طريقة لدراسة سمية α-سينوكلين وتجميعها باستخدام نموذج خميرة متوافق مع البشر
Summary
مطلوب نموذج فسيولوجي في الجسم الحي من α-synuclein لدراسة وفهم التسبب في مرض باركنسون. وصفنا طريقة لمراقبة السمية الخلوية والتكوين الكلي ل α-synuclein باستخدام نموذج الخميرة المتوافق مع البشر.
Abstract
مرض باركنسون هو ثاني أكثر الاضطرابات التنكسية العصبية شيوعا ويتميز بموت الخلايا التدريجي الناجم عن تكوين أجسام ليوي التي تحتوي على α سينوكلين غير مطوية ومجمعة. α-synuclein هو بروتين وفير قبل المشبكي ينظم الاتجار بالحويصلة المشبكية ، لكن تراكم شوائب البروتين يؤدي إلى سمية عصبية. كشفت الدراسات الحديثة أن العوامل الوراثية المختلفة ، بما في ذلك المرافقين البكتيريين ، يمكن أن تقلل من تكوين مجاميع α-synuclein في المختبر. ومع ذلك ، من المهم أيضا مراقبة التأثير المضاد للتجميع في الخلية لتطبيق هذا كعلاج محتمل للمرضى. سيكون من المثالي استخدام الخلايا العصبية ، ولكن يصعب التعامل مع هذه الخلايا وتستغرق وقتا طويلا لإظهار النمط الظاهري المضاد للتجميع. لذلك ، يلزم وجود أداة سريعة وفعالة في الجسم الحي لإجراء مزيد من التقييم لنشاط مكافحة التجميع في الجسم الحي. تم استخدام الطريقة الموصوفة هنا لمراقبة وتحليل النمط الظاهري المضاد للتجميع في الخميرة البشرية Saccharomyces cerevisiae ، والتي عبرت عن α synuclein البشري. يوضح هذا البروتوكول في الجسم الحي الأدوات التي يمكن استخدامها لرصد السمية الخلوية التي يسببها α سينوكلين ، وكذلك تكوين مجاميع α سينوكلين في الخلايا.
Introduction
مرض باركنسون (PD) هو مشكلة خطيرة للمجتمعات الشيخوخة في جميع أنحاء العالم. يرتبط تجميع α-synuclein ارتباطا وثيقا بمرض باركنسون ، وتستخدم مجاميع البروتين من α-synuclein على نطاق واسع كعلامة حيوية جزيئية لتشخيص المرض1. α-synuclein هو بروتين حمضي صغير (140 من الأحماض الأمينية في الطول) مع ثلاثة مجالات ، وهي N-terminal ربط الدهون α-helix ، والمجال المركزي المرتبط بالأميلويد (NAC) ، والذيل الحمضيC-terminal 2. يمكن أن يحدث اختلال α-synuclein تلقائيا ويؤدي في النهاية إلى تكوين مجاميع أميلويد تسمى أجسام ليوي3. قد يساهم α-synuclein في التسبب في مرض باركنسون بعدة طرق. بشكل عام ، يعتقد أن أشكالها قليلة القسيمات غير الطبيعية القابلة للذوبان والتي تسمى protofibrils هي أنواع سامة تسبب موت الخلايا العصبية من خلال التأثير على أهداف خلوية مختلفة ، بما في ذلك الوظيفة المشبكية3.
