ヒト化酵母モデルを用いたα-シヌクレインの毒性と凝集の研究法
Summary
パーキンソン病の病態を研究・理解するためには、α-シヌクレインの in vivo 生理学的モデルが必要です。ヒト化酵母モデルを用いてα-シヌクレインの細胞毒性と凝集体形成をモニターする方法を記載する。
Abstract
パーキンソン病は2番目に多い神経変性疾患であり、誤って折りたたまれ凝集したα-シヌクレインを含むレビー小体の形成によって引き起こされる進行性の細胞死を特徴としています。α-シヌクレインは、シナプス小胞輸送を調節する豊富なシナプス前タンパク質ですが、そのタンパク質性封入体の蓄積は神経毒性をもたらします。最近の研究では、細菌のシャペロンを含むさまざまな遺伝的要因が、in vitroでのα-シヌクレイン凝集体の形成を減少させる可能性があることが明らかになりました。しかし、これを患者の潜在的な治療法として適用するために、細胞内の抗凝集効果を監視することも重要です。神経細胞を用いるのが理想的ですが、これらの細胞は取り扱いが難しく、抗凝集表現型を示すまでに長い時間がかかります。したがって、in vivo抗凝集活性のさらなる評価のために、迅速かつ効果的なin vivoツールが必要とされる。ここで説明した方法は、ヒトα-シヌクレインを発現するヒト化酵母サッカロミセス・セレビシエにおける抗凝集表現型をモニターおよび分析するために使用されました。このプロトコルは、α-シヌクレイン誘発性細胞毒性、および細胞内でのα-シヌクレイン凝集体の形成をモニタリングするために使用できるin vivoツールを実証します。
Introduction
パーキンソン病(PD)は、世界中の高齢化社会にとって深刻な問題です。α-シヌクレインの凝集はPDと密接に関連しており、α-シヌクレインのタンパク質凝集体は疾患を診断するための分子バイオマーカーとして広く用いられている1。α-シヌクレインは、N末端脂質結合αヘリックス、アミロイド結合中心ドメイン(NAC)、C末端酸性テール2の3つのドメインを持つ小さな酸性タンパク質(長さ140アミノ酸)です。α-シヌクレインのミスフォールディングは自発的に起こり、最終的にはレビー小体3と呼ばれるアミロイド凝集体の形成につながります。α-シヌクレインは、いくつかの方法でPDの病因に寄与する可能性があります。一般に、プロトフィブリルと呼ばれるその異常で可溶性オリゴマー型は、シナプス機能を含むさまざまな細胞標的に影響を与えることによって神経細胞死を引き起こす有毒種であると考えられています3。
神経変性疾患の研究に使用される生物学的モデルは、そのゲノムおよび細胞生物学に関してヒトに関連している必要があります。最良のモデルはヒト神経細胞株でしょう。しかし、これらの細胞株は、培養の維持の難しさ、トランスフェクションの効率の低さ、高額な費用など、いくつかの技術的問題と関連しています4。これらの理由から、この研究分野の進歩を加速するには、簡単で信頼性の高いツールが必要です。重要なのは、収集されたデータの分析に使いやすいツールであることです。これらの観点から、 ショウジョウバエ、 カエノラブディティスエレガンス、 ダニオレリオ、酵母、げっ歯類など、さまざまなモデル生物が広く使用されています5。その中でも酵母は遺伝子操作が容易で、他のモデル生物よりも安価であるため、最良のモデル生物です。最も重要なことは、酵母はヒトオルソログと60%の配列相同性、ヒト疾患関連遺伝子と25%の密接な相同性など、ヒト細胞と高い類似性を持ち6、基本的な真核細胞生物学も共有していることです。酵母には、ヒト細胞と同様の配列と類似の機能を持つ多くのタンパク質が含まれています7。実際、ヒト遺伝子を発現する酵母は、細胞プロセスを解明するためのモデル系として広く用いられている8。この酵母株はヒト化酵母と呼ばれ、ヒト遺伝子の機能を探索するための有用なツールです9。ヒト化酵母は、遺伝子操作が酵母で十分に確立されているため、遺伝的相互作用を研究するためのメリットがあります。
本研究では、酵母サッカロマイセス・セレビシエをモデル生物としてPDの病態を研究し、特にα-シヌクレイン凝集体形成と細胞毒性を調べました10。出芽酵母におけるα-シヌクレインの発現のために、W303a株を、α-シヌクレインの野生型および家族性PD関連変異体をコードするプラスミドによる形質転換に使用した。W303a株はURA3に栄養要求性変異を有するため、URA3を有するプラスミドを含む細胞の選択に適用可能である。プラスミドにコードされるα-シヌクレインの発現は、GAL1プロモーターの下で調節されています。これにより、α-シヌクレインの発現量を制御することができる。さらに、α-シヌクレインのC末端領域における緑色蛍光タンパク質(GFP)の融合により、α-シヌクレイン病巣形成のモニタリングが可能になります。α-シヌクレインの家族性PD関連変異体の特徴を理解するために、酵母でもこれらの変異体を発現させ、細胞効果を調べました。このシステムは、α-シヌクレインの細胞毒性に対する保護的役割を示す化合物または遺伝子をスクリーニングするための簡単なツールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトにおける様々な細胞系の複雑さを考えると、ヒトの神経変性疾患を研究するためのモデルとして酵母を使用することは有利である。酵母を用いてヒトの脳の複雑な細胞間相互作用を調べることはほぼ不可能ですが、単一細胞の観点からは、酵母細胞はゲノム配列の相同性および基本的な真核細胞プロセスの点でヒト細胞と高いレベルの類似性を持っています8,13<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
α-シヌクレインを含むプラスミドを親切に共有してくれたJames BardwellとTiago F. Outeiroに感謝します。李長漢は、韓国政府(MSIT)が資金提供する韓国国立研究財団(NRF)から資金提供を受け(助成金2021R1C1C1011690)、教育省が資金提供するNRFによる基礎科学研究プログラム(助成金2021R1A6A1A10044950)、および亜洲大学の新しい教員研究基金を受け取りました。
Materials
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
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