Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato
Summary
È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.
Abstract
La malattia di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più comune ed è caratterizzata da una progressiva morte cellulare causata dalla formazione di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina mal ripiegata e aggregata. α-sinucleina è un’abbondante proteina presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, ma l’accumulo delle sue inclusioni proteiche provoca neurotossicità. Studi recenti hanno rivelato che vari fattori genetici, tra cui gli chaperoni batterici, potrebbero ridurre la formazione di aggregati di α-sinucleina in vitro. Tuttavia, è anche importante monitorare l’effetto anti-aggregazione nella cellula per applicarlo come potenziale trattamento per i pazienti. Sarebbe ideale utilizzare cellule neuronali, ma queste cellule sono difficili da gestire e richiedono molto tempo per mostrare il fenotipo anti-aggregazione. Pertanto, è necessario uno strumento in vivo rapido ed efficace per l’ulteriore valutazione dell’attività antiaggregazione in vivo. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per monitorare e analizzare il fenotipo anti-aggregazione nel lievito umanizzato Saccharomyces cerevisiae, che esprimeva α-sinucleina umana. Questo protocollo dimostra strumenti in vivo che potrebbero essere utilizzati per monitorare la tossicità cellulare indotta da α-sinucleina, nonché la formazione di aggregati di α-sinucleina nelle cellule.
Introduction
La malattia di Parkinson (PD) è un problema serio per le società che invecchiano in tutto il mondo. L’aggregazione della α-sinucleina è strettamente associata alla malattia di Parkinson e gli aggregati proteici della α-sinucleina sono ampiamente utilizzati come biomarcatore molecolare per diagnosticare la malattia1. α-sinucleina è una piccola proteina acida (140 amminoacidi di lunghezza) con tre domini, vale a dire la α-elica legante i lipidi N-terminale, il dominio centrale legante l’amiloide (NAC) e la coda acida C-terminale2. Il misfolding della α-sinucleina può verificarsi spontaneamente e alla fine porta alla formazione di aggregati amiloidi chiamati corpi di Lewy3. α-sinucleina può contribuire alla patogenesi della malattia di Parkinson in diversi modi. In generale, si pensa che le sue forme oligomeriche anormali e solubili chiamate protofibrille siano specie tossiche che causano la morte delle cellule neuronali colpendo vari bersagli cellulari, inclusa la funzione sinaptica3.
I modelli biologici utilizzati per studiare le malattie neurodegenerative devono essere rilevanti per l’uomo per quanto riguarda il loro genoma e la biologia cellulare. I migliori modelli sarebbero linee cellulari neuronali umane. Tuttavia, queste linee cellulari sono associate a diversi problemi tecnici, come difficoltà nel mantenimento delle colture, bassa efficienza della trasfezione e spese elevate4. Per questi motivi, è necessario uno strumento semplice e affidabile per accelerare i progressi in questo settore di ricerca. È importante sottolineare che lo strumento dovrebbe essere facile da usare per analizzare i dati raccolti. Da questi punti di vista, vari organismi modello sono stati ampiamente utilizzati, tra cui Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, lievito e roditori5. Tra questi, il lievito è il miglior organismo modello perché la manipolazione genetica è facile ed è più economico degli altri organismi modello. Ancora più importante, il lievito ha elevate somiglianze con le cellule umane, come il 60% di omologia di sequenza con ortologhi umani e il 25% di stretta omologia con geni correlati alla malattia umana6, e condividono anche la biologia cellulare eucariotica fondamentale. Il lievito contiene molte proteine con sequenze simili e funzioni analoghe a quelle delle cellule umane7. In effetti, il lievito che esprime geni umani è stato ampiamente utilizzato come sistema modello per chiarire i processi cellulari8. Questo ceppo di lievito è chiamato lievito umanizzato ed è uno strumento utile per esplorare la funzione dei geni umani9. Il lievito umanizzato ha il merito di studiare le interazioni genetiche perché la manipolazione genetica è ben consolidata nel lievito.
In questo studio, abbiamo utilizzato il lievito Saccharomyces cerevisiae come organismo modello per studiare la patogenesi della malattia di Parkinson, in particolare per studiare la formazione di aggregati di α-sinucleina e la citotossicità10. Per l’espressione della α-sinucleina nel lievito in erba, il ceppo W303a è stato utilizzato per la trasformazione con plasmidi che codificano per le varianti wild-type e familiari associate al PD della α-sinucleina. Poiché il ceppo W303a ha una mutazione auxotrofica su URA3, è applicabile per la selezione di cellule contenenti plasmidi con URA3. L’espressione della α-sinucleina codificata in un plasmide è regolata dal promotore GAL1. Pertanto, il livello di espressione della α-sinucleina può essere controllato. Inoltre, la fusione della proteina fluorescente verde (GFP) nella regione C-terminale della α-sinucleina consente il monitoraggio della formazione di focolai di α-sinucleina. Per comprendere le caratteristiche delle varianti familiari associate alla PD della α-sinucleina, abbiamo anche espresso queste varianti nel lievito e esaminato i loro effetti cellulari. Questo sistema è uno strumento semplice per lo screening di composti o geni che mostrano ruoli protettivi contro la citotossicità della α-sinucleina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Data la complessità dei vari sistemi cellulari nell’uomo, è vantaggioso utilizzare il lievito come modello per lo studio delle malattie neurodegenerative umane. Sebbene sia quasi impossibile studiare le complesse interazioni cellulari del cervello umano usando il lievito, da una prospettiva monocellulare, le cellule di lievito hanno un alto livello di somiglianza con le cellule umane in termini di omologia della sequenza genomica e processi cellulari eucariotici fondamentali 8,13<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo James Bardwell e Tiago F. Outeiro per aver gentilmente condiviso i plasmidi contenenti α-sinucleina. Changhan Lee ha ricevuto finanziamenti dalla National Research Foundation of Korea (NRF) finanziati dal governo coreano (MSIT) (sovvenzione 2021R1C1C1011690), dal Basic Science Research Program attraverso la NRF finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione (sovvenzione 2021R1A6A1A10044950) e dal nuovo fondo di ricerca della facoltà dell’Università di Ajou.
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker’s yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. . Methods in Yeast Genetics and Genomics. , (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson’s disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson’s disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson’s disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson’s Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson’s disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
