Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.
O Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um colonizador assintomático da nasofaringe na maioria dos indivíduos, mas pode evoluir para patógeno pulmonar e sistêmico após a infecção pelo vírus influenza A (IAV). A idade avançada aumenta a suscetibilidade do hospedeiro à pneumonia pneumocócica secundária e está associada a desfechos agravados da doença. Os fatores do hospedeiro que conduzem esses processos não estão bem definidos, em parte devido à falta de modelos animais que reproduzam a transição da colonização assintomática para a doença clínica grave.
Este artigo descreve um novo modelo de camundongo que recria a transição de pneumococos de carreador assintomático para doença após infecção viral. Nesse modelo, camundongos são primeiro inoculados intranasalmente com pneumococos cultivados com biofilme para estabelecer carreamento assintomático, seguido por infecção por IAV tanto na nasofaringe quanto nos pulmões. Isso resulta em disseminação bacteriana para os pulmões, inflamação pulmonar e sinais óbvios de doença que podem evoluir para letalidade. O grau da doença é dependente da cepa bacteriana e dos fatores do hospedeiro.
É importante ressaltar que esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento, pois em comparação com camundongos jovens, os camundongos velhos apresentam doença clínica mais grave e sucumbem à doença com mais frequência. Ao separar carreador e doença em etapas distintas e fornecer a oportunidade de analisar as variantes genéticas do patógeno e do hospedeiro, este modelo de co-infecção S. pneumoniae/IAV permite o exame detalhado das interações de um importante patobionte com o hospedeiro em diferentes fases da progressão da doença. Esse modelo também pode servir como uma importante ferramenta para identificar potenciais alvos terapêuticos contra pneumonia pneumocócica secundária em hospedeiros suscetíveis.
Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são bactérias Gram-positivas que residem assintomático na nasofaringe da maioria dos indivíduos saudáveis 1,2. Promovido por fatores não completamente definidos, o pneumococo pode transitar de colonizadores benignos da nasofaringe para patógenos que se disseminam para outros órgãos, resultando em infecções graves, incluindo otite média, pneumonia e bacteremia3. A apresentação da doença pneumocócica é, em parte, dependente de diferenças específicas da cepa, incluindo o sorotipo, que é baseado na composição dos polissacarídeos capsulares. Existem mais de 100 sorotipos caracterizados até o momento, e alguns estão associados a infecções mais invasivas 4,5. Vários outros fatores aumentam o risco de doença pneumocócica. Um desses fatores é a infecção viral, em que o risco de pneumonia pneumocócica é aumentado em 100 vezes pelo IAV 6,7. Historicamente, o S. pneumoniae é uma das causas mais comuns de pneumonia bacteriana secundária após influenza e está associado a piores desfechos8. Outro importante fator de risco é a idade avançada. De fato, o S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana adquirida na comunidade em idosos acima de 65 anos 9,10. Os idosos são responsáveis pela maioria (>75%) dos óbitos por pneumonia e influenza, indicando que os dois fatores de risco – envelhecimento e infecção por VAI – pioram sinergicamente a suscetibilidade à doença11,12,13,14. No entanto, os mecanismos pelos quais a infecção viral provoca a transição do pneumococo de colonizador assintomático para patógeno invasivo e como este é moldado por fatores do hospedeiro permanecem pouco definidos. Isso se deve em grande parte à ausência de um modelo animal de pequeno porte que recapitule a transição da colonização pneumocócica assintomática para doença clínica crítica.
Estudos de co-infecção têm sido classicamente modelados em camundongos inoculados com pneumococos diretamente nos pulmões 7 dias após a infecção por influenza15,16. Isso reproduz a suscetibilidade à pneumonia bacteriana secundária e é ideal para estudar como as respostas imunes antivirais prejudicam as defesas antibacterianas17. Entretanto, estudos longitudinais em humanos têm demonstrado que o carreamento pneumocócico na nasofaringe, onde a bactéria pode formar biofilmesassintomáticos18, está uniformemente associado a doenças invasivas19,20. Isolados bacterianos de infecções de orelha média, pulmão e sangue são geneticamente idênticos aos encontrados na nasofaringe20. Assim, para estudar a transição de carreamento assintomático para doença invasiva após infecção por VA, estabeleceu-se um modelo em que camundongos receberam pneumococo cultivado com biofilme por via intranasal seguido de infecção por IAV na nasofaringe21,22. A infecção viral das vias aéreas superiores levou a alterações no ambiente do hospedeiro que levaram à dispersão dos pneumococos dos biofilmes e sua disseminação para as vias aéreas inferiores21. Essas bactérias dispersas apresentaram expressão regulada de fatores de virulência importantes para a infecção, convertendo-as de colonizadoras em patógenos21. Essas observações destacam a complexa interação entre vírus, hospedeiro e bactéria e demonstram que as alterações no hospedeiro desencadeadas pela infecção viral têm impacto direto no comportamento pneumocócico, que, por sua vez, altera o curso da infecção bacteriana. No entanto, esse modelo falha em recapitular os sinais graves de doença observados em humanos, provavelmente porque o vírus é limitado à cavidade nasal, e os efeitos sistêmicos da infecção viral na imunidade do hospedeiro e danos pulmonares não são recapitulados.
