriv för att spara inställningarna.
    OBS: Detta ger upp till 6 timmar av den totala provtagningstiden. I grisarna avslutas transdermal GFR på 4 timmar. För experiment som kräver provtagning upp till 12 timmar väljer du alternativet 8000 ms.
  3. Fäst de dubbelsidiga limplåstren med ett tydligt fönster på enheten. Fäst enheten på ena sidan och se till att den ljusemitterande dioden ligger över det klara fönstret för att möjliggöra spårdetektering.
  4. Raka området ovanför den laterala bröstväggen. Fäst batteriet på enheten och fäst omedelbart limplåstret med enheten på plats och se till att den är väl säkrad (bild 2). Eftersom grisarna är djupt sövda kan tejp vara onödigt för att hålla enheten på plats.
    OBS: Enbart limplåstret räcker för att säkra. Men i försök där djuret skulle manipuleras, bli aktivt eller där anestesi kan störas kan det vara viktigt att applicera en tejp. Ett bandage kan också vara ett alternativt tillvägagångssätt31.
  5. En baslinjeregistrering på 3-5 minuter krävs innan FITC-sinistrin administreras.

10. FITC-sinistrin beredning och injektion

  1. Bered en blandning av FITC-sinistrin med saltlösning till en slutlig koncentration av 50 mg/ml. Den dos som administreras till smågrisen är 20 mg/kg. FITC-sinistrin levereras i pulverform.
    FITC-sinistrinet kan också administreras genom en perifer venkateter som sätts in i den aurikulära venen. Det är viktigt att uppnå en hög toppnivå genom att administrera FITC-sinistrin som en tryckbolus genom lårbenets venkateter.
  2. Fäst sprutan med medicin på ena sidan av en trevägs stoppkuk och en saltlösning på andra sidan stoppkranen. Tryck på FITC-sinistrinet och följ omedelbart med en 5 ml saltlösning bolus innan du stänger trevägsstoppkranen till grisvenen.

11. Transdermal GFR-inspelning

  1. Håll enheten ansluten till grisen i 4 timmar. Under denna tid, håll grisen under anestesi med intermittenta doser av α-kloralos i en koncentration av 20 mg / kg för att undvika rörelseartefakt.
  2. I slutet av 4 timmar, ta bort enheten och koppla omedelbart bort batteriet.

12. GFR-mätning

  1. Anslut den transdermala GFR-enheten till datorn med USB-kontakten som tillhandahålls av leverantören.
  2. Öppna läsprogramvaran för att hämta data från enheten. Spara rådata genom att klicka på sekvensen: anslut, läs, namnge om och spara. Enligt instruktionerna i manualen, bearbeta och utvärdera sparade data i analysprogramvaran.
  3. Kortfattat, öppna programvaran ver. 3.0 och importera data. Justera förskjutnings-, start- och slutpositionerna med hjälp av de automatiska markörerna. Ta bort artefakter om det behövs och klicka på passa. Detta ger en avläsning som visar FITC-sinistrin-clearance i minuter (t1/2). T1/2 används därefter för att beräkna tGFR32,33 enligt följande:
    Equation 1
    OBS: I samråd med tillverkaren är omvandlingsfaktorn som används för grisar 20 (vilket indikerar att 20% av kroppsvikten är extracellulärt utrymme), i motsats till 21,33 hos råttor (tGFR i ml/min) och 14 616,8 hos möss (tGFR i μL/min). Detta beror på att GFR mäts exakt som en funktion av extracellulär vätska34,35, som i sin tur är beroende av kroppsvikt 36.