يجب أن تكون النماذج البيولوجية المستخدمة لدراسة الأمراض التنكسية العصبية ذات صلة بالبشر فيما يتعلق بالجينوم والبيولوجيا الخلوية. أفضل النماذج هي خطوط الخلايا العصبية البشرية. ومع ذلك ، ترتبط خطوط الخلايا هذه بالعديد من المشكلات الفنية ، مثل الصعوبات في الحفاظ على الثقافات ، وانخفاض كفاءة النقل ، وارتفاع النفقات4. لهذه الأسباب ، هناك حاجة إلى أداة سهلة وموثوقة لتسريع التقدم في هذا المجال البحثي. الأهم من ذلك ، يجب أن تكون الأداة سهلة الاستخدام لتحليل البيانات التي تم جمعها. من هذه المنظورات ، تم استخدام كائنات نموذجية مختلفة على نطاق واسع ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة ، و Caenorhabditis elegans ، و Danio rerio ، والخميرة ، والقوارض5. من بينها ، الخميرة هي أفضل كائن نموذجي لأن التلاعب الجيني سهل ، وهو أرخص من الكائنات الحية النموذجية الأخرى. الأهم من ذلك ، أن الخميرة لها أوجه تشابه عالية مع الخلايا البشرية ، مثل 60٪ تماثل تسلسلي مع تقويم العظام البشري و 25٪ تماثل وثيق مع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية6 ، كما أنها تشترك في بيولوجيا الخلية حقيقية النواة الأساسية. تحتوي الخميرة على العديد من البروتينات ذات التسلسلات المتشابهة والوظائف المماثلة لتلك الموجودة في الخلايا البشرية7. في الواقع ، تم استخدام الخميرة التي تعبر عن الجينات البشرية على نطاق واسع كنظام نموذجي لتوضيح العمليات الخلوية8. تسمى سلالة الخميرة هذه الخميرة المؤنسنة وهي أداة مفيدة لاستكشاف وظيفة الجينات البشرية9. الخميرة المتوافقة مع البشر لها ميزة لدراسة التفاعلات الجينية لأن التلاعب الجيني راسخ في الخميرة.
في هذه الدراسة ، استخدمنا الخميرة Saccharomyces cerevisiae ككائن نموذجي لدراسة التسبب في مرض باركنسون ، خاصة للتحقيق في تكوين إجمالي α-synuclein والسمية الخلوية10. للتعبير عن α-synuclein في الخميرة الناشئة ، تم استخدام سلالة W303a للتحول مع ترميز البلازميدات للمتغيرات البرية والعائلية المرتبطة ب PD من α-synuclein. نظرا لأن سلالة W303a لها طفرة ذاتية التغذية على URA3 ، فهي قابلة للتطبيق لاختيار الخلايا التي تحتوي على البلازميدات مع URA3. يتم تنظيم التعبير عن α-synuclein المشفر في البلازميد تحت مروج GAL1. وبالتالي ، يمكن التحكم في مستوى التعبير عن α-synuclein. بالإضافة إلى ذلك ، فإن اندماج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في المنطقة الطرفية C من α-synuclein يسمح بمراقبة تكوين بؤر α-synuclein. لفهم خصائص المتغيرات العائلية المرتبطة ب PD ل α-synuclein ، قمنا أيضا بالتعبير عن هذه المتغيرات في الخميرة وفحصنا آثارها الخلوية. هذا النظام هو أداة مباشرة لفحص المركبات أو الجينات التي تظهر أدوارا وقائية ضد السمية الخلوية ل α-synuclein.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظرا لتعقيد الأنظمة الخلوية المختلفة في البشر ، من المفيد استخدام الخميرة كنموذج لدراسة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. على الرغم من أنه يكاد يكون من المستحيل التحقيق في التفاعلات الخلوية المعقدة للدماغ البشري باستخدام الخميرة ، من منظور خلية واحدة ، فإن خلايا الخميرة لديها مستوى عال …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيمس باردويل وتياغو ف. أوتيرو على تفضلهما بمشاركة البلازميدات التي تحتوي على α-synuclein. تلقى Changhan Lee تمويلا من المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا (NRF) بتمويل من الحكومة الكورية (MSIT) (منحة 2021R1C1C1011690) ، وبرنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال NRF الممول من وزارة التعليم (منحة 2021R1A6A1A10044950) ، وصندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس الجديد بجامعة Ajou.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