Recentemente, estabelecemos um modelo que incorpora a complexa interação entre o hospedeiro e os patógenos, mas também mimetiza mais de perto a gravidade da doença observada em humanos23. Neste modelo, camundongos são primeiramente infectados intranasalmente com pneumococos cultivados com biofilme para estabelecer carreamento assintomático, seguido por infecção por IAV tanto na nasofaringe quanto nos pulmões. Isso resultou em disseminação bacteriana para os pulmões, inflamação pulmonar e doença que progrediu para letalidade em uma fração de camundongos jovens23. Este estudo prévio demonstrou que tanto a infecção viral quanto a bacteriana alteraram a defesa do hospedeiro: a infecção viral promoveu disseminação bacteriana e a colonização bacteriana prévia prejudicou a capacidade do hospedeiro de controlar os níveis pulmonares de VAI23. O exame da resposta imune revelou que a infecção por IAV diminuiu a atividade antibacteriana dos neutrófilos, enquanto a colonização bacteriana atenuou a resposta do interferon tipo I crítica para a defesa antiviral23. É importante ressaltar que esse modelo reproduzia a suscetibilidade do envelhecimento. Comparados a camundongos jovens, os camundongos velhos apresentaram sinais de doença mais precocemente, apresentaram doença clínica mais grave e sucumbiram à infecção com maior frequência23. O trabalho apresentado neste manuscrito mostra que o grau da doença também é dependente da cepa bacteriana, pois cepas invasivas de pneumococo apresentam disseminação mais eficiente na infecção por IAV, mostram sinais mais evidentes de inflamação pulmonar e resultam em taxas aceleradas de doença em comparação com cepas não invasivas. Assim, este modelo de co-infecção S. pneumoniae/IAV permite o exame detalhado de fatores patogênicos e do hospedeiro e é adequado para estudar respostas imunes a infecções polimicrobianas nas diferentes fases da progressão da doença.
A maioria dos estudos experimentais existentes de co-infecção por S. pneumoniae/IAV baseia-se na entrega bacteriana nos pulmões de camundongos pré-infectados com IAV. Esses modelos têm auxiliado na identificação de alterações no ambiente pulmonar e na resposta imune sistêmica que tornam o hospedeiro suscetível à infecção bacteriana secundária15,16,17,32,33,34,35,36,37. No entanto, esses modelos falharam em mimetizar a transição de S. pneumoniae de um colonizador assintomático para um patógeno capaz de causar infecções pulmonares e sistêmicas graves. Além disso, esses modelos não são adequados para estudar os fatores do hospedeiro e as interações patógeno-hospedeiro no trato respiratório superior que contribuem para a suscetibilidade à infecção. Um modelo prévio para o movimento de pneumococos da nasofaringe para o pulmão após a infecção por IAV baseava-se em infecção bacteriana da nasofaringe seguida de infecção viral. No entanto, não conseguiu reproduzir os sinais graves da doença observados em pacientes humanos21. O modelo de infecção murina modificado descrito aqui recapitula a transição de S. pneumoniae de carreador assintomático para patógeno causador de doença clínica grave.
Uma etapa crítica desse modelo é o estabelecimento da infecção por S. pneumoniae na nasofaringe. Streptococcus pneumoniae forma biofilmes e coloniza a nasofaringe em diferenteseficiências 21,38. Para estabelecer infecção consistente, são necessárias pelo menos 5 × 106 UFC das cepas bacterianas cultivadas em biofilme testadas até o momento23. Recomenda-se que qualquer nova cepa bacteriana seja testada para infecção estável da nasofaringe antes da infecção viral. Para a coinfecção viral, estudos prévios constataram que a infecção intranasal com IAV é necessária para a dispersão da bactéria da nasofaringe21,22,23. Nesses estudos anteriores, 500 UFP de IAV para parto intranasal foram utilizadas, enquanto neste estudo, 200 UFP foram suficientes para aumentar o número de bactérias na nasofaringe. A infecção pelo VAI não se limita às vias aéreas superiores e pode se disseminar para os pulmões39,40, o que é fundamental para tornar o ambiente pulmonar mais permissivo à infecção bacteriana15,16,41. A entrega de IAV aos pulmões pode ser alcançada por entrega intranasal ou instalação intratraqueal de camundongos anestesiados. Trabalhos anteriores com camundongos BALB/cByJ descobriram que o parto intranasal resulta em pneumonia viral21; no entanto, o acesso do inóculo aos pulmões após a inoculação intranasal é mais restrito em camundongos C57BL/6. Em camundongos C57BL/6, a instalação intratraqueal é necessária para a liberação consistente do vírus23. Nesse modelo, a colonização bacteriana prévia acelera a apresentação dos sintomas da doença após a infecção viral23. Como a própria infecção viral pode causar sintomas da doença com potencial variação na cinética, recomenda-se primeiro testar um intervalo de doses para qualquer nova cepa viral testada e escolher uma dose que revele cinética acelerada em hospedeiros coinfectados.
Os pulmões fornecem outra leitura crítica para a avaliação da doença neste modelo. Para a avaliação da carga de patógenos e do influxo de células imunes, um pulmão do mesmo camundongo pode ser usado. No entanto, como a gravidade da infecção e da inflamação pode diferir entre os lobos, recomenda-se não tomar lobos diferentes do mesmo pulmão para as várias avaliações. Em vez disso, todos os lóbulos podem ser picados em pequenos pedaços, misturados bem juntos e, em seguida, analisados igualmente para as diferentes avaliações. Da mesma forma, a nasofaringe pode ser usada para a enumeração de UFC bacteriana ou PFU viral e resposta imune. No entanto, o número de células obtidas das lavagens e do tecido é muito baixo para realizar citometria de fluxo sem agrupar as amostras de camundongos dentro do mesmo grupo. Alternativamente, a inflamação na nasofaringe pode ser avaliadahistologicamente23.
Uma característica crítica desse modelo é que ele recapitula a doença clínica observada nos pacientes. Em humanos, a pneumonia pneumocócica secundária após infecção por VAI frequentemente resulta em sinais óbvios da doença, incluindo tosse, dispneia, febre e dores musculares que podem levar a hospitalizações, insuficiência respiratória e até morte 8,15,42,43. Este modelo recapitula os sinais graves de doença clínica observados em humanos em termos de dificuldade em respirar (refletida no escore respiratório) e mal-estar geral (refletido nos escores de postura e movimento) exibidos pelos camundongos, bem como morte em alguns dos controles jovens saudáveis. Os sintomas exacerbados da doença em camundongos co-infectados são provavelmente resultado tanto da disseminação bacteriana para os pulmões quanto da depuração viral prejudicada em camundongos com carreamento pneumocócico23. Uma limitação do modelo é que a incidência de doença clínica e disseminação bacteriana da nasofaringe varia entre camundongos e é influenciada pela cepa bacteriana, idade do hospedeiro e genótipo21,22,23. Refletindo isso, para cepas invasivas, a progressão de infecção localizada (sem bacteremia detectável) para morte pode ocorrer dentro de 24 h. Portanto, para uma verdadeira avaliação da disseminação sistêmica, a bacteremia deve ser acompanhada em intervalos mais curtos (a cada 6-12 h). Da mesma forma, o escore da doença pode mudar rapidamente, particularmente nas primeiras 72 h após a coinfecção. Portanto, para acompanhar de perto os sintomas da doença, é aconselhável monitorar camundongos três vezes por dia durante os dias 1-3 após a infecção por IAV.
Em resumo, esse modelo replica o movimento de S. pneumoniae de um colonizador assintomático da nasofaringe para um patógeno capaz de causar doença pulmonar e sistêmica na infecção por IAV. Nesse modelo, o IAV desencadeia a transição de S. pneumoniae modificando o comportamento bacteriano na nasofaringe, aumentando a disseminação bacteriana para o pulmão e alterando a imunidade antibacteriana23. Da mesma forma, o carreamento bacteriano atenua as respostas imunes antivirais e prejudica a depuração do IAV dos pulmões23. Isso torna esse modelo ideal para analisar mudanças nas respostas imunes em infecções únicas versus polimicrobianas. Além disso, o curso da doença após a coinfecção é, em parte, dependente da cepa de pneumococo presente na nasofaringe. Portanto, o modelo é adequado para dissecar os fatores bacterianos necessários para a colonização assintomática versus transição patogênica de S. pneumoniae. Por fim, esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento a coinfecções e, embora não tenha sido testado aqui, pode ser facilmente usado para avaliar o impacto do background do hospedeiro no curso da doença. Em conclusão, separar carreador e doença em etapas distintas oferece a oportunidade de analisar as variantes genéticas tanto do patógeno quanto do hospedeiro, permitindo o exame detalhado das interações de um importante patobionte com o hospedeiro em diferentes fases da progressão da doença. No futuro, esse modelo pode ser usado para adaptar opções de tratamento para hospedeiros vulneráveis.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Nick Lenhard pela leitura crítica e edição deste manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Andrew Camilli e Anthony Campagnari pelas cepas bacterianas e Bruce Davidson pelas cepas virais. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) para J.L. e pelo National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) para E.N.B.G.
4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
BD Fortessa | Flow cytometer | ||
BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
MilQ water | Ultra-pure water | ||
Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |