Automatically Generated

Summary

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel voor de overgang van pneumokokken van een asymptomatische kolonisator naar een ziekteverwekkende ziekteverwekker tijdens virale infectie. Dit model kan gemakkelijk worden aangepast om polymicrobiële en gastheer-pathogeen interacties te bestuderen tijdens de verschillende fasen van ziekteprogressie en tussen verschillende gastheren.

Abstract

Streptococcus pneumoniae (pneumokokken) is een asymptomatische kolonisator van de nasopharynx bij de meeste individuen, maar kan zich ontwikkelen tot een pulmonale en systemische ziekteverwekker bij influenza A-virus (IAV) infectie. Gevorderde leeftijd verhoogt de gevoeligheid van de gastheer voor secundaire pneumokokkenpneumonie en wordt geassocieerd met verslechterde ziekte-uitkomsten. De gastheerfactoren die deze processen aansturen, zijn niet goed gedefinieerd, deels vanwege een gebrek aan diermodellen die de overgang van asymptomatische kolonisatie naar ernstige klinische ziekte reproduceren.

Dit artikel beschrijft een nieuw muismodel dat de overgang van pneumokokken van asymptomatisch vervoer naar ziekte na virale infectie nabootst. In dit model worden muizen eerst intranasaal ingeënt met biofilmgekweekte pneumokokken om asymptomatisch vervoer vast te stellen, gevolgd door IAV-infectie van zowel de nasopharynx als de longen. Dit resulteert in bacteriële verspreiding naar de longen, longontsteking en duidelijke tekenen van ziekte die kunnen evolueren naar dodelijkheid. De mate van ziekte is afhankelijk van de bacteriestam en gastheerfactoren.

Belangrijk is dat dit model de gevoeligheid van veroudering reproduceert, omdat oude muizen in vergelijking met jonge muizen ernstiger klinische ziekten vertonen en vaker aan de ziekte bezwijken. Door transport en ziekte in verschillende stappen te scheiden en de mogelijkheid te bieden om de genetische varianten van zowel de ziekteverwekker als de gastheer te analyseren, maakt dit S. pneumoniae / IAV-co-infectiemodel het mogelijk om de interacties van een belangrijke pathobiont met de gastheer in verschillende stadia van ziekteprogressie gedetailleerd te onderzoeken. Dit model kan ook dienen als een belangrijk hulpmiddel voor het identificeren van potentiële therapeutische doelen tegen secundaire pneumokokkenpneumonie bij gevoelige gastheren.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumokokken) zijn Gram-positieve bacteriën die asymptomatisch verblijven in de nasopharynx van de meeste gezonde personen ^1,2. Gepromoot door factoren die niet volledig zijn gedefinieerd, kunnen pneumokokken overgaan van goedaardige kolonisatoren van de nasopharynx naar pathogenen die zich verspreiden naar andere organen, wat resulteert in ernstige infecties, waaronder otitis media, longontsteking en bacteriëmie³. De presentatie van pneumokokkenziekte is gedeeltelijk afhankelijk van stamspecifieke verschillen, waaronder het serotype, dat is gebaseerd op de samenstelling van kapselpolysacchariden. Er zijn tot nu toe meer dan 100 serotypen gekarakteriseerd en sommige zijn geassocieerd met meer invasieve infecties ^4,5. Verschillende andere factoren verhogen het risico op pneumokokkenziekte. Een van die factoren is virale infectie, waarbij het risico op pneumokokkenpneumonie 100-voudig wordt verhoogd met IAV ^6,7. Historisch gezien is S. pneumoniae een van de meest voorkomende oorzaken van secundaire bacteriële pneumonie na influenza en wordt geassocieerd met slechtere resultaten⁸. Een andere belangrijke risicofactor is gevorderde leeftijd. In feite is S. pneumoniae de belangrijkste oorzaak van door de gemeenschap verworven bacteriële pneumonie bij ouderen ouder dan 65 jaar ^9,10. Ouderen zijn verantwoordelijk voor de meerderheid (>75%) van de sterfgevallen als gevolg van longontsteking en influenza, wat aangeeft dat de twee risicofactoren – veroudering en IAV-infectie – synergetisch de ziektegevoeligheid verergeren^11,12,13,14. De mechanismen waarmee virale infectie de overgang van pneumokokken van asymptomatische kolonisator naar invasieve ziekteverwekker veroorzaakt en hoe dit wordt gevormd door gastheerfactoren, blijven echter slecht gedefinieerd. Dit is grotendeels te wijten aan de afwezigheid van een klein diermodel dat de overgang van asymptomatische pneumokokkenkolonisatie naar kritieke klinische ziekte samenvat.

Co-infectiestudies zijn klassiek gemodelleerd bij muizen die 7 dagen na influenza-infectie rechtstreeks in de longen zijn ingeënt met pneumokokken^15,16. Dit reproduceert de gevoeligheid voor secundaire bacteriële pneumonie en is ideaal om te bestuderen hoe antivirale immuunresponsen de antibacteriële afweer aantasten¹⁷. Longitudinale studies bij mensen hebben echter aangetoond dat pneumokokkenvervoer in de nasopharynx, waar de bacteriën asymptomatische biofilms kunnen vormen¹⁸, uniform geassocieerd is met invasieve ziekten^19,20. Bacteriële isolaten van infecties van het middenoor, de longen en het bloed zijn genetisch identiek aan die in de nasopharynx²⁰. Om de overgang van asymptomatisch vervoer naar invasieve ziekte na IAV-infectie te bestuderen, werd dus een model opgesteld waarin muizen intranasaal biofilmgekweekte pneumokokken kregen toegediend, gevolgd door IAV-infectie van de nasopharynx^21,22. Virale infectie van de bovenste luchtwegen leidde tot veranderingen in de gastheeromgeving die leidden tot de verspreiding van pneumokokken uit biofilms en hun verspreiding naar de onderste luchtwegen²¹. Deze verspreide bacteriën hadden upregulated expressie van virulentiefactoren die belangrijk zijn voor infectie, waardoor ze werden omgezet van kolonisatoren in pathogenen²¹. Deze observaties benadrukken de complexe interactie tussen het virus, de gastheer en de bacteriën en tonen aan dat de veranderingen in de gastheer veroorzaakt door virale infectie een directe invloed hebben op het pneumokokkengedrag, wat op zijn beurt het verloop van bacteriële infectie verandert. Dit model slaagt er echter niet in om de ernstige tekenen van ziekte die bij mensen worden waargenomen samen te vatten, waarschijnlijk omdat het virus beperkt is tot de neusholte en de systemische effecten van virale infectie op gastheerimmuniteit en longschade niet worden samengevat.

We hebben onlangs een model opgesteld dat de complexe interactie tussen de gastheer en pathogenen omvat, maar ook de ernst van de ziekte die bij mensen wordt waargenomen beter nabootst²³. In dit model worden muizen eerst intranasaal geïnfecteerd met biofilmgekweekte pneumokokken om asymptomatisch transport tot stand te brengen, gevolgd door IAV-infectie van zowel de nasopharynx als de longen. Dit resulteerde in bacteriële verspreiding naar de longen, longontsteking en ziekte die zich ontwikkelde tot dodelijkheid bij een fractie van jonge muizen²³. Deze eerdere studie toonde aan dat zowel virale als bacteriële infectie de afweer van de gastheer veranderde: virale infectie bevorderde bacteriële verspreiding en eerdere bacteriële kolonisatie verminderde het vermogen van de gastheer om pulmonale IAV-niveaus te beheersen²³. Onderzoek van de immuunrespons onthulde dat IAV-infectie de antibacteriële activiteit van neutrofielen verminderde, terwijl bacteriële kolonisatie de type I-interferonrespons die cruciaal is voor antivirale verdediging afstompte²³. Belangrijk is dat dit model de gevoeligheid van veroudering reproduceerde. In vergelijking met jonge muizen vertoonden oude muizen eerder tekenen van ziekte, vertoonden ze ernstigere klinische ziekten en bezweken ze vaker aan infectie²³. Het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, laat zien dat de mate van ziekte ook afhankelijk is van de bacteriestam, omdat invasieve pneumokokkenstammen een efficiëntere verspreiding vertonen bij IAV-infectie, meer openlijke tekenen van longontsteking vertonen en resulteren in versnelde ziektepercentages in vergelijking met niet-invasieve stammen. Dit S. pneumoniae /IAV co-infectiemodel maakt dus het gedetailleerde onderzoek van zowel pathogene als gastheerfactoren mogelijk en is zeer geschikt voor het bestuderen van immuunresponsen op polymicrobiële infecties in de verschillende stadia van ziekteprogressie.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door de University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee. 1. Chemisch gedefinieerde media (CDM) voorbereiden Bereid de voorraden als volgt voor:Los de in tabel 1 vermelde mengsels I al roerend op in 100 ml ultrapuur water. Bewaren in 200 μL aliquots bij −20 °C. Los de in tabel 1 vermelde mengsels II-verbindingen al roerend op in 20 ml 0,1 M NaOH. Bewaren in aliquots van 100 μL bij −20 °C. Los de in tabel 1 vermelde mengsels III-verbindingen al roerend op in 1 ml ultrapuur water. Bewaren in 10 μL aliquots bij 4 °C. Los de in tabel 1 vermelde mix IV-verbinding al roerend op in 1 ml ultrapuur water. Bewaren in aliquots van 10 μL bij −20 °C. Los de in tabel 2 vermelde verbindingen in eerste instantie op in 15 ml ultrapuur water onder roeren. Stel de pH in op 7,0 met een paar druppels van 0,1 M NaOH en stel het uiteindelijke volume in op 20 ml met ultrapuur water. Bewaren in 1 ml aliquots bij −20 °C. Los de in tabel 3 vermelde verbindingen al roerend op in 90 ml ultrapuur water op een hete plaat bij 50 °C. Stel de pH in op 7,0 met 0,1 M NaOH en pas vervolgens het uiteindelijke volume aan op 100 ml met ultrapuur water. Bewaren in aliquots van 5 ml bij −20 °C. Maak de startbouillon elke keer vers door de verbindingen in tabel 4 al roerend op te lossen in 70 ml ultrapuur water. Voeg aan de verse startvoorraad de volgende mengvoorraden toe in volgorde: 200 μL Mix I-bouillon (tabel 1), 80 μL Mix II-bouillon (tabel 1), 10 μL Mix III-bouillon (tabel 1), 10 μL Mix IV-bouillon (tabel 2), 1 ml vitaminebouillon (tabel 3) en 5 ml aminozuurbouillon (tabel 4). Zodra de voorraden zijn toegevoegd, stelt u het uiteindelijke volume in op 100 ml door 30 ml ultrapuur water aan het bekerglas toe te voegen. Vul het CDM aan met verbindingen uit tabel 4. Eenmaal grondig gemengd, filter-steriliseren en bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken. 2. Het kweken van de S. pneumoniae biofilm Bereid RP-10-medium door 445 ml RPMI 1640 te mengen met 50 ml warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 5 ml penicilline / streptomycine bij respectievelijk 10.000 E / ml en 10.000 μg / ml. Kweek de NCI-H292 (H292) mucoepidermoïde carcinoom cellijn. Voeg de cellen van één gekochte injectieflacon toe aan 5 ml RP-10-medium in een met weefselkweek behandelde kolf van T-25. Incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 3-5 dagen om 100% samenvloeiing te bereiken. Controleer de cellen onder een lichtmicroscoop met behulp van 10x vergroting om de confluentie te beoordelen.OPMERKING: Wanneer alle cellen in contact staan met andere cellen en er geen openingen tussen zitten, wordt de gewenste 100% confluentie bereikt. Was de cellen 2x in 5 ml PBS op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat de buffer calciumvrij is om te voorkomen dat de EDTA in de volgende stap cheleert. Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en incubeer bij 37 °C/5% CO2 gedurende 5-10 minuten totdat de cellen loskomen. Neutraliseer met 4 ml RP-10 medium. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en breng over in een conische buis van 50 ml. Voeg 500 μL van de celsuspensie per put toe aan een met weefselkweek behandelde 24-putplaat. Verwacht van een confluente T-25-kolf 2 × 10 6-4 × 106 cellen / ml. Controleer de volgende dag de cellen onder een lichtmicroscoop om er zeker van te zijn dat ze confluent zijn, zoals in stap 2.3. Als dat niet het geval is, incubeer dan langer. Zodra de H292-cellen 100% confluent zijn in de 24-putplaat, wast u de cellen voorzichtig 3x met 1 ml PBS op kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat er geen medium met antibiotica of puin achterblijft. Voeg na het wassen van de cellen 250 μL/put van 4% paraformaldehyde toe om de cellen te fixeren. Incubeer gedurende 1 uur op ijs of ‘s nachts bij 4 °C. De nacht voorafgaand aan de celfixatie, streep de S. pneumoniae-stam van belang op bloedagarplaten en incubeer ‘s nachts bij 37 ° C / 5% CO2.OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens zijn met de volgende S. pneumoniae-stammen verkregen via collaboratieve uitwisseling: serotype 19F otitis media-isolaat EF3030 24, klassiek serotype 2 Avery-stam D3925 en serotype 4-bacteriëmie-isolaatTIGR4 26. De stammen zijn ook verkrijgbaar uit openbare collecties waarnaar wordt verwezen in de Materiaaltabel. Bereid CDM plus oxyrase (0,15 U/ml) door 100 μL oxyrase (30 U/ml) toe te voegen aan 20 ml CDM.OPMERKING: Oxyrase wordt gebruikt om zuurstof te elimineren om de efficiënte groei van S. pneumoniae in vloeibare cultuur mogelijk te maken27. Ent de bacteriën van de plaat in vers CDM + oxyrase door de bacteriën van de plaat te wassen door 1 ml van het CDM + oxyrase toe te voegen en de bacteriekolonies voorzichtig op te tillen met behulp van de zijkant van een pipetpunt van 1 ml, voorzichtig om de agar niet te schrapen. U kunt ook een entlus gebruiken om de bacteriën op te tillen en ze te enten in een buis met 1 ml CDM + oxyrase. Verdun de bacteriën in CDM + oxyrase tot een start-OD600 van 0,05. Kweek de bacteriën in een losjes afgedekte conische buis van 50 ml die op 37 °C/5% CO 2 staat totdat een OD600 van 0,2 is bereikt (dit duurt ergens tussen de2-5 uur). Controleer de OD600 elk uur om er zeker van te zijn dat de OD niet hoger is dan 0,2. Zodra de OD 0,2 heeft bereikt, vortex de bacteriële kweekbuis. Zaai 0,5 ml van de bacteriën op de vaste H292-cellen en voeg nog eens 0,5 ml CDM + oxyrase-medium per put toe. Voeg 1 ml CDM + oxyrase toe aan de controleputten zonder bacteriën. Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 34 °C/5% CO2.OPMERKING: Groei bij 34 °C wordt gebruikt om de lagere temperatuur in de nasopharynx21 beter na te bootsen. Verwijder elke 12 uur na de eerste zaaiing voorzichtig 0,5 ml van het medium en vul aan met 0,5 ml vers CDM + oxyrase. Pas op dat u de vormende biofilm niet verstoort. Controleer de onderkant van de plaat op biofilm en zoek naar toenemende bewolking naarmate de tijd vordert als gevolg van de groei van de biofilm. Om te controleren op verontreiniging, controleert u de putten zonder bacteriën om ervoor te zorgen dat de controleputten vrij blijven. Verwijder 48 uur na inenting het supernatant en was 2x heel voorzichtig met 1 ml PBS. Resuspendeer in 1 ml vers CDM en pipet krachtig op en neer om de biofilm op te tillen. Voor elke bacteriestam bundelt u de bacteriën uit alle putten in een conische buis van 50 ml. Meng goed door de strak afgedekte buis een paar keer voorzichtig op en neer te kantelen. Voeg aan de conische buis van 50 ml 40% glycerol in CDM toe met gelijke volumes om een bacteriële suspensie te bereiken met een eindconcentratie van 20% glycerol. Aliquot 1 ml in microcentrifugebuizen, flash-freeze op droogijs en bespaar bij −80 °C. Inventariseer vóór gebruik de bacteriën door één aliquot op ijs te ontdooien, de buis gedurende 5 minuten op 1.700 × g te draaien, het supernatant te verwijderen, de pellet opnieuw te suspenseren in 1 ml PBS en seriële verdunningen op bloedagarplatente plaatsen 28. Laat de agarplaten ‘s nachts groeien bij 37 °C/5% CO2 en tel de kolonies bij relevante verdunningen om de bacteriële concentratie in kolonievormende eenheden (CFU)/ml te verkrijgen.OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de bacteriën in de voorraden ten minste een dag na het invriezen of later op te sommen, omdat er binnen de eerste 24 uur een daling van de bacteriële levensvatbaarheid is. De opgeslagen bevroren aliquots kunnen worden gebruikt voor een volgende infectie van muizen gedurende maximaal 2 maanden. 3. Intranasale inenting van muizen met biofilmgekweekte S. pneumoniae Koop muizen en gebruik op de gewenste leeftijd.OPMERKING: Muizen van 3-4 maanden oud hebben de voorkeur om jonge gastheren te modelleren, en muizen van 21-24 maanden oud kunnen worden gebruikt om oudere personen >65 jaar29 jaar oud te modelleren. De hier gepresenteerde gegevens zijn met C57BL / 6 mannelijke muizen. Ontdooi de in biofilm gekweekte bacteriële aliquots op ijs en draai gedurende 5 minuten op 1.700 × g . Verwijder en gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de pellet te verstoren, was de bacteriën door de pellet opnieuw te laten zweven in 1 ml PBS en draai opnieuw met 1.700 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in het volume dat nodig is om de gewenste concentratie te bereiken (streef naar 5 × 106 CFU/10 μL voor intranasale inenting). Bevestig de hoeveelheden bacteriën die worden toegediend door het bereide entmateriaal op bloedagarplaten te plaatsen zoals in stap 2.19. Ent de muizen intranasaal met 5 × 106 CFU door 5 μL van het verdunde entmateriaal in elke naris te pipetteren. Zorg ervoor dat u de muizen stevig vasthoudt en het hoofd stabiliseert, totdat het volume is ingeademd (meestal binnen enkele seconden na het pipetteren van het volume in de neusgaten). Voer deze stap uit in afwezigheid van anesthesie om pulmonale aspiratie van het entmateriaal te voorkomen. 4. Virale infectie met influenza A-virus (IAV) Na 48 uur na intranasale inenting met S. pneumoniae ontdooit u de IAV-stam van belang op ijs.OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens zijn met een muis-aangepaste stam van influenza A-virus A / PR / 8/34 H1N1 die werd verkregen via collaboratieve uitwisseling30. Zodra het virus is ontdooid, verdunt u het virus in PBS tot de gewenste concentratie; streven naar 20 plaquevormende eenheden (PFU)/50 μL voor intratracheale infectie en 200 PFU/10 μL voor intranasale infectie. Voor mock-geïnfecteerde en bacterie-only groepen, gebruik PBS om de muizen te enten. Plaats oftalmisch glijmiddel op de ogen van de muizen voorafgaand aan de anesthesie. Verdoof de muizen met 5% isofluraan en bevestig de anesthesie door een stevige teenknijp. Zodra het dier is verdoofd, verwijdert u het uit de isofluraankamer en infecteert u de verdoofde muizen onmiddellijk met 50 μL (20 PFU) IAV intratracheaal met behulp van een stomp pincet om de tong uit de mond te trekken en het volume vloeistof door de luchtpijp te pipetteren. Plaats de muizen in een aparte kooi en controleer tot volledig herstel (ze zijn in staat om sternale lighouding te behouden [in staat om rechtop op de borst te liggen]). Na herstel de muizen onmiddellijk intranasaal inenten met 10 μL (200 PFU) IAV met behulp van de inentingsmethode in stap 3.3. Huismuizen die een enkele of dubbele bacteriële en virale infectie met dezelfde infectiegroep hebben ondergaan en deze scheiden van de andere groepen. 5. De muizen controleren op ziektesymptomen Controleer de muizen dagelijks gedurende ten minste 10 dagen en scoor blindelings op tekenen van ziekte als volgt:Score als volgt voor gewichtsverlies: 0 = 5% of minder; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% of meer. Euthanaseer de muizen met behulp van CO 2-inhalatie wanneer de score voor gewichtsverlies op 3 staat. Score als volgt voor activiteit: 0 = normaal/actief; 1 = bewegen maar licht verminderd; 2 = verminderd; 3 = ernstig verminderd/lusteloos (beweegt alleen bij aanraking), 4 = coma/onbeweeglijk. Euthanaseer de muizen wanneer de activiteitsscore op 3 staat. Score als volgt voor houding: 0 = geen voorgevoel (normaal); 1 = licht gebogen houding; 2 = ernstig voorgevoel. Euthanaseer de muizen wanneer de houdingsscore op 2 staat. Score als volgt voor de ogen: 0 = normaal; 1 = uitstekend; 1 = verzonken; 1 = gesloten; 1 = ontlading. Het kan een combinatie zijn. Tel de totalen op voor de uiteindelijke oogscore. Score als volgt voor ademhaling: 0 = Normale ademhaling; 1 = onregelmatig of gewijzigd (hoger/lager tarief); 2 = moeizaam (overdreven inspanning of hijgen). Euthanaseer de muizen wanneer de ademhalingsscore op 2 staat. Voeg op basis van de bovenstaande criteria de individuele scores toe voor een totale klinische score van gezond (0) tot extreem ziek (15). Beschouw elke muis met een totaalscore van meer dan 2 als ziek. Euthanaseer op humane wijze alle muizen met een totale score boven 9 of de aangegeven scores voor elk criterium en markeer ze op de overlevingscurve. 6. Verwerking van geïnfecteerde weefsels voor bacteriële inventarisatie Na 48 uur na IAV-infectie euthanaseert u de muizen. Plaats de muis in rugligging. Gebruik 70% ethanol en spuit de borst en buik van de muis om de vacht schoon te maken. Knijp met een tang in het midden van de muis in de vacht en huid en knip de vacht met een 4,5 in een dissectieschaar om het gebied van de lever tot aan de borst bloot te leggen. BloedafnameSnijd met een dissectieschaar voorzichtig in de peritoneale holte om de lever bloot te leggen. Leg met een tang de hepatische poortader aan de bovenkant van de lever in de buurt van het middenrif bloot. Knip de leverpoortader af met de dissectieschaar. Zodra het bloed zich in de peritoneale holte begint te verzamelen, verzamelt u 10 μL bloed met behulp van een micropipette en plaatst u het in 90 μL antistollingsoplossing (50 mM EDTA-oplossing in PBS) in een microcentrifugebuis voor plating voor bacteriële belasting. Gebruik een P-1000 micropipette om de rest van het bloed te verzamelen, plaats het in een bloedafnamebuis en centrifugeer gedurende 2 minuten op 7.600 × g om het serum te verzamelen. Bewaar de sera in microcentrifugebuizen bij −80 °C voor latere analyse van elk gewenst cytokine of metaboliet. LongcollectieMaak met een dissectieschaar een knip langs de zijkanten van de blootgestelde ribbenkast en trek de ribben voorzichtig omhoog naar de kop van de muis om het hart bloot te leggen. Steek een naald van 25 G die is bevestigd aan een spuit van 10 ml voorgevuld met PBS in de rechterkamer en begin langzaam te persen. Zoek naar bleken van de longen als een indicator van succesvolle perfusie. Spoel langzaam om te voorkomen dat het longweefsel breekt. Til het hart op met de tang en maak een snee om de longen en het hart te scheiden. Eenmaal gescheiden, pak alle lobben van de long op met de tang en spoel in een schaal met steriele PBS om eventueel achtergebleven bloed te verwijderen. Hak in een petrischaaltje de longen in kleine stukjes en meng goed. Verwijder de helft van het longmengsel voor de bepaling van de bacteriële CFU of virale PFU en plaats deze in een ronde bodem 15 ml buis voorgevuld met 0,5 ml PBS voor homogenisatie.OPMERKING: Het is belangrijk om geen verschillende lobben van dezelfde long te nemen voor de verschillende beoordelingen. In plaats daarvan moeten alle lobben worden gehakt, goed met elkaar worden gemengd en gelijk worden ontleed voor de verschillende beoordelingen. Verwijder de andere helft van de long voor flowcytometrie (rubriek 7 hieronder) en plaats deze in een niet-weefselkweekbehandelde 24-well-plaat met elke put voorgevuld met 0,5 ml RP-10. Laat op kamertemperatuur staan tot de verwerking. Nasopharynx collectieGebruik in de nek de dissectieschaar om de vacht weg te knippen en knip vervolgens de spier weg en leg de luchtpijp bloot.OPMERKING: De luchtpijp is een buisachtige structuur onder de spier. Plaats een kleine tang onder de luchtpijp op een afstand van 1 cm van de kaak van de muis om deze te stabiliseren. Maak met een dissectieschaar voorzichtig een spleet van 0,1 cm op het voorste deel van de luchtpijp, waarbij u vermijdt de luchtpijp volledig door te snijden. Bereid een spuit van 1 ml gevuld met 0,5 ml PBS met een slang van 0,58 mm bevestigd aan een naald van 25 g. Verzamel de neuswas door de slang in de luchtpijp in te brengen die omhoog gaat naar de nasopharynx. Zodra weerstand wordt gevoeld in de neusholte, plaatst u een microcentrifugebuis bij de neus en spoelt u de PBS langzaam door de luchtpijp om de neusspoeling te verzamelen. Plaats de muis in een buikligging. Spuit de kop van de muis in met ethanol. Gebruik een dissectieschaar om de vacht te knippen en mystaciale pad om het hoofdbot van de muis bloot te leggen. Maak met behulp van de dissectieschaar een knip van 1 cm langs de zijkanten van de onderkaak en tussen de ogen. Trek met een tang de gezichtsbeenderen langzaam weg van het lichaam om de neusholte bloot te leggen. Gebruik een tang om het neusweefsel voorzichtig te verwijderen en plaats het in een ronde bodembuis die voorgevuld is met 0,5 ml PBS voor homogenisatie. Om het verzamelde weefsel te homogeniseren, reinigt u eerst de homogenisatorsonde door deze in 70% ethanol te plaatsen en de homogenisator gedurende 30 s op 60% vermogen in te schakelen. Herhaal de stap in steriel water gedurende 10 s. Homogeniseer elk weefsel gedurende 1 min. Reinig de homogenisatorsonde in steriel water tussen elk monster en in een verse buis van 70% ethanol tussen elk orgaan en elke monstergroep. Opsomming van bacterienummersZodra alle organen zijn geoogst en