13. Eutanasi hos smågrisar

  1. Samla 3 ml blod efter 12 h CLP för ytterligare biokemisk analys.
  2. Avliva smågrisen genom att administrera 0,2 ml/kg förblandad blandning av 20 % natriumpentobarbital och fenytoinnatrium intravenöst.
  3. Skörda rätt njure för histopatologisk studie innan du tar grisen till bårhuset.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det här avsnittet presenterar vi för första gången de representativa uppgifterna från användningen av transdermal GFR hos neonatala grisar. Vi använde en cecal ligerings- och punkteringsmodell som tidigare har visat sig minska njurfunktionen28. Följaktligen antog vi att det i våra CLP-grisar borde finnas en akut minskning av GFR som motsvarar AKI, och detta bör detekteras på den transdermala GFR-enheten som ökad clearancetid (t1/2), vilket validerar dess användning hos grisar. Sju hangrisar ingick, tre skengrisar och fyra sepsis. De två grupperna hade jämförbara vikter (figur 3A). Som förväntat28, 12 h sepsis ökade serumnivåerna av C-reaktivt protein (CRP), en bakteriemi och sepsismarkör (figur 3B). Representativa FITC-sinistrin-clearancekurvor hos skensvin vs septiska grisar visas (figur 4 A,B), där AKI visas genom att överlagra sken- och sepsiskurvorna (figur 4C). AKI visas av en ökad yta under kurvan för CLP-grisarna. Detta kan ses synligt när skenkurvan läggs på CLP-kurvan. Den genomsnittliga halveringstiden för FITC-sinistrin i bluff- och sepsisgrupperna var 114 respektive 537 minuter (figur 5A). Den genomsnittliga GFR i bluffgruppen var 5,1 ml/min/100 gm av kroppsvikten, medan den i sepsisgruppen var 1,06 ml/min/100 g av kroppsvikten (figur 5B). Ytterligare ett djur uteslöts när sonden förskjutits, vilket störde röjningskurvan och tiden. Medan 12 h serumkreatinin (en biomarkör för akut njurskada) inte förändrades i skengruppen, ökades det från ~ 0,6 till 1,08 mg / dL hos septiska grisar (Figur 6).

Figure 1
Figur 1: Cecum ligation kirurgi. (A) Cecum identifieras och förs till utsidan. B) Cecum ligeras vid basen med en silkeslips innan den punkteras med en nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Fastsättning av depotanordning på huden. (A) Huden rakad innan limplåstret fästs. (B) Depot GFR-anordning fäst vid limplåstret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat. A ) Vikten av de smågrisar som används i denna studie och B ) nivåerna av C-reaktivt protein (CRP) i mekaniskt ventilerade skensvin och septiska hangrisar (oparade t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Representativa FITC-sinistrin-clearancekurvor hos mekaniskt ventilerade sken- och septiska hangrisar. (A ) 12 h sham, (B) 12 h sepsis. Septiska grisar med nedsatt njurfunktion, vilket framgår av ett ökat område under kurvan. Svarta datapunkter representerar rådata, blå linjer som tre fack passar, gröna linjer 95 % konfidensintervall och röda linjer för filtrerade data. C) Överlagring av representativa kurvor för att återspegla graden av avvikelse från baslinjen hos septiska svin. Sepsiskurvan (röd) visade minimal clearance av FITC-sinistrin, vilket indikerar AKI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativa resultat. A ) FITC-sinistrinhalveringstid och B) GFR-ytor hos mekaniskt ventilerade skensvin och septiska hangrisar (oparade t-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Serumkreatinin hos mekaniskt ventilerade sken- och septiska hangrisar (Enkelriktat ANOVA-test). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta dokument beskriver praktiska steg för att bestämma njurfunktionen hos grisar med hjälp av de miniatyriserade transdermala GFR-monitorerna och FITC-sinistrin i en mekaniskt ventilerad, bedövad neonatal grismodell. Tidigare artiklar har etablerat experimentella transdermala GFR-protokoll hos gnagare11,12,14, men inga protokoll finns hos grisar.

Nyligen har det funnits en drivkraft att utforska alternativa djurmodeller för att lösa svårbehandlade sjukdomar och lindra bördan av njursjukdom hos människor. Tyvärr har många av dessa tillvägagångssätt haft translationella begränsningar på grund av storlek, anatomiska och fysiologiska skillnader. Gnagares njuranatomi och patofysiologi har stora skillnader jämfört med människor37. Eftersom de mänskliga och grissystemen delar liknande anatomiska och funktionella egenskaper kan svinmodellen vara en mer realistisk patofysiologisk modell av mänskliga sjukdomar38,39. Grisar används nu i stor utsträckning för att avgränsa patofysiologi och i läkemedelsutveckling. Med publiceringen av grisgenomet, tillsammans med framgångsrik transgen produktion av sjukdomsspecifika modeller, kommer svinmodellen att ta en mer kritisk roll i translationell forskning40,41.

Inulinclearance är fortfarande det mest accepterade sättet att bestämma GFR, men är opraktiskt i stora djurmodeller på grund av behovet av kontinuerlig infusion av inulin, kateterisering av blåsan och dess tidskrävande och besvärliga natur42. Serumkreatinin och blodureakväve (BUN) används ofta för att mäta njurfunktionen i prekliniska studier, men eftersom kreatinin utsöndras i tubulerna och urea alltmer reabsorberas vid uttorkning har dessa markörer visat sig vara dåliga för att uppskatta njurfunktionen 5,43. Avgörande var att tubulär kreatininsekretion visade sig orsaka överskattning av GFR när den användes som en markör för njurfunktion hos grisarna6. På grund av deras kroppsvana är det också mer troligt att en ökning av kreatinin ses i stora djurmodeller jämfört med gnagare. En studie på möss avslöjade en 1,5-faldig ökning av serumkreatinin 6 h efter cecal ligering44. Tidigare visade vi en ökning av kreatinin hos nyfödda grisar vid 6 timmar efter CLP28. I denna studie höll vi djuren under en längre tid, ~ 12 timmar efter cecal ligering för att ge tillräckligt med tid för signifikant AKI och en efterföljande ökning av kreatinin. Liksom i vår tidigare studie bekräftade vi induktionen av sepsis genom en ökning av serumnivåerna av CRP, en inflammations- och sepsismarkör. I denna studie, och som tidigare artiklar visar, är svårighetsgraden av sepsis efter CLP beroende av ligeringens längd och antalet punkteringar44.

Ett protokoll för att mäta GFR hos grisar med Iohexol har tidigare validerats hos grisar37, men däremot är det transdermala GFR-förfarandet en markant förbättring. Det är mindre besvärligt, undviker upprepad blod- eller urinprovtagning och erbjuder ett realtidsfönster till njurfunktionen och möjligheten till upprepade, seriella mätningar i samma djur45. Denna studie ger praktiska riktlinjer för transdermal GFR-bestämning hos grisar.

Som fastställts av andra grupper är de mest kritiska stegen den korrekta fixeringen av enheten till djuret och bolusinjektionen av FITC-sinistrin. Mätanordningen måste vara väl fastsatt på hudytan för att förhindra rörelseartefakter på spåret. Eftersom grisar är mindre håriga än gnagare krävs det inte att använda en hårborttagningskräm. En ren rakning med en klippare kan vara allt som behövs. Detta minimerar den depileringsassocierade ökningen av halveringstiden för FITC-sinistrin, vars mekanism är okänd12. För korrekt fixering krävs en dubbelsidig självhäftande lapp och tejp för att hålla enheten på plats. De optimala placeringsplatserna för enheten är den laterala bröstväggen och ventrala bukregionen. Dessa områden korrelerade med färre rörelseartefakter.

Vid injektion av FITC-sinistrin måste rätt och hela dosen injiceras i en vätskerörelse i venen. När injektionen avbryts och startas om skapar den flera "minitoppar" på frigångskurvan. Svansvenen används rutinmässigt för små gnagare, men den aurikulära öronvenen erbjuder en mer tillgänglig och framträdande väg i grisarna. En kanyl kan placeras i öronvenen för flera mätningar hos medvetna grisar. En viktig skillnad att notera i provtagningstiden är att, i motsats till gnagare (~ 1-2 h), varar grisar längre (~ 4 h), vilket approximerar den tid det tar för FITC-sinistrin att rensas från cirkulationen. Så vitt vi vet är detta det första papperet som beskriver transdermal GFR via FITC-sinistrinclearance hos grisar. Så inga citat finns för referens. Den mättid som användes ~4h kom fram till, via konsultationer med tillverkaren. Denna provtagningstid är jämförbar med en tidigare studie som validerar transdermal GFR hos andra däggdjur som inte är gnagare14.

Vid utvärdering av transdermal GFR hos grisar finns det några faktorer som måste beaktas. Enfacksmodeller är kända för att överskatta GFR betydligt46; Vi använder den kinetiska modellen med tre fack som är mer exakt och ger trevägskommunikation av den intravenöst injicerade markören mellan plasma, extracellulärt utrymme och djupare komponenter46. Dessa är också mekaniskt ventilerade grisar under mycket djup anestesi i ~ 12 timmar. Eftersom anestesi påverkar njurfunktionen47,48 kan det vara värt att ta hänsyn till det i procedurer som kräver lång sedering eller där experimentella manövrar kräver ytterligare anestesi tillsammans med GFR-övervakning. Slutligen, och kanske mest avgörande, har nyfödda grisar fortfarande utvecklande njursystem med omogna nefroner som fungerar vid en bråkdel av det vuxna djuret49. Därför visar de lägre GFR och njurfunktion50.

Som tidigare indikerats är transdermal GFR hos grisar inte ett absolut mått på sinistrinkoncentrationer i blodet. Det är bara en uppskattning av sönderfall i fluorescens över tid12. Användningen av en omvandlingsfaktor försöker mildra detta genom att uttrycka GFR i ml/min. Men eftersom omvandlingsfaktorn är beroende av extracellulärt utrymme, som i sin tur är beroende av kroppsvikt34,35,36, är det möjligt för stora variationer att existera om vikten inte kontrolleras för, eller om det extracellulära utrymmet inte är exakt definierat 51,52.

Dessutom verkar hudpigmentering påverka transdermal FITC-sinistrinclearance12,31. I våra studier fann vi att de pigmenterade grisarna visade minskad signal. I ett fall upptäckte vi inte signal hos en intensivt mörkfärgad gris. Eftersom bakgrundssignalen tenderar att minska hos pigmenterade djur12 fann vi dock att GFR-värdena i stort sett var jämförbara. En lösning på detta är att välja ljusare färgade områden i huden när du placerar enheten. Eftersom dessa grisar till stor del användes i en kirurgisk sjukdomsmodell, med flera former av belysning och värmekällor inblandade, måste man redogöra för potentiella rörelseartefakter på GFR-spåren via reflekterat ljus absorberat från omgivande hud12. En lösning på detta kan vara att minimera infrarött ljus under inspelning eller täckning av enheterna i folie.

Sammanfattningsvis erbjuder denna studie en enkel och pålitlig metod för att mäta glomerulär filtreringshastighet hos neonatala grisar med hjälp av transdermal mätning av FITC-sinistrinclearance. Dessutom stöder våra data systemets användbarhet vid utvärdering av njurfunktionen vid inställningar av akut njurskada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av National Institutes of Health-bidragen R01 DK120595 och R01 DK127625 som tilldelades Dr. Adebiyi. Innehållet i detta dokument är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Tack till Dr. Daniel Schock-Kusch, platschef på MediBeacon GmbH, för hans råd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha - Chloralose Sigma-Aldrich C0128-25G Used for maintanining anesthesia
Black braided silk  3-0 Surgical Specialties SP117 Silk tie for blood vessel traction and ligation
Centrifugation machine AccuSpin 8C Fischer Scientific 75-008-821 Used to extract plasma from whole blood sample
Endotracheal Tube 3.0 uncuffed Progressive Medical International 1109021995 Inserted through tracheostomy
FITC-Sinistrin 1.0 g MediBeacon Inc. FTCF S001 Store at room temp and protect from light
GEM Premier 3000 Blood gas analyzer Instrumentation Laboratory 5700 For bedside blood gas analysis
Heating Pad medium size 20 in x 29 in Adroit Medical Systems V029 Connects to heat therapy pump
HTP-Heat Therapy Pump Adroit Medical Systems HTP Allows you to set temperature as needed.
IDEXX Catalyst One IDEXX Laboratories 89-92525-00 Plasma creatinine analysis
Invasive blood pressure catheter 3.5Fr Millar SPR-524 Inserted in femoral artery
IV adminstration set with flow regulator True Care TCRTCBINF033G Used to connect IV fluid bag to vein catheter
Ketamine Covetrus 68317 Used for induction of Anesthesia
MediBeacon analysis software version 3.0 MediBeacon Inc. N/A Software program used for analysing data to obtain sinistrin clearance half life and curve
Millex-GV Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore Sigma SLGVR33RS Syringe filter for chloralose injection
Neonate/Infant Ventilator Sechrist Millennium 20409 Connected to air supply to provide ventilation through endotracheal tube
Phenobarbital Sodium + Phenytoin Sodium (Euthasol) Covetrus 72934 Used for euthanasia
Ringer Lactate 500 mL bag Baxter 2B2323Q Maintanence fluid infusion
Sterile Gloves Henry Schein 104-5920 Used by operator during surgery
Sterile Gown Halyard Health 95021 Used by operator during surgery
Steril Towel Medline 42131704 Used as drape to maintaine sterile field when operating
Suture 3-0 silk reverse cutting needle Ethicon NC1842168 Used for suturing abdominal wall layers
Transdermal Mini GFR Monitor MediBeacon Inc. TDM004 Battery and USB connector included in package
Transdermal monitor adhesive patch MediBeacon Inc. PTC-SM001 Doubl sided adhesive patch for GFR probe
Umbilical Tape 1/8 in x 20 yds Fisher Scientific NC9303017 To secure endotracheal tube
Venous Catheter size PE/5 Micro medical tubing BB31695 For femoral vein cannulation
Xylazine Covetrus 61035 Used for induction of anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pasala, S., Carmody, J. B. How to use... serum creatinine, cystatin C and GFR. Archives of Disease in Childhood Education and Practice Edition. 102 (1), 37-43 (2017).
  2. Smith, H. W. The Kidney: Structure and Function in Health and Disease. , Oxford University Press, USA. (1951).
  3. Gutman, Y., Gottschalk, C. W., Lassiter, W. E. Micropuncture study of inulin absorption in the rat kidney. Science. 147 (3659), 753-754 (1965).
  4. Ellery, S. J., Cai, X., Walker, D. D., Dickinson, H., Kett, M. M. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in small rodents: through the skin for the win. Nephrology. 20 (3), 117-123 (2015).
  5. Eisner, C., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney International. 77 (6), 519-526 (2010).
  6. Wendt, M., Waldmann, K. H., Bickhardt, K. Comparative studies of the clearance of inulin and creatinine in swine. Zentralblatt fur Veterinarmedizin. Reihe A. 37 (10), 752-759 (1990).
  7. Schwartz, G. J., Brion, L. P., Spitzer, A. The use of plasma creatinine concentration for estimating glomerular filtration rate in infants, children, and adolescents. Pediatric Clinics of North America. 34 (3), 571-590 (1987).
  8. Boer, D. P., de Rijke, Y. B., Hop, W. C., Cransberg, K., Dorresteijn, E. M. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatric Nephrology. 25 (10), 2107-2113 (2010).
  9. Guignard, J. P., Drukker, A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine. Pediatrics. 103 (4), 49 (1999).
  10. Friedemann, J., Schock-Kusch, D., Shulhevich, Y. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate in conscious laboratory animals: state of the art and future perspectives. Reporters, Markers, Dyes, Nanoparticles, and Molecular Probes for Biomedical Applications IX. 10079, 63-71 (2017).
  11. Herrera Pérez, Z., Weinfurter, S., Gretz, N. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rodents. Journal of Visualized Experiments. (109), e53767 (2016).
  12. Scarfe, L., et al. Transdermal measurement of glomerular filtration rate in mice. Journal of Visualized Experiments. (140), e58520 (2018).
  13. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  14. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  15. Almond, G. W. Research applications using pigs. The Veterinary Clinics of North America Food Animal Practice. 12 (3), 707-716 (1996).
  16. Bassols, A., et al. The pig as an animal model for human pathologies: A proteomics perspective. Proteomics Clinical Applications. 8 (9-10), 715-731 (2014).
  17. Ayuso, M., Irwin, R., Walsh, C., Van Cruchten, S., Van Ginneken, C. Low birth weight female piglets show altered intestinal development, gene expression, and epigenetic changes at key developmental loci. FASEB Journal. 35 (4), 21522 (2021).
  18. Pierson, R. N. Progress toward pig-to-human xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1871-1873 (2022).
