Een methode om α-synucleïnetoxiciteit en -aggregatie te bestuderen met behulp van een gehumaniseerd gistmodel
Summary
Een in vivo fysiologisch model van α-synucleïne is nodig om de pathogenese van de ziekte van Parkinson te bestuderen en te begrijpen. We beschrijven een methode om de cytotoxiciteit en geaggregeerde vorming van α-synucleïne te monitoren met behulp van een gehumaniseerd gistmodel.
Abstract
De ziekte van Parkinson is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening en wordt gekenmerkt door progressieve celdood veroorzaakt door de vorming van Lewy-lichamen die verkeerd gevouwen en geaggregeerde α-synucleïne bevatten. α-synucleïne is een overvloedig presynaptisch eiwit dat de handel in synaptische blaasjes reguleert, maar de accumulatie van de eiwithoudende insluitsels resulteert in neurotoxiciteit. Recente studies hebben aangetoond dat verschillende genetische factoren, waaronder bacteriële chaperonnes, de vorming van α-synucleïneaggregaten in vitro kunnen verminderen. Het is echter ook belangrijk om het anti-aggregatie-effect in de cel te monitoren om dit toe te passen als een potentiële behandeling voor de patiënten. Het zou ideaal zijn om neuronale cellen te gebruiken, maar deze cellen zijn moeilijk te hanteren en het duurt lang om het anti-aggregatiefenotype te vertonen. Daarom is een snel en effectief in vivo instrument nodig voor de verdere evaluatie van de in vivo anti-aggregatieactiviteit. De hier beschreven methode werd gebruikt om het anti-aggregatiefenotype in de gehumaniseerde gist Saccharomyces cerevisiae, die menselijke α-synucleïne tot expressie bracht, te controleren en te analyseren. Dit protocol demonstreert in vivo hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt voor het monitoren van α-synucleïne-geïnduceerde cellulaire toxiciteit, evenals de vorming van α-synucleïneaggregaten in cellen.
Introduction
De ziekte van Parkinson (PD) is een ernstig probleem voor vergrijzende samenlevingen wereldwijd. De aggregatie van α-synucleïne is nauw verbonden met PD en eiwitaggregaten van α-synucleïne worden veel gebruikt als moleculaire biomarker voor het diagnosticeren van de ziekte1. α-synucleïne is een klein zuur eiwit (140 aminozuren lang) met drie domeinen, namelijk de N-terminale lipide-bindende α-helix, het amyloïde-bindende centrale domein (NAC) en de C-terminale zure staart2. Het verkeerd vouwen van α-synucleïne kan spontaan optreden en leidt uiteindelijk tot de vorming van amyloïde aggregaten genaamd Lewy bodies3. α-synucleïne kan op verschillende manieren bijdragen aan de pathogenese van PD. Over het algemeen wordt gedacht dat de abnormale, oplosbare oligomere vormen die protofibrillen worden genoemd, toxische soorten zijn die neuronale celdood veroorzaken door verschillende cellulaire doelen te beïnvloeden, waaronder synaptische functie3.
De biologische modellen die worden gebruikt om neurodegeneratieve ziekten te bestuderen, moeten relevant zijn voor mensen met betrekking tot hun genoom en cellulaire biologie. De beste modellen zouden menselijke neuronale cellijnen zijn. Deze cellijnen worden echter geassocieerd met verschillende technische problemen, zoals problemen bij het onderhoud van culturen, lage efficiëntie van transfectie en hoge kosten4. Om deze redenen is een eenvoudig en betrouwbaar instrument nodig om de vooruitgang op dit onderzoeksgebied te versnellen. Belangrijk is dat de tool gemakkelijk te gebruiken moet zijn voor het analyseren van de verzamelde gegevens. Vanuit deze perspectieven zijn verschillende modelorganismen op grote schaal gebruikt, waaronder Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gist en knaagdieren5. Onder hen is gist het beste modelorganisme omdat genetische manipulatie gemakkelijk is en goedkoper is dan de andere modelorganismen. Het belangrijkste is dat gist hoge overeenkomsten heeft met menselijke cellen, zoals 60% sequentie homologie aan menselijke orthologen en 25% nauwe homologie met menselijke ziekte-gerelateerde genen6, en ze delen ook fundamentele eukaryote celbiologie. Gist bevat veel eiwitten met vergelijkbare sequenties en analoge functies als die in menselijke cellen7. Inderdaad, gist die menselijke genen tot expressie brengt, is op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om cellulaire processen op tehelderen 8. Deze giststam wordt gehumaniseerde gist genoemd en is een nuttig hulpmiddel voor het onderzoeken van de functie van menselijke genen9. Gehumaniseerde gist heeft verdienste voor het bestuderen van genetische interacties omdat genetische manipulatie goed ingeburgerd is in gist.
In deze studie gebruikten we de gist Saccharomyces cerevisiae als modelorganisme om de pathogenese van PD te bestuderen, met name voor het onderzoeken van α-synucleïne aggregaatvorming en cytotoxiciteit10. Voor de expressie van α-synucleïne in de ontluikende gist, werd de W303a-stam gebruikt voor transformatie met plasmiden die coderen voor de wild-type en familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne. Aangezien de W303a-stam een auxotrofe mutatie op URA3 heeft, is deze van toepassing op de selectie van cellen die plasmiden met URA3 bevatten. De expressie van α-synucleïne gecodeerd in een plasmide wordt gereguleerd onder de GAL1 promotor. Zo kan het expressieniveau van α-synucleïne worden gecontroleerd. Bovendien maakt de fusie van groen fluorescerend eiwit (GFP) in het C-terminale gebied van α-synucleïne de monitoring van α-synucleïne foci-vorming mogelijk. Om de kenmerken van de familiale PD-geassocieerde varianten van α-synucleïne te begrijpen, drukten we deze varianten ook uit in gist en onderzochten we hun cellulaire effecten. Dit systeem is een eenvoudig hulpmiddel voor het screenen van verbindingen of genen die beschermende rollen vertonen tegen de cytotoxiciteit van α-synucleïne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezien de complexiteit van verschillende cellulaire systemen bij mensen, is het voordelig om gist te gebruiken als een model voor het bestuderen van menselijke neurodegeneratieve ziekten. Hoewel het bijna onmogelijk is om de complexe cellulaire interacties van het menselijk brein met behulp van gist te onderzoeken, hebben gistcellen vanuit een eencellig perspectief een hoge mate van gelijkenis met menselijke cellen in termen van de genomische sequentie homologie en fundamentele eukaryote cellulaire processen<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken James Bardwell en Tiago F. Outeiro voor het delen van de plasmiden die α-synucleïne bevatten. Changhan Lee ontving financiering van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (subsidie 2021R1C1C1011690), het Basic Science Research Program via de NRF gefinancierd door het ministerie van Onderwijs (subsidie 2021R1A6A1A1A10044950) en het nieuwe facultaire onderzoeksfonds van Ajou University.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