gehomogeniseerd, worden de seriële verdunningen op de bloedagarplaten weergegeven. Om de totale CFU te berekenen, gebruikt u 10 μL om het uiteindelijke volume in ml voor elk monster te plaatsen en te noteren. Plaats de nasopharynxmonsters op bloedagarplaten aangevuld met 3 μg / ml gentamicine om te selecteren op de groei van S. pneumoniae terwijl de groei van andere micro-organismen die dat weefsel koloniseren wordt geremd. Incubeer ‘s nachts bij 37 °C/5% CO2. Om de bacteriële CFU voor de long en nasopharynx op te sommen, telt u eerst de kolonies op de bloedagarplaten. Gebruik vervolgens vergelijking (1) en vergelijking (2) om de hoeveelheid per ml en het totale aantal te berekenen.Hoeveelheid per ml = aantal kolonies × verdunningsfactor × 100 (1)Totaal aantal = hoeveelheid per ml × totaal volume per monster (2)OPMERKING: In vergelijking (1) wordt 100 gebruikt om te vermenigvuldigen omdat 10 μL is verguld, wat een 100-voudige verdunning van 1 ml is. Het totale volume per monster in vergelijking (2) is van stap 6.7.1, wat resulteert in de detectiegrens van 100 per orgaan. Om de bacteriële CFU voor bacteriëmie op te sommen, telt u eerst de kolonies op de bloedagarplaten. Gebruik vervolgens vergelijking (3) om de hoeveelheid per ml bloed te bepalen.Hoeveelheid per ml bloed = aantal kolonies × verdunningsfactor × 100 × 10 (3)OPMERKING: In vergelijking (3) wordt 100 gebruikt als 10 μL wordt verguld, wat een 100-voudige verdunning van 1 ml is, en 10 duidt op een 1:10 verdunning van het bloed in antistollingsmiddel. Dit resulteert in de detectiegrens van 1.000 / ml. 7. Verwerking van de longmonsters voor flowcytometrie Bereid de vereiste media als volgt voor:Bereid RP-10 voor zoals beschreven in stap 2.1. Bereid de spijsverteringsbuffer voor door RP-10 te mengen met 2 mg/ml collagenase en 30 μL/ml DNase I. Bereid lysisbuffer voor door 8,29 g NH4Cl, 1 g NaHCO3 en 0,038 g EDTA op te lossen in 1 L H2O. Bereid 10x FACS-buffer voor door 450 ml HBSS te mengen met 50 ml warmte-geïnactiveerde FBS en 5 g natriumazide. Bereid 1x FACS-buffer voor door 50 ml 10x FACS-buffer te verdunnen in 450 ml HBSS. Neem de longmonsters uit stap 6.4.3 en plaats ze in een plaat met 24 putten. Voeg 500 μL verteringsbuffer toe aan elke put. Incubeer gedurende 45 min tot 1 h bij 37 °C/5% CO2. Vul 50 ml conische buizen voor elk monster voor met 5 ml RP-10. Wanneer de incubatie voorbij is, plaatst u een filter van 100 μm aan de bovenkant van de conische buis van 50 ml en maakt u deze nat met 1 ml RP-10. Gebruik een P-1000 micropipette, beweeg de verteerde longen en plaats ze op het filter. Gebruik de zuiger van een spuit van 3 ml om het orgel te pureren. Spoel 2x af met telkens 1 ml RP-10. Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C en 327 × g . Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 1 ml lysisbuffer. Laat 3 minuten staan om lysis van de rode bloedcellen mogelijk te maken. Neutraliseer met 5 ml RP-10. Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C en 327 × g . Zuig het supernatant op, resuspensie van de pellet in 1 ml RP-10 en neem 10 μL voor het tellen van de monsters. Draai de monsters gedurende 5 minuten bij 4 °C en 327 × g. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in RP-10 bij 2 × 10 6-4 × 106 cellen/ml. Voeg 60 μL van elk monster toe aan een plaat met 96 putten om te kleuren voor de gewenste celtypen23 die worden vermeld in stap 7.9, tabel 5 en tabel 6. Draai de plaat gedurende 5 minuten op 4 °C en 327 × g . Bereid ondertussen de antilichaammastermengsels, fluorescerende min één (FMO’s) en enkelvlekcontroles voor met de gewenste antilichamen. Om te kleuren voor polymorfonucleaire leukocyten (PMN’s), macrofagen, monocyten, dendritische cellen en T-cellen, gebruikt u de antilichamen en uiteindelijke verdunningen vermeld in tabel 5 en tabel 6. Gebruik een totaal volume van 100 μL/well van het antilichaammengsel. Volg de verdunningen in de tabellen om het juiste volume van het hoofdmengsel en de vereiste individuele antilichamen te bepalen. Wanneer de spin is voltooid (stap 7.8), decanteert u het supernatant, resuspenseert u de pellets in 100 μL van de antilichaammengsels, FMO’s of controles met één vlek en incubeert u gedurende 30 minuten in het donker op ijs. Was de cellen 2x door 150 μL FACS-buffer aan de putjes toe te voegen en de plaat gedurende 5 minuten op 4 °C en 327 × g te draaien. Wanneer de spin is voltooid, decanteert u het supernatant, resuspenseert u de pellets in 100 μL fixatiebuffer en incubeert u gedurende 20 minuten op ijs. Was de cellen 2x door 150 μL FACS-buffer aan de putjes toe te voegen en de plaat gedurende 5 minuten op 4 °C en 327 × g te draaien. Bereid gelabelde FACS-buizen voor met 200 μL FACS-buffer. Resuspensie van de pellets in 150 μL FACS-buffer. Filter elk monster afzonderlijk in de bijbehorende FACS-buis met behulp van een filter van 100 μm. Bewaren op ijs of bij 4 °C en beschermd tegen het licht totdat het klaar is om te analyseren. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer. 8. Plaquetest voor het inventariseren van IAV Bereid de vereiste media als volgt voor:Bereid het infectiemedium door 2,5 g runderserumalbumine (BSA) op te lossen in 40 ml DMEM terwijl u gedurende 10-20 minuten bij 37 °C roert totdat het is opgelost. Filtersteriliseren tot 460 ml DMEM. Bereid 2,4% microkristallijne cellulose door 1,2 mg microkristallijne cellulose op te lossen in 50 ml H2O. Autoclaaf op de vloeibare instelling en bewaar bij kamertemperatuur. Bereid 5% BSA DMEM door 2,5 g BSA op te lossen in 40 ml DMEM terwijl u roert bij 37 °C gedurende 10-20 minuten. Voeg de resterende 10 ml DMEM toe voor een eindvolume van 50 ml. Filter-steriliseren en bewaren bij 4 °C. Bereid 2x MEM/0,5% BSA door 1 ml 5% BSA DMEM te mengen met 9 ml 2x MEM. Bereid overlay-medium met lage viscositeit door een 1:1-verhouding van 2,4% microkristallijne cellulose en 2x MEM/0,5% BSA te mengen met 1 mg/ml TPCK (remmer van chymotrypsine) trypsine. Bereid EMEM/10% FBS voor door 450 ml Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM) te mengen met 50 ml warmte-geïnactiveerde FBS. Kweek de Madin-Darby canine kidney (MDCK) cellijn. Voeg de cellen van één gekochte injectieflacon toe aan 5 ml EMEM/10% FBS in een met weefselkweek behandelde kolf van T-25. Incubeer gedurende 3-5 dagen bij 37 °C/5% CO2 totdat de cellen 100% samenvloeiing bereiken. Controleer op confluentie zoals in stap 2.3. Verwijder het kweekmedium en gooi het weg en spoel 2x af met 5 ml PBS op kamertemperatuur. Voeg 1 ml trypsine-EDTA toe aan de kolf en incubeer bij 37 °C/ 5% CO2 gedurende 10-15 minuten totdat de cellen loskomen. Eenmaal opgeheven, neutraliseer met 4 ml EMEM / 10% FBS om een celsuspensie te verkrijgen bij 2 × 105 cellen / ml. Zaai de MDCK-cellen in een met weefselkweek behandelde plaat met 12 putjes door 1 ml geresuspendeerde cellen per put toe te voegen (bij 2 × 105 cellen/put) 1 dag voordat u met de plaquetest begint.OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen 100% confluentie bereiken voor gebruik en incuberen langer indien nodig om confluency te bereiken. Voor gebruik als standaard, maak 10-voudige seriële verdunningen (10 6-10 1) van IAV-voorraad (van een bekende titer) in het infectiemedium vermeld in stap 8.1.1. Maak 1,2 ml van elke verdunning om in drievoud te testen. Ontdooi de orgaanhomogenaten op ijs. Draai op een tafelcentrifuge van 2.000 × g en verzamel het heldere supernatant. Herhaal stap 8.5, maar met het supernatant uit de monsters in stap 8.6. Zuig het medium uit de cellen en was 2x met 1 ml PBS om alle FBS te verwijderen. Voeg 300 μL van elke standaardverdunning of serieel verdund monster voorzichtig toe langs de zijkant van elk putje, beginnend bij de hoogste verdunning tot de laagste, en doe dit in drievoud. Plaats de platen in de incubator bij 37 °C/5% CO2 en schud de plaat om de 10 minuten gedurende in totaal 50 minuten. Zorg ervoor dat je ze plat in de couveuse plaatst en stapel ze niet op. Na de 50 min, was de cellen 2x met 1 ml PBS. Voeg 2 ml van het laagviscositeitsoverlaymedium toe aan elke put, behalve de putjes met de laagste verdunning en de virusvrije put; Voeg daaraan infectiemedium en trypsine toe. Plaats de plaat terug in de couveuse bij 37 °C/5% CO 2 gedurende2-4 dagen om plaques te verkrijgen die met het blote oog kunnen worden gevisualiseerd. Was de platen door 2 ml PBS toe te voegen aan elke put, snel vanaf de zijkant en schud voorzichtig om het bezonken laagviscositeitsoverlaymedium op te schorten. Gooi het hele vloeistofvolume in de put weg door het medium voorzichtig af te pipetten. Herhaal de was nog een keer met 2 ml PBS in elk putje en gooi vervolgens het hele vloeistofvolume weg door voorzichtig pipetteren. Om de plaques te fixeren, voegt u 500 μL 4% paraformaldehyde toe aan elk putje, schudt u en laat u 30 minuten zitten. Was langzaam langs de zijkant met 1 ml PBS; Gooi de vloeistof vervolgens voorzichtig weg. Voeg 500 μL 1% kristalviolet (verdund in water) toe aan elke put om de celmonolaag te bedekken. Incubeer gedurende 5 min. Wassen met 1 ml kraanwater. Zorg ervoor dat u alle vloeistof in de put weggooit door voorzichtig pipetteren. Leg de plaat ondersteboven op een luierkussen om een nacht te drogen. Tel de plaquettes visueel en sla de afbeeldingen op elke beschikbare imager op.

Representative Results

Biofilm-gekweekte S. pneumoniae (figuur 1A) werden gebruikt om muizen te infecteren (figuur 1B) met behulp van een klein entmateriaal van 10 μL dat intranasaal werd toegediend aan onverdoofde muizen. Dit entmateriaal met een klein volume resulteert in consistent pneumokokkenvervoer dat beperkt is tot de nasopharynx (figuur 2A, +sp-groepen) terwijl systemische verspreiding wordt vermeden (figuur 2B,C, +sp-groepen). Twee dagen na intranasale inenting werden de muizen geïnfecteerd met een aan murine aangepast H1N1 influenza A-virus A/PR/8/34 (IAV)22,30 dat zowel intranasaal als intratracheaal werd toegediend om een consistente afgifte van specifieke hoeveelheden aan de nasopharynx en de longen te bereiken 23. Hier werd het model gebruikt om het verloop van de ziekte na virale infectie bij muizen intranasaal uitgedaagd te vergelijken met verschillende stammen van S. pneumoniae, waaronder TIGR4 en D39, die invasieve stammen zijn die resulteren in longontsteking die evolueert naar bacteriëmie, en EF3030, een otitis mediastam 21,24,25,26,31. De ziektepresentatie bij S. pneumoniae/IAV co-geïnfecteerde muizen was afhankelijk van de bacteriestam (figuur 2). Hoewel er geen significant verschil was in bacteriële aantallen van de nasopharynx (figuur 2A) tussen een van de stammen, verspreidden S. pneumoniae TIGR4 en D39, maar niet EF3030, zich 48 uur na IAV-infectie naar de longen (figuur 2B). Veertig procent van de muizen intranasaal geïnfecteerd met S. pneumoniae TIGR4 vertoonde bacteriële verspreiding naar de longen, en daarvan werd de helft bacteremisch (figuur 2C), in overeenstemming met eerdere bevindingen23. Muizen intranasaal geïnfecteerd met S. pneumoniae D39 vertoonden een efficiëntere verspreiding, omdat verspreiding naar de longen werd waargenomen bij 100% van de mede-geïnfecteerde muizen (figuur 2B). Net als bij S. pneumoniae TIGR4 kreeg de helft van hen bacteriëmie (figuur 2C). Bij het volgen van de totale overleving, ongeacht de bacteriestam, was de overlevingskans van mede-geïnfecteerde muizen significant lager dan de muizen die alleen met S. pneumoniae werden uitgedaagd voor alle geteste stammen (figuur 2D). Vergeleken met de controlemuizen die alleen met IAV werden uitgedaagd, vertoonden de muizen intranasaal geïnfecteerd met S. pneumoniae TIGR4 en D39, maar niet EF3030, versnelde ziektecijfers. Op dag 2 na IAV-infectie was 30% (D39) en 20% (TIGR4) van de muizen bezweken, terwijl de IAV-only controlegroepen pas op dag 5 na de challenge begonnen te bezwijken (figuur 2D). De muizen die samen geïnfecteerd waren met S. pneumoniae EF3030 en IAV hadden vertraagde symptomen, meer vergelijkbaar met de IAV-only controles (figuur 2D). Deze bevindingen tonen aan dat het co-infectiemodel resulteert in ziekte bij jonge gezonde muizen die afhankelijk is van bacteriestammen, waardoor het ideaal is voor het verkennen van de bacteriële factoren die nodig zijn bij elke stap van de ziekteprogressie. Dit model werd gebruikt om de aanwezigheid van verschillende immuuncellen in de longen te beoordelen (celtypen en gatingstrategie in figuur 3) na IAV-infectie bij muizen die intranasaal waren ingeënt met verschillende stammen van S. pneumoniae. De bacteriestammen D39 en TIGR4, die zich na IAV-infectie in de longen verspreidden, veroorzaakten een significante toename boven de uitgangswaarde (niet-geïnfecteerd) in de instroom van inflammatoire immuuncellen uit de circulatie, zoals neutrofielen (PMN’s) en monocyten, terwijl EF3030 dat niet deed (figuur 4A-C). IAV-infectie alleen al veroorzaakte een significante toename boven de uitgangswaarde in de instroom van immuuncellen die belangrijk zijn voor de afweer van de gastheer tegen virale infecties, zoals NK-cellen en gamma-delta T-cellen (figuur 4A-C). Deze antivirale reacties waren significant afgestompt bij muizen intranasaal geïnfecteerd met S. pneumoniae voorafgaand aan virale challenge (figuur 4A-C). Dit komt overeen met eerdere studies die cytokineresponsen beoordeelden waaruit bleek dat S. pneumoniae-vervoer de productie van type I-interferonen afstompte en het vermogen van de gastheer om IAV-belastingen in de longen te beheersenverminderde 23. Deze bevindingen tonen aan dat het co-infectiemodel kan worden gebruikt om te bestuderen hoe immuunresponsen veranderen in mono- versus polymicrobiële infecties. Dit model werd ook gebruikt om het effect van veroudering op het verloop van de ziekte na IAV-infectie te beoordelen bij muizen intranasaal geïnfecteerd met S. pneumoniae TIGR4. Bij afzonderlijk geïnfecteerde muizen varieerden de virale titers niet tussen de jonge en de oude cohorten (figuur 5A)23. Net als in eerdere studies23 vertoonden oude muizen eerdere en significant ernstigere ziekteverschijnselen in vergelijking met hun jonge tegenhangers, zoals blijkt uit de hogere klinische scores (figuur 5B). In overeenstemming met de ziektesymptomen begonnen oude muizen die waren ingeënt met S. pneumoniae sneller te sterven binnen 24 uur na IAV-infectie, en ze bezweken allemaal aan de ziekte, terwijl de jonge controles de infectie overleefden met een significant hoger (33%) percentage (figuur 5C). Deze bevindingen tonen aan dat het co-infectiemodel kan worden gebruikt om ernstigere ziekten bij kwetsbare gastheren te detecteren, waardoor het ideaal is voor het verkennen van gastheerfactoren die resistentie of gevoeligheid voor co-infectie verlenen. Figuur 1: Tijdlijn van co-infectie en orgaanverwerking voor de beoordeling van de instroom van immuuncellen en de pathogene belasting . (A) Streptococcus pneumoniae worden gekweekt in biofilms. (B) Muizen worden intranasaal ingeënt met 5 × 106 CFU van de geïndiceerde biofilmgekweekte S. pneumoniae-stam om nasofaryngeale carriage tot stand te brengen of onbehandeld te laten. Achtenveertig uur later worden de muizen ofwel nabehandeld met PBS of krijgen ze 200 PFU influenza A-virus PR8 intranasaal en 20 PFU intratracheaal. Muizen worden in de loop van de tijd gecontroleerd op klinische ziektescores en overleving. (C) 48 h na IAV-infectie worden bacteriële CFU of virale PFU in de verschillende organen of immuuncelinstroom in de longen beoordeeld. Afkortingen: CFU = kolonievormende eenheden; PFU = plaquevormende eenheden; IAV = influenza A-virus PR8; IT = intratracheaal; NP = nasofaryngeaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Dubbele intranasale / intratracheale IAV-infectie van S. pneumoniae-geënte muizen leidt tot bacteriële verspreiding en ziekte die afhankelijk is van de bacteriestam. Jonge (10-12 weken oude) mannelijke C57BL/6 (B6) muizen werden geïnfecteerd zoals in figuur 1. Bacteriële aantallen in de (A) nasopharynx, (B) longen en (C) bloed werden allemaal bepaald op 48 h na IAV-infectie. (B,C) Percentages geven de fractie van muizen aan die verspreiding vertoonden. (D) De overleving werd gecontroleerd gedurende 10 dagen na IAV-infectie. Gepoolde gegevens van (A,B) n = 5, (C) n = 11 en (D) n = 6 muizen per groep worden getoond. Elke cirkel komt overeen met één muis en de stippellijnen geven de detectiegrens aan. (A-C) *, geeft een significant verschil (p < 0,05) aan tussen de aangegeven groepen zoals bepaald door de Kruskal-Wallis-test. (D) *, geeft een significant verschil (p < 0,05) aan tussen +sp en Co-inf muizen per bacteriestam zoals bepaald door de log-rank (Mantel-Cox) test. Afkortingen: +sp = muizen die intranasaal zijn geïnfecteerd met bacteriën die alleen de aangegeven stam gebruiken; Co-inf = bacterieel geïnfecteerde muizen die besmet waren met IAV; IAV = muizen die het influenza A-virus hebben ontvangen; CFU = kolonievormende eenheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Immuuncel gating strategie. De longen werden geoogst en de instroom van immuuncellen werd bepaald door flowcytometrie. De representatieve gatingstrategie van de verschillende celtypen wordt getoond. (A) CD45+, levende enkele cellen werden omheind en de percentages van (B) PMN’s (Ly6G+, CD11b+), macrofagen (Ly6G-, Ly6C-, F480+), en monocyten (Ly6G-, Ly6C+), (C) DC’s (Ly6G-, CD11c+) en NK-cellen (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ en CD8 (CD8+, TCRβ+) en CD4 (CD4+, TCRβ+ ) T-cellen werden bepaald. Afkortingen: SSC-A = side scatter-peak area; FSC-A = voorwaarts verstrooid-piekgebied; FSC-H = voorwaartse verstrooiing-piekhoogte; SSC-W = side scatter-peak breedte; L/D = leven/dood; FMO = fluorescerend min één; NK = natural killer; PMN = polymorfonucleaire leukocyt; DC = dendritische cel; TCR = T-celreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Pulmonale immuunresponsen zijn afhankelijk van bacteriestammen. Jonge (10-12 weken oude) C57BL/6 mannelijke muizen waren ofwel niet geïnfecteerd, afzonderlijk ingeënt met de aangegeven Streptococcus pneumoniae-stam (+ sp), afzonderlijk uitgedaagd met IAV (IAV), of mede-geïnfecteerd met S. pneumoniae en IAV (Co-inf). Achtenveertig uur na IAV-infectie (zie het experimentele ontwerp in figuur 1) werden de longen geoogst en werd de instroom van immuuncellen bepaald door flowcytometrie volgens de gating-strategie in figuur 3. (A) De gemiddelde percentages van elk aangegeven celtype binnen de CD45-poort worden weergegeven voor alle behandelingsgroepen op de heatmap. (B) Voor elke muisgroep worden representatieve dot plots van celtypen getoond die significante verschillen tussen behandelingen vertoonden. (C) De percentages van de aangegeven immuunceltypen worden weergegeven. Elke cirkel komt overeen met één muis. (A,C) Gepoolde gegevens van n = 5 muizen per groep worden weergegeven. *, duidt op een significant verschil (p < 0,05) tussen Co-inf en niet-geïnfecteerd; $, duidt op een significant tussen IAV en niet-geïnfecteerd; #, geeft een significant verschil aan tussen Co-inf en IAV alleen. Significante verschillen tussen de uitdagingsgroepen voor elk celtype werden bepaald door ANOVA gevolgd door de Tukey’s-test. Afkortingen: NK = natural killer; PMN = polymorfonucleaire leukocyt; DC = dendritische cel; TCR = T-celreceptor; IAV = influenza A-virus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Veroudering en verhoogde gevoeligheid van de gastheer voor IAV/Streptococcus pneumoniae co-infectie. Jonge (10-12 weken) en leeftijd (21-22 maanden) C57BL/6 mannelijke muizen werden mede-geïnfecteerd met S. pneumoniae TIGR4 i.n. en IAV i.n. en i.t. (zoals in figuur 1) of afzonderlijk uitgedaagd met IAV alleen. (A) Virale titers werden 48 uur later bepaald. Sterretjes geven statistische significantie aan (p < 0,05) zoals bepaald door de t-toets van de student. Gegevens worden samengevoegd van n = 4 muizen per groep. (B) Klinische score en (C) overleving werden in de loop van de tijd gecontroleerd. (B) Het gemiddelde ± SEM gepoold van n = 6 muizen per groep wordt weergegeven. Sterretjes geven statistische significantie (p < 0,05) aan tussen de jonge en oude muizen op het aangegeven tijdstip zoals bepaald door de Mann-Whitney-test. (C) Gegevens worden samengevoegd van n = 6 muizen per groep. Sterretjes geven statistische significantie (p < 0,05) aan tussen de jonge en oude muizen zoals bepaald door de log-rank (Mantel-Cox) test. Afkortingen: IAV = influenza A virus; i.n. = intranasaal; i.t. = intratracheaal; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Figuur 5A is met toestemming overgenomen van Joma et al.23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Mix I voorraad voor CDM Adenine 0,1 g D-Alanine 0,25 g CaCl2 watervrij 0,025 gr Mangaansulfaat 0,03 g Cyanocobalamine 100 μL van 10 mg/ml bouillon Para-aminobenzoëzuur 400 μL van 5 mg/ml bouillon Pyridoxamine 2HCl 100 μL van 10 mg/ml bouillon Mix II voorraad voor CDM Guanine 0,05 g Uracil 0,05 g Mix III voorraad voor CDM IJzernitraat 9H2O 50 mg/ml IJzersulfaat 7H2O 10 mg/ml Mix IV voorraad voor CDM Bèta-nicotine adenine dinucleotide 25 mg/ml Tabel 1: Mix I-, II-, III- en IV-voorraden voor CDM. Afkorting: CDM = chemisch gedefinieerde media. Vitamine mix voorraad voor CDM Pyridoxal Hydrochloride 0,8 g Thiamine Cl2 0,4 g Riboflavine 0,4 g Ca-pantothenaat 0,4 g Biotine 0,04 gr Foliumzuur 0,4 g Niacinamide 0,4 g Tabel 2: Vitamine mix voorraad voor CDM. Afkorting: CDM = chemisch gedefinieerde media. Aminozuurvoorraad voor CDM L-Alanine 0,480 g L-Arginine 0,250 g L-Asparagine 0,700 g L-Asparaginezuur 0,600 gr L-cysteïne 1.000 gr L-cystine 0,100 g L-glutaminezuur 0,200 g L-Glutamine 0,780 gr L-Glycine 0,350 gr L-Histidine 0,300 g L-Isoleucine 0,430 g L-Leucine 0,950 gr L-Lysine 0,880 gr L-Methionine 0,250 g L-Fenylalanine 0,550 g L-Proline 1.350 gr L-Serine 0,680 gr L-Threonine 0,450 gr L-tryptofaan 0,100 g L-Valine 0,650 gr Tabel 3: Aminozuurvoorraad voor CDM. Afkorting: CDM = chemisch gedefinieerde media. Starter voorraad voor CDM Dextrose 1,0 g Magnesiumsulfaat-7-Hydraat 0,070 gr Kaliumfosfaat Dibasisch 0,02 gr Kaliumfosfaat Monobasisch 0,1 g Natriumacetaat watervrij 0,45 g Natriumbicarbonaat 0,25 g Natriumfosfaat Dibasisch 0,735 gr Natriumfosfaat Monobasisch 0,32 g Laatste supplementen voor CDM Cholinechloride 0,1 g L-cysteïne HCl 0,075 g Natriumbicarbonaat 0,25 g Tabel 4: Startmateriaal en laatste supplementen voor CDM. Afkorting: CDM = chemisch gedefinieerde media. Antilichaam/fluorofoor Kloon Verdunningsfactor L/D voor UV-excitatie N.V.T 0.38888889 Ly6G AF 488 1A8 0.25 CD11b APC M1/70 0.25 CD11c PE N418 0.18055556 Muis Fc Blok 2,4 G2 0.11111111 F4/80 PE Cy7 Bm8 0.18055556 Ly6C BV605 AL-21 0.25 CD103 BV 421 M290 0.18055556 CD45 APC-eF-780 30-F11 0.18055556 Tabel 5: Antilichaampaneel 1. Antilichaam/fluorofoor Kloon Verdunningsfactor L/D voor UV-excitatie N.V.T 0.388888889 TCR-β APC Cy7 H57-597 0.180555556 CD4 V450 (Pacific Blauw) RM4-5 0.25 CD8 BV650 53-6.7 0.180555556 Muis Fc Blok 2,4 G2 0.111111111 CD45 PE 30-F11 0.180555556 CD3 AF488 145-2C11 0.180555556 TCR- γΔ APC GL-3 0.180555556 NK1.1 AF 700 PK136 0.180555556 Tabel 6: Antilichaampaneel 2.

Discussion

De meeste van de bestaande S. pneumoniae / IAV co-infectie experimentele studies vertrouwen op bacteriële afgifte in de longen van muizen die vooraf zijn geïnfecteerd met IAV. Deze modellen hebben geholpen bij het identificeren van veranderingen in de longomgeving en systemische immuunrespons die de gastheer vatbaar maken voor secundaire bacteriële infectie 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Deze modellen zijn er echter niet in geslaagd om de overgang van S. pneumoniae van een asymptomatische kolonisator naar een pathogeen dat ernstige long- en systemische infecties kan veroorzaken, na te bootsen. Verder zijn deze modellen niet geschikt voor het bestuderen van de gastheerfactoren en gastheer-pathogeen interacties in de bovenste luchtwegen die bijdragen aan de gevoeligheid voor infectie. Een eerder model voor de verplaatsing van pneumokokken van de nasopharynx naar de long na IAV-infectie was gebaseerd op bacteriële infectie van de nasopharynx gevolgd door virale infectie. Het slaagde er echter niet in om de ernstige ziekteverschijnselen te reproduceren die werden waargenomen bij menselijke patiënten²¹. Het hier beschreven gemodificeerde muizeninfectiemodel vat de overgang van S. pneumoniae van asymptomatisch vervoer naar een pathogeen dat ernstige klinische ziekte veroorzaakt, samen.

Een cruciale stap van dit model is het vaststellen van S. pneumoniae-infectie in de nasopharynx. Streptococcus pneumoniae vormen biofilms en koloniseren de nasopharynx met verschillende efficiënties ^21,38. Om een consistente infectie vast te stellen, is ten minste 5 × 10⁶ CFU van de tot nu toe geteste biofilmgekweekte bacteriestammen vereist²³. Het wordt aanbevolen om elke nieuwe bacteriestam te testen op stabiele infectie van de nasopharynx voorafgaand aan virale infectie. Voor virale co-infectie hebben eerdere studies aangetoond dat intranasale infectie met IAV vereist is voor de verspreiding van de bacteriën uit de nasopharynx^21,22,23. In die eerdere studies werd 500 PFU IAV voor intranasale toediening gebruikt, terwijl in deze studie 200 PFU voldoende was om het aantal bacteriën in de nasopharynx te verhogen. IAV-infectie is niet beperkt tot de bovenste luchtwegen en kan zich verspreiden naar de longen^39,40, wat de sleutel is om de longomgeving toleranter te maken voor bacteriële infectie^15,16,41. De toediening van IAV aan de longen kan worden bereikt door intranasale toediening of intratracheale installatie van verdoofde muizen. Eerder werk met BALB / cByJ-muizen wees uit dat intranasale toediening resulteert in virale pneumonie²¹; de toegang van het entmateriaal tot de longen na intranasale inenting is echter beperkter bij C57BL/6-muizen. Bij C57BL/6-muizen is intratracheale installatie vereist voor een consistente afgifte van het virus²³. In dit model versnelt eerdere bacteriële kolonisatie de presentatie van ziektesymptomen na virale infectie²³. Omdat virale infectie zelf ziektesymptomen kan veroorzaken met mogelijke variatie in kinetiek, wordt aanbevolen om eerst een reeks doses te testen voor elke nieuwe geteste virale stam en een dosis te kiezen die versnelde kinetiek onthult in co-geïnfecteerde gastheren.

De longen bieden een andere kritische uitlezing voor ziekte-evaluatie in dit model. Voor de beoordeling van de pathogene belasting en de instroom van immuuncellen kan een long van dezelfde muis worden gebruikt. Omdat infectie en ernst van de ontsteking echter kunnen verschillen tussen lobben, wordt aanbevolen om geen verschillende lobben van dezelfde long te nemen voor de verschillende beoordelingen. Integendeel, alle lobben kunnen in kleine stukjes worden gehakt, goed met elkaar worden gemengd en vervolgens gelijkelijk worden ontleed voor de verschillende beoordelingen. Evenzo kan de nasopharynx worden gebruikt voor de opsomming van bacteriële CFU of virale PFU en immuunrespons. Het aantal cellen verkregen uit de wasbeurten en het weefsel is echter te laag om flowcytometrie uit te voeren zonder de monsters van muizen binnen dezelfde groep te bundelen. Als alternatief kan ontsteking in de nasopharynx histologisch worden beoordeeld²³.

Een cruciaal kenmerk van dit model is dat het de klinische ziekte samenvat die bij patiënten wordt gezien. Bij mensen resulteert secundaire pneumokokkenpneumonie na IAV-infectie vaak in duidelijke tekenen van ziekte, waaronder hoest, kortademigheid, koorts en spierpijn die kunnen leiden tot ziekenhuisopnames, respiratoire insufficiëntie en zelfs de dood 8,15,42,43. Dit model vat de ernstige tekenen van klinische ziekte samen die bij mensen zijn waargenomen in termen van ademhalingsmoeilijkheden (weerspiegeld in de ademhalingsscore) en algehele malaise (weerspiegeld in houdings- en bewegingsscores) die door de muizen worden weergegeven, evenals de dood bij sommige van de gezonde jonge controles. De verergerde ziektesymptomen bij mede-geïnfecteerde muizen zijn waarschijnlijk een gevolg van zowel bacteriële verspreiding naar de longen als een verminderde virale klaring bij muizen met pneumokokkenvervoer²³. Een beperking van het model is dat de incidentie van klinische ziekte en bacteriële verspreiding van de nasopharynx varieert tussen muizen en wordt beïnvloed door bacteriestam, gastleeftijd en genotype^21,22,23. Als gevolg hiervan kan voor invasieve stammen de progressie van gelokaliseerde infectie (zonder detecteerbare bacteriëmie) tot de dood binnen 24 uur optreden. Daarom moet voor een echte beoordeling van systemische verspreiding bacteriëmie met kortere tussenpozen (elke 6-12 uur) worden gevolgd. Evenzo kan de ziektescore snel veranderen, vooral in de eerste 72 uur na co-infectie. Om de ziektesymptomen nauwlettend te volgen, is het daarom raadzaam om muizen drie keer per dag te controleren gedurende dagen 1-3 na IAV-infectie.

Samenvattend repliceert dit model de beweging van S. pneumoniae van een asymptomatische kolonisator van de nasopharynx naar een pathogeen dat long- en systemische ziekte kan veroorzaken bij IAV-infectie. In dit model activeert IAV de overgang van S. pneumoniae door het bacteriële gedrag in de nasopharynx te wijzigen, de bacteriële verspreiding naar de longen te vergroten en de antibacteriële immuniteit te veranderen²³. Evenzo stompt bacterieel transport de antivirale immuunresponsen af en schaadt het de IAV-klaring uit de longen²³. Dit maakt dit model ideaal voor het ontleden van veranderingen in immuunresponsen bij enkelvoudige versus polymicrobiële infecties. Bovendien is het verloop van de ziekte na co-infectie gedeeltelijk afhankelijk van de stam van pneumokokken die aanwezig is in de nasopharynx. Daarom is het model geschikt voor het ontleden van de bacteriële factoren die nodig zijn voor asymptomatische kolonisatie versus pathogene overgang van S. pneumoniae. Ten slotte reproduceert dit model de gevoeligheid van veroudering voor co-infecties, en hoewel dit hier niet is getest, kan het gemakkelijk worden gebruikt om de impact van de achtergrond van de gastheer op het ziekteverloop te beoordelen. Kortom, het scheiden van transport en ziekte in verschillende stappen biedt de mogelijkheid om de genetische varianten van zowel de pathogenen als de gastheer te analyseren, waardoor het gedetailleerde onderzoek van de interacties van een belangrijke pathobiont met de gastheer in verschillende stadia van ziekteprogressie mogelijk is. In de toekomst kan dit model worden gebruikt om behandelingsopties voor kwetsbare gastheren op maat te maken.

Materials

4-Aminobenzoic acid	Fisher	AAA1267318	Mix I stock
96-well round bottom plates	Greiner Bio-One	650101
100 µm Filters	Fisher	07-201-432
Adenine	Fisher	AC147440250	Mix I stock
Avicel	Fisher	501785325	Microcyrstalline cellulose
BD Cytofix Fixation Buffer	Fisher	BDB554655	Fixation Buffer
BD Fortessa			Flow cytometer
BD Intramedic Polyethylene Tubing	Fisher	427410	Tubing for nasal lavage
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL)	Fisher	14-823-30
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure	Fisher	02-675-185	Blood collection tubes
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide	Fisher	AAJ6233703	Mix IV stock
Biotin	Fisher	AC230090010	Vitamin stock
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	#000644	Mice used in this study
Calcium Chloride Anhydrous	Fisher Chemical	C77-500	Mix I stock
CD103 BV 421	BD Bioscience	BDB562771	Clone: M290 DF 1:200
CD11b APC	Invitrogen	50-112-9622	Clone: M1/70, DF 1:300
CD11c PE	BD Bioscience	BDB565592	Clone: N418 DF 1:200
CD3 AF 488	BD Bioscience	OB153030	Clone: 145-2C11 DF 1:200
CD4 V450	BD Horizon	BDB560470	Clone: RM4.5 DF 1:300
CD45 APC eF-780	BD Bioscience	50-112-9642	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD45 PE	Invitrogen	50-103-70	Clone: 30-F11 DF 1:200
CD8α BV 650	BD Horizon	BDB563234	Clone: 53-6.7 DF 1:200
Choline chloride	Fisher	AC110290500	Final supplement to CDM
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems	Fisher	09-761-107	Filter sterilzation apparatus
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks	Fisher	10-126-9
Corning Costar Clear Multiple Well Plates	Fisher	07-201-590
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate	Fisher	MT10017CM
Cyanocobalamin	Fisher	AC405925000	Mix I stock
D39	National Collection of Type Culture (NCTC)	NCTC 7466	Streptococcus pneumoniae strain
D-Alanine	Fisher	AAA1023114	Mix I stock
D-Calcium pantothenate	Fisher	AC243301000	Vitamin stock
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Starter stock
Dnase	Worthington Biochemical	LS002147
Eagles Minimum Essential Medium	ATCC	30-2003
EDTA	VWR	BDH4616-500G
EF3030	Center for Disease Control and Prevention	Available via the isolate bank request	Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name
F480 PE Cy7	BD Bioscience	50-112-9713	Clone: BMB DF 1:200
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher	14-432-22	50 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher	14-959-11B	15 mL round bottom tube
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL)	Fisher	14-959-5	FACS tubes
FBS	Thermofisher	10437-028
Ferric Nitrate Nonahydrate	Fisher	I110-100	Mix III stock
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors	Fisher	08-951-5	Instruments used for harvest
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops	Fisher	22-363-602	Inoculating loops
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps	Fisher	13-812-38	Forceps for harvest
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher	05-408-137	Micocentrifuge tubes
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL)	Fisher	14-955-459
Folic Acid	Fisher	AC216630500	Vitamin stock
Gibco RPMI 1640 (ATCC)	Fisher	A1049101
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher	14190250
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Fisher	14025134
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red	Fisher	11-935-046
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher	15-140-122
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher	15-250-061
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Fisher	25-200-056
Glycerol (Certified ACS)	Fisher	G33-4
Glycine	Fisher	AA3643530	Amino acid stock
Guanine	Fisher	AAA1202414	Mix II stock
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads	Fisher	50-112-9040
Iron (II) sulfate heptahydrate	Fisher	AAA1517836	Mix III stock
L-Alanine	Fisher	AAJ6027918	Amino acid stock
L-Arginine	Fisher	AAA1573814	Amino acid stock
L-Asparagine	Fisher	AAB2147322	Amino acid stock
L-Aspartic acid	Fisher	AAA1352022	Amino acid stock
L-Cysteine	Fisher	AAA1043518	Amino acid stock
L-Cysteine hydrochloride monohydrate	Fisher	AAA1038914	Final supplement to CDM
L-Cystine	Fisher	AAA1376218	Amino acid stock
L-Glutamic acid	Fisher	AC156211000	Amino acid stock
L-Glutamine	Fisher	O2956-100	Amino acid stock
L-Histidine	Fisher	AC166150250	Amino acid stock
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation	Invitrogen	50-112-1524	Clone: N/A DF 1:500
L-Isoleucine	Fisher	AC166170250	Amino acid stock
L-Leucine	Fisher	BP385-100	Amino acid stock
L-Lysine	Fisher	AAJ6222514	Amino acid stock
L-Methionine	Fisher	AAA1031822	Amino acid stock
Low endotoxin BSA	Sigma Aldrich	A1470-10G
L-Phenylalanine	Fisher	AAA1323814	Amino acid stock
L-Proline	Fisher	AAA1019922	Amino acid stock
L-Serine	Fisher	AC132660250	Amino acid stock
L-Threonine	Fisher	AC138930250	Amino acid stock
L-Tryptophan	Fisher	AAA1023014	Amino acid stock
L-Valine	Fisher	AAA1272014	Amino acid stock
Ly6C BV 605	BD Bioscience	BDB563011	Clone: AL-21 DF 1:300
Ly6G AF 488	Biolegend	NC1102120	Clone: IA8, DF 1:300
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	American Type Culture Collection (ATCC)	CCL-34	MDCK cell line for PFU analuysis
Magnesium Sulfate 7-Hydrate	Fisher	60-019-68	CDM starter stock
Manganese Sulfate	Fisher	M113-500	Mix I stock
MilQ water			Ultra-pure water
Mouse Fc Block	BD Bioscience	BDB553142	Clone: 2.4G2 DF 1:100
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT	Fisher	NC1886507	Eye lubricant for infection
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line	ATCC	CRL-1848	H292 lung epithelial cell line for biofilm growth
Niacinamide	Fisher	18-604-792	Vitamin stock
NK 1.1 AF 700	BD Bioscience	50-112-4692	Clone: PK136 DF 1:200
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk	Fisher	50-200-5299	To remove oxygen from liquid cultures
Paraformaldehyde 4% in PBS	Thermoscientific	J19932-K2
Pivetal Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-8440	Isoflurane for anesthesia during infection
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	P288-500	Starter stock
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	P285-500	Starter stock
Pyridoxal hydrochloride	Fisher	AC352710250	Vitamin stock
Pyridoxamine dihydrochloride	Fisher	AAJ6267906	Mix I stock
Riboflavin	Fisher	AC132350250	Vitamin stock
Sodium Acetate	VWR	0530-500G	Starter stock
Sodium Azide	Fisher Bioreagents	BP922I-500	For FACS buffer
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500	Starter stock and final supplement to CDM
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Chemical	S374-500	Starter stock
Sodium Phosphate Monobasic	Fisher Chemical	S369-500	Starter stock
TCR APC	BD Bioscience	50-112-8889	Clone: GL-3 DF 1:200
TCRβ APC-Cy7	BD Pharmigen	BDB560656	Clone: H57-597 DF 1:200
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin	Fisher	R01227	Blood agar plates with the antibiotic gentamicin
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated	Fisher	PI20233
Thiamine hydrochloride	Fisher	AC148991000	Vitamin stock
TIGR4	ATCC	BAA-334	Streptococcus pneumoniae strain
Uracil	Fisher	AC157300250	Mix II stock
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g	Fisher	NC9693955