  19. Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. The New England Journal of Medicine. 386 (20), 1889-1898 (2022).
  20. Reardon, S. First pig kidneys transplanted into people: what scientists think. Nature. 605 (7911), 597-598 (2022).
  21. Lu, T., Yang, B., Wang, R., Qin, C. Xenotransplantation: current status in preclinical research. Frontiers in Immunology. 10, 3060 (2019).
  22. Pattison, R. J., English, P. R., MacPherson, O., Roden, J. A., Birnie, M. Hypothermia and its attempted control in newborn piglets. Proceedings of the British Society of Animal Production. 1990, 81 (1972).
  23. Tucker, B. S., Petrovski, K. R., Kirkwood, R. N. Neonatal piglet temperature changes: effect of intraperitoneal warm saline injection. Animals. 12 (10), 1312 (2022).
  24. Alcalá Rueda, I., et al. A live porcine model for surgical training in tracheostomy, neck dissection, and total laryngectomy. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 278 (8), 3081-3090 (2021).
  25. Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging, and Experimental Techniques, Third Edition. , CRC Press/Taylor & Francis Group. Boca Raton. (2016).
  26. Steinbacher, R., von Ritgen, S., Moens, Y. P. Laryngeal perforation during a standard intubation procedure in a pig. Laboratory Animals. 46 (3), 261-263 (2012).
  27. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Göttingen minipig: intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. Journal of Visualized Experiments. (52), e2652 (2011).
  28. Soni, H., Adebiyi, A. Early septic insult in neonatal pigs increases serum and urinary soluble Fas ligand and decreases kidney function without inducing significant renal apoptosis. Renal Failure. 39 (1), 83-91 (2017).
  29. Bütz, D. E., Morello, S. L., Sand, J., Holland, G. N., Cook, M. E. The expired breath carbon delta value is a marker for the onset of sepsis in a swine model. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 29 (4), 606-613 (2014).
  30. Turner, A. S., McIlwraith, C. W. Techniques in Large Animal Surgery. , Lea & Febiger. (1989).
  31. Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9 (11), 111734 (2014).
  32. Mondritzki, T., et al. Transcutaneous glomerular filtration rate measurement in a canine animal model of chronic kidney disease. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 90, 7-12 (2018).
  33. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrology Dialysis Transplantation. 24 (10), 2997-3001 (2009).
  34. Peters, A. M. Expressing glomerular filtration rate in terms of extracellular fluid volume. Nephrology Dialysis Transplantation. 7 (3), 205-210 (1992).
  35. Groth, S., Christensen, A. B., Nielsen, H. CdTe-detector registration of 99mTc-DTPA clearance. European Journal of Nuclear Medicine. 8 (6), 242-244 (1983).
  36. Guyton, A. C., Hall, J. E. The body fluid compartments: extracellular and intracellular fluids; interstitial fluid and edema. Textbook of Medical Physiology. 9, 306-308 (2000).
  37. Luis-Lima, S., et al. Iohexol plasma clearance simplified by dried blood spot testing. Nephrology, Dialysis, Transplantation. 33 (9), 1597-1603 (2018).
  38. Kobayashi, E., Hishikawa, S., Teratani, T., Lefor, A. T. The pig as a model for translational research: overview of porcine animal models at Jichi Medical University. Transplantation Research. 1 (1), 8 (2012).
  39. Swindle, M. M., et al. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  40. Ibrahim, Z., et al. Selected physiologic compatibilities and incompatibilities between human and porcine organ systems. Xenotransplantation. 13 (6), 488-499 (2006).
  41. Judge, E. P., et al. Anatomy and bronchoscopy of the porcine lung. A model for translational respiratory medicine. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (3), 334-343 (2014).
  42. Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (11), 2305-2313 (2009).
  43. Bankir, L., Yang, B. New insights into urea and glucose handling by the kidney, and the urine concentrating mechanism. Kidney International. 81 (12), 1179-1198 (2012).
  44. Ruiz, S., et al. Sepsis modeling in mice: ligation length is a major severity factor in cecal ligation and puncture. Intensive Care Medicine Experimental. 4 (1), 22 (2016).
  45. Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney International. 79 (11), 1254-1258 (2011).
  46. Frennby, B., Sterner, G. Contrast media as markers of GFR. European Radiology. 12 (2), 475484 (2002).
  47. Burchardi, H., Kaczmarczyk, G. The effect of anaesthesia on renal function. European Journal of Anaesthesiology. 11 (3), 163-168 (1994).
  48. Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. American Journal of Veterinary Research. 68 (8), 807811 (2007).
  49. Arant, B. S. Functional immaturity of the newborn kidney-paradox or prostaglandin. Homeostasis, Nephrotoxicity, and Renal Anomalies in the Newborn. , Springer. Boston, MA. 271-278 (1986).
  50. Gattineni, J., Baum, M. Developmental changes in renal tubular transport-an overview. Pediatric Nephrology. 30 (12), 2085-2098 (2015).
  51. Gu, X., Yang, B. Methods for assessment of the glomerular filtration rate in laboratory animals. Kidney Diseases. , 1-11 (2022).
  52. Mullins, T. P., Tan, W. S., Carter, D. A., Gallo, L. A. Validation of non-invasive transcutaneous measurement for glomerular filtration rate in lean and obese C57BL/6J mice. Nephrology. 25 (7), 575-581 (2020).

Tags

Medicin utgåva 187
Transdermal mätning av glomerulär filtreringshastighet hos mekaniskt ventilerade grisar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fanous, M. S., Afolabi, J. M.,More

Fanous, M. S., Afolabi, J. M., Michael, O. S., Falayi, O. O., Iwhiwhu, S. A., Adebiyi, A. Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mechanically Ventilated Piglets. J. Vis. Exp. (187), e64413, doi:10.3791/64413 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter