Summary
L'avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l'isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.
Abstract
Comprendere l'intero processo della follicologenesi dei mammiferi è fondamentale per migliorare le tecnologie di riproduzione assistita nel bestiame, negli esseri umani e nelle specie in via di estinzione. La ricerca è stata per lo più limitata ai follicoli antrali e ai grandi follicoli preantrali a causa della difficoltà nell'isolamento dei follicoli preantrali più piccoli, specialmente nei grandi mammiferi come le specie bovine. Questo lavoro presenta un approccio efficiente per recuperare un gran numero di piccoli follicoli preantrali da un singolo ovaio bovino. La corteccia delle singole ovaie bovine è stata tagliata in cubi da 500 μm utilizzando un trinciatutto di tessuto e omogeneizzata per 6 minuti a 9.000-11.000 giri / min utilizzando una sonda da 10 mm. I detriti di grandi dimensioni sono stati separati dall'omogenato usando un panno di formaggio, seguito da una filtrazione seriale attraverso filtri cellulari da 300 μm e 40 μm. Il contenuto trattenuto nel filtro da 40 μm è stato risciacquato in un piatto di ricerca, dove i follicoli sono stati identificati e raccolti in una goccia di mezzo. La vitalità dei follicoli raccolti è stata testata tramite colorazione blu tripano. Questo metodo consente l'isolamento di un gran numero di piccoli follicoli preantrali vitali da un singolo ovaio bovino in circa 90 minuti. È importante sottolineare che questo metodo è interamente meccanico ed evita l'uso di enzimi per dissociare il tessuto, che può danneggiare i follicoli. I follicoli ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per applicazioni a valle come l'isolamento dell'RNA per RT-qPCR, l'immunolocalizzazione di proteine specifiche e la coltura in vitro .
Introduction
I follicoli ovarici sono le unità funzionali dell'ovaio, responsabili della produzione del gamete (ovocita) e degli ormoni critici per la funzione riproduttiva e la salute generale. I follicoli primordiali si formano nell'ovaio durante lo sviluppo fetale o nel periodo neonatale a seconda della specie1 e costituiscono la riserva ovarica di una femmina. La crescita follicolare inizia con l'attivazione dei follicoli primordiali che lasciano il pool di riposo ed entrano nella fase di crescita. La follicologenesi preantrale, che comprende tutti gli stadi follicolari prima dello sviluppo dell'antro, è un processo altamente dinamico che richiede cambiamenti morfologici e metabolici sincroni nell'ovocita e nelle cellule della granulosa circostante, guidati da una stretta comunicazione tra questi due tipi di cellule 2,3. I follicoli preantrali costituiscono la maggior parte delle unità follicolari presenti nell'ovaio in un dato momento4. Lo sviluppo attraverso gli stadi preantrali della follicologenesi è stimato in diverse settimane più lungo dello sviluppo antrale 5,6, e questo tempo è necessario affinché l'ovocita e le cellule somatiche acquisiscano una maturità sufficiente per entrare nella fase finale di sviluppo (cioè la fase antrale) e prepararsi per l'ovulazione, la fecondazione e lo sviluppo embrionale 7,8,9.
Gran parte delle attuali conoscenze sulla follicologenesi preantrale ovarica proviene dai modelli murini10,11,12,13, dovuta in parte alla facilità nel recuperare un gran numero di questi follicoli da un ovaio più piccolo e meno fibroso. Sebbene le segnalazioni di isolamento di un gran numero di follicoli preantrali dalle ovaie bovine risalgano a circa 30 anni14, una comprensione più completa dei processi che regolano lo sviluppo di questi follicoli in fase iniziale è rimasta irrealizzata, in gran parte a causa della mancanza di metodi ottimizzati, efficienti e ripetibili per recuperare un numero sufficiente di follicoli preantrali vitali, in particolare nelle prime fasi dello sviluppo. Con il crescente interesse a preservare la riserva ovarica per un uso futuro nella riproduzione assistita nell'uomo, le mucche diventano un modello attraente grazie alla loro struttura ovarica più simile15. Tuttavia, l'ovaio bovino è marcatamente più ricco di collagene rispetto all'ovaio di topo16, rendendo l'isolamento meccanico utilizzando i metodi descritti per il topo molto inefficiente. Gli sforzi per espandere le tecniche di conservazione della fertilità includono la crescita completa in vitro dei follicoli preantrali allo stadio antrale, seguita dalla maturazione in vitro (IVM) degli ovociti chiusi, dalla fecondazione in vitro (IVF) e dalla produzione e trasferimento di embrioni17. Finora, l'intero processo è stato raggiunto solo nei topi18. Nei bovini, il progresso verso la crescita del follicolo in vitro è limitato a pochi rapporti con stadi follicolari variabili all'inizio della coltura, così come lunghezza variabile della coltura tra i protocolli17,19.
I metodi descritti in letteratura per il prelievo di follicoli preantrali dall'ovaio bovino hanno utilizzato principalmente tecniche meccaniche ed enzimatiche, isolate o in combinazione 2,14,17,20. Il primo rapporto di un protocollo per l'isolamento del follicolo preantrale bovino ha utilizzato un omogeneizzatore tissutale e una filtrazione seriale per elaborare le ovaie intere20. Questo studio è stato seguito da rapporti che combinano procedure meccaniche ed enzimatiche che utilizzavano la collagenasi14. Un tema ricorrente quando si utilizza la collagenasi per digerire il tessuto ovarico è il potenziale rischio di danni alla membrana basale follicolare, che può compromettere la vitalità del follicolo 14,21,22,23. Pertanto, sono state impiegate diverse combinazioni di metodi meccanici, come l'uso di un trinciatutto e pipettaggio ripetuto o di un trinciatutto combinato con omogeneizzazione20,24,25,26. Un'altra tecnica meccanica che è stata descritta utilizza aghi per sezionare i follicoli preantrali direttamente dal tessuto ovarico, che è particolarmente utile per isolare follicoli secondari più grandi (>200 μm). Tuttavia, questo processo richiede tempo, è inefficiente per isolare i follicoli preantrali più piccoli ed è dipendente dalle competenze quando viene tentato nelle ovaie bovine 19,27,28.
Sfruttando le diverse tecniche descritte in letteratura, questo protocollo mirava a ottimizzare l'isolamento dei follicoli preantrali dalle singole ovaie bovine in modo semplice, coerente ed efficiente che eviti l'incubazione in soluzioni enzimatiche. Il miglioramento dei metodi per isolare i follicoli preantrali fornirà l'opportunità di migliorare la comprensione di questo stadio della follicologenesi e consentirà lo sviluppo di sistemi di coltura efficaci per sviluppare follicoli preantrali allo stadio antrale. Le procedure dettagliate qui descritte per l'isolamento dei follicoli preantrali da un grande mammifero come la specie bovina saranno vitali per i ricercatori che mirano a studiare la follicologenesi precoce in una specie non murina che è traducibile per l'uomo.
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Protocol
Le ovaie bovine (Bos taurus) sono state prelevate da un mattatoio locale e trasportate al laboratorio entro 6 ore dalla raccolta. A causa del gran numero di animali lavorati nella struttura, l'età, la razza e lo stadio del ciclo di estro degli animali sono sconosciuti. Poiché in questi esperimenti non sono stati utilizzati animali vivi, non è stato richiesto un protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione delle attrezzature e dei reagenti
- Coprire una sezione larga 2 piedi di un banco da laboratorio con carta da banco.
- Procurarsi un manico di bisturi, una lama sterile per bisturi, un emostato, un paio di pinze da dissezione, una siringa luer-lock da 20 ml, un ago da 18 G, due becher da 200 ml, un matraccio Erlenmeyer da 500 ml, un imbuto di plastica da 104 mm di diametro, un tagliere di plastica, uno strato di garza da 22 cm2 (la garza può essere sterilizzata in autoclave prima dell'uso) per ovaio in lavorazione, un filtro cellulare da 300 μm e un filtro cellulare da 40 μm (vedi Tabella dei materiali).
- Trasferire tutte le attrezzature sulla carta da banco.
- Utilizzare l'emostatico per infilare la lama del bisturi sul manico del bisturi. Allineare la base angolata della lama all'indicatore angolato sull'impugnatura, quindi far scorrere la lama nella scanalatura dell'impugnatura.
- Posizionare l'imbuto nel pallone Erlenmeyer e coprire l'apertura dell'imbuto con la garza.
- Introdurre un tubo conico da 50 mL per ovaio da trattare in un bagno d'acqua o di perline impostato a 38,5 °C.
- Posizionare una capsula di Petri quadrata di 100 x 15 mm per ovaia in lavorazione su uno scalda vetrino impostato a 38,5 °C.
- Aggiungere 10 ml di penicillina-streptomicina (PenStrep; 10.000 U/mL di penicillina e 10.000 μg/mL di streptomicina) a 1 L di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS). Riscaldare PBS + PenStrep in un bagno d'acqua o di perline impostato a 38,5 °C almeno 2 ore prima della lavorazione delle ovaie.
NOTA: la soluzione PBS + PenStrep è indispensabile per il lavaggio delle ovaie quando i follicoli isolati saranno coltivati ed è ancora raccomandata per qualsiasi esperimento a valle per mitigare la contaminazione microbica. - Per la raccolta del filtrato ovarico trattato, utilizzare Follicle Wash Medium (FWM) costituito da TCM199 con sali di Hank (vedi tabella dei materiali) contenente 3 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA), 25 mM di tampone HEPES, 100 UI di penicillina/100 μg/mL di streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio (NaPyr) e 100 nM di aminoacidi non essenziali (NEAA).
- Trasferire il TCM199 sterile, un flacone da 250 ml e un cilindro graduato da 100 ml in un armadio di biosicurezza (BSC). Trasferire 194 mL di TCM199 nel flacone.
- Rimuovere il becher di TCM199 dalla BSC e portare su una piastra di agitazione. Aggiungere 600 mg di BSA, 1,19 g di tampone HEPES e una barra di agitazione autoclavata al flacone e mescolare fino a quando non si scioglie.
- Una volta che il tampone BSA e HEPES si sono completamente sciolti, aggiungere 1 N idrossido di sodio (NaOH) al mezzo fino a raggiungere un pH di 7,6-7,8, misurato da un pHmetro.
- Pulire la bottiglia di mezzo, un dispositivo di filtrazione del vuoto, quattro tubi conici da 50 ml e le bottiglie di PenStrep, NaPyr e NEAA con etanolo al 70% prima di trasferirle alla BSC.
- Aggiungere 2 ml ciascuno di PenStrep (10.000 U/mL di penicillina e 10.000 μg/mL di streptomicina), 100 mM di NaPyr e 100x NEAA al flacone di TCM199 + 3 mg/mL di BSA + 25 mM HEPES. Filtrare sterile il mezzo finale e l'aliquota nei tubi conici da 50 ml. Conservare il fluido a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Riscaldare un tubo conico da 50 mL di mezzo per due ovaie in un bagno di perline impostato a 38,5 °C almeno 1 ora prima della lavorazione delle ovaie.
2. Configurazione del trinciatutto
- Assicurarsi che il trituratore di tessuti (vedere la tabella dei materiali) sia collegato e acceso.
- Impostare lo spessore della fetta su 500 μm, la manopola di controllo della forza della lama su 20° e la manopola di controllo della velocità su 90° in base alle specifiche del produttore.
- Inserire una capsula di Petri in plastica da 60 mm nel portapiatti e inserire il portapiastre sul suo palco.
- Sollevare il braccio di taglio il più in alto possibile ruotando la manopola di azionamento manuale in senso orario.
- Usando una pinza, posizionare una lama di rasoio a doppio taglio (vedi Tabella dei materiali) sulla vite inserita nel braccio di taglio. Posizionare la chiusura della lama sopra la lama e fissare con la rondella e il dado. Lasciare il dado un quarto di giro sciolto.
- Ruotare la manopola di azionamento manuale fino a quando il braccio di taglio fa scattare la lama piatta sulla piastra di Petri. Stringere il dado per il resto del percorso con il cacciatore di dadi.
- Sollevare il braccio di taglio più in alto che andrà usando la manopola di azionamento manuale. Spostare la manopola di rilascio del tavolo completamente a sinistra fino a quando non si incera in posizione.
3. Preparazione delle ovaie
- Trasferire le ovaie in laboratorio a PBS + PenStrep sterili caldi (38,5 °C).
NOTA: Si raccomanda di elaborare le ovaie per l'isolamento del follicolo non appena è possibile dopo la rimozione dall'animale. In questo protocollo, le ovaie sono state lavorate entro 6 ore dalla raccolta. Le ovaie sono state trasportate dal macello al laboratorio in thermos contenenti soluzione salina sterile allo 0,9% a circa 38,5 °C. - Se possibile, selezionare ovaie piccole (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) contenenti follicoli antrali piccoli (3-5 mm), follicoli antrali grandi (≥8 mm) e nessun corpo luteo prominente (Figura 1). Questi criteri sono raccomandati per garantire che una quantità minima di detriti non follicolari, come le cellule stromali e la matrice extracellulare, sia inclusa nel piatto quadrato risultante contenente follicoli isolati.
NOTA: I follicoli antrali possono essere identificati come strutture vescicolari sferiche piene di liquido sulla superficie dell'ovaio. I corpi lutei possono essere identificati come strutture rigide rosse, arancioni o gialle che sporgono dalla superficie dell'ovaio. - Utilizzare le forbici per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo in eccesso e grasso dalle ovaie.
- Lavare le ovaie per 30 s in etanolo al 70% in un becher.
- Lavare le ovaie 3 volte per 2 minuti ciascuna in bicchieri di PBS + PenStrep caldo (38,5 °C), utilizzando PBS + PenStrep fresco per ogni lavaggio.
- Conservare le ovaie in PBS + PenStrep caldo (38,5 °C) fino al momento della lavorazione.
NOTA: La distanza tra il laboratorio e la fonte ovarica può essere variabile. Pertanto, è importante completare il protocollo in modo tempestivo per garantire il mantenimento della vitalità follicolare.
Figura 1: Anatomia dell'ovaio bovino. L'ovaio bovino è costituito da due regioni principali racchiuse in uno strato epiteliale. La corteccia, composta dal tessuto a sinistra della linea tratteggiata, contiene follicoli ovarici dallo stadio primordiale allo stadio antrale. I follicoli preantrali sono troppo piccoli per essere visti ad occhio nudo; I follicoli antrali sono contrassegnati da asterischi. Il midollo, costituito dal tessuto a destra della linea tratteggiata, contiene vasi sanguigni, vasi linfatici e nervi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Procedura di taglio
NOTA: elaborare solo un'ovaia alla volta. Elaborare rapidamente le ovaie per evitare diminuzioni di temperatura, che possono influire sulla vitalità del follicolo.
- Trasferire un'ovaia sul tagliere sulla carta da banco (Figura 2A) e preparare il trinciatutto (Figura 2B).
- Usando una pinza e un bisturi, tagliare l'ovaio a metà e rimuovere il midollo da ciascuna metà, lasciando solo la corteccia ad uno spessore di circa 1 mm come mostrato nella Figura 2C.
- Tagliare l'ovaia a metà longitudinalmente da un sito di attacco del legamento al sito di attacco opposto.
- Tenere una metà dell'ovaio sul tagliere da lavorare e riposizionare l'altra metà dell'ovaia in PBS + PenStrep caldo (38,5 ° C).
- Con il midollo esposto rivolto verso l'alto, tagliare lungo la curvatura dell'ovaio a circa 2 mm di distanza dalla superficie dell'ovaio senza tagliare la corteccia.
- Usa la fetta lungo la curvatura dell'ovaio come guida per approfondire la fetta, seguendo ancora la curvatura dell'ovaio per separare la corteccia dal midollo.
- Sezionare e scartare qualsiasi corpora lutea dall'ovaio tagliando lungo il bordo del corpo luteo.
- Capovolgere la metà dell'ovaio in modo che l'epitelio sia rivolto verso l'alto e utilizzare il bisturi per finire di tagliare il midollo lontano dalla corteccia. Tagliare via qualsiasi tessuto connettivo bianco residuo attorno al bordo del pezzo ovarico che era collegato ai legamenti.
- Una volta rimossa la maggior parte del midollo, utilizzare il bisturi per tagliare la corteccia a circa 1 mm di spessore. Manipola il bisturi con piccoli movimenti avanti e indietro per radere via il resto del midollo.
NOTA: Il midollo è la porzione interna dell'ovaio contenente grandi vasi sanguigni. La corteccia è la porzione esterna dell'ovaio, che si trova direttamente sotto l'epitelio superficiale più esterno. La corteccia ha uno spessore di circa 1 mm nell'ovaio bovino, e quindi tagliare l'ovaio ad uno spessore di 1 mm rimuoverà il midollo.
- Tagliare la corteccia in pezzi non più grandi di 2,5 cm x 2,5 cm. Conservare i pezzi di corteccia in PBS + PenStrep caldo (38,5 ° C) fino al momento di tritare.
- Riempire un becher con almeno 50 ml di PBS + PenStrep caldo (38,5 °C) e ottenere una pipetta di trasferimento in plastica.
- Trasferire un singolo pezzo di corteccia nella capsula di Petri sul tritatutto e bagnare il tessuto con tre o quattro gocce di PBS + PenStrep caldo (38,5 °C).
- Tenere fermo il pezzo di tessuto con un paio di pinze e premere una volta il pulsante di reset per avviare il tritatutto di tessuto. Stabilizzare la piastra di Petri con una mano continuando a stabilizzare il tessuto con la pinza. Spostare la pinza a sinistra lungo il tessuto secondo necessità per evitare che la lama colpisca la pinza. Le strisce risultanti saranno lunghe circa 500 μm.
- Una volta che l'intero pezzo di corteccia è stato tagliato a strisce, utilizzare la manopola del supporto della lama per sollevare la lama dalla piastra di Petri e la pinza per rimuovere qualsiasi tessuto dalla lama.
- Ruotare il portapiastra di 90°.
- Premere una volta il pulsante di ripristino. Stabilizzare la piastra di Petri con una mano mentre si utilizza la pinza per spingere le strisce di tessuto nel percorso della lama.
- Passare la lama interamente attraverso le strisce di tessuto. Utilizzare la manopola del supporto della lama per sollevare la lama dalla piastra di Petri e la pinza per rimuovere qualsiasi tessuto dalla lama.
- Utilizzare la pipetta di trasferimento e riscaldare (38,5 °C) PBS + PenStrep per lavare il tessuto tritato (dimensione finale del tessuto: cubetti da 500 μm x 500 μm x 1 mm) in un tubo conico preriscaldato (38,5 °C) da 50 ml. Riportare il tubo conico nell'acqua o nel bagno di perline per mantenere caldo il tessuto tritato (38,5 °C).
- Utilizzare il cacciatore per rimuovere il dado dal braccio di taglio e rimuovere la rondella e la chiusura della lama. Usando una pinza, rimuovere la lama dal braccio di taglio, capovolgerla in modo che il bordo inutilizzato sia rivolto verso la capsula di Petri e riposizionarla sul braccio di taglio. Riposizionare la chiusura della lama, la rondella e il dado e reimpostare la manopola di rilascio del tavolo come descritto nei passaggi 2.5-2.7.
- Ripetere i passaggi 4.5-4.12 per tutti i restanti pezzi di corteccia dall'ovaio, sostituendo le lame con quelle nuove dopo che ogni tagliente è stato utilizzato.
- Smaltire tutte le lame usate in un contenitore di plastica con pareti rigide.
5. Procedura di omogeneizzazione
- Assicurarsi che l'unità omogeneizzatore (vedere la tabella dei materiali) sia collegata e che la velocità sia impostata sulla seconda barra (9.000-11.000 giri/min). Inserire la sonda del generatore da 10 mm nell'unità secondo le specifiche del produttore.
- Impostare un timer per 1 minuto e inserire la sonda nel tubo conico da 50 mL contenente il tessuto della corteccia tritato da un'ovaia (passo 4.11) e abbastanza PBS + PenStrep per riempire il tubo fino alla linea da 25 ml. La profondità a cui è inserita la sonda deve essere 1/3 dell'altezza del liquido misurata dal fondo della camera. Posizionare la sonda leggermente fuori centro per ridurre al minimo il vortice.
- Avviare il timer e accendere l'omogeneizzatore. Assicurarsi che la parte inferiore della sonda non tocchi il tubo e tenerlo fermo mentre l'omogeneizzatore è acceso.
- Dopo 1 minuto di omogeneizzazione, rimuovere la sonda dal tubo. Utilizzando una pinza, rimuovere il tessuto connettivo che ostruisce i fori di sfiato e lo spazio tra il coltello del rotore e il tubo del rotore. Se alcuni pezzi di corteccia sono bloccati nella sonda, rimuoverli con una pinza e rimetterli nel tubo.
- Ripetere i passaggi 5.2-5.4 in altre 5 volte per un totale di 6 minuti di omogeneizzazione.
- Posizionare il tubo con tessuto omogeneizzato nell'acqua o nel bagno di perline per mantenere il tessuto caldo (38,5 °C). Dopo aver elaborato l'ultima ovaia, smontare, pulire e asciugare immediatamente la sonda del generatore secondo le specifiche del produttore.
6. Procedura di filtrazione
- Versare il tessuto disperso nell'imbuto ricoperto di garza inserito nel matraccio di Erlenmeyer. Risciacquare il contenuto del tubo nell'imbuto usando PBS + PenStrep caldo (38,5 °C) fino a quando non rimangono frammenti di tessuto nel tubo.
- Forzare i frammenti di tessuto a passare attraverso i fori del panno ruotando la garza attorno ai frammenti di tessuto e schiacciando fino a quando tutto il liquido e il tessuto in eccesso vengono rimossi dalla garza.
- Riaprire la garza sull'imbuto, sciacquare la garza con PBS + PenStrep utilizzando una pipetta di trasferimento e spremere nuovamente eventuali frammenti di tessuto residui attraverso il panno.
- Utilizzare un emostatico per tenere il filtro cellulare da 300 μm su un becher da 200 ml. Versare il filtrato nel matraccio di Erlenmeyer attraverso il filtro cellulare. Risciacquare il contenuto del matraccio nel filtro cellulare utilizzando PBS + PenStrep caldo (38,5 °C) fino a quando non rimangono frammenti di tessuto.
- Se il filtro cellulare si intasa di tessuto, picchiettare delicatamente il filtro cellulare contro il becher per assicurarsi che tutto il liquido sia filtrato nel becher e quindi capovolgere il filtro cellulare e toccare i detriti di tessuto di grandi dimensioni sulla carta da banco. Riportare il filtro cellulare sul becher e continuare a versare il filtrato attraverso di esso. Se necessario, ripetere fino a filtrare tutti i filtrati del matraccio di Erlenmeyer.
- Utilizzare un emostatico per tenere il filtro cellulare da 40 μm su un secondo becher da 200 ml. Versare il filtrato nel primo becher da 200 ml attraverso il filtro cellulare. Risciacquare il contenuto del becher nel filtro cellulare utilizzando PBS + PenStrep caldo (38,5 °C) fino a quando non rimangono frammenti di tessuto. Non gettare il contenuto del filtro cellulare da 40 μm.
- Inserire l'ago da 18 G nella siringa da 20 ml. Riempire la siringa con FWM. Capovolgere il filtro cellulare da 40 μm su una capsula di Petri quadrata e utilizzare la siringa per lavare il contenuto del filtro cellulare nel piatto. Riempire la siringa e sciacquare il filtro cellulare secondo necessità fino a quando non rimangono frammenti di tessuto.
NOTA: In genere, 25 ml di FWM sono sufficienti per risciacquare completamente il contenuto del filtro cellulare da 40 μm.
Figura 2: Configurazione dell'area di lavoro per l'elaborazione delle ovaie e il flusso di lavoro del protocollo . (A) Configurazione del banco per tagliare le ovaie prima di tagliarle e per filtrare l'omogenato ovarico. (B) Impianto di trinciatrici e omogeneizzatori di tessuto, con supporto in polistirolo per ridurre le vibrazioni dello stadio omogeneizzatore. (C) Schema che illustra il flusso di lavoro per la lavorazione di un'ovaia intera. Le ovaie vengono rifilate del tessuto connettivo in eccesso e quindi tagliate a metà, e il midollo viene rimosso fino a quando rimane una fetta di corteccia spessa ~ 1 mm. La corteccia viene tagliata in pezzi di 2,5 cm x 2,5 cm e tritata in un trinciatutto di tessuto impostato a un intervallo di taglio di 500 μm. I pezzi vengono quindi omogeneizzati e l'omogenato viene filtrato attraverso una garza seguita dalla filtrazione attraverso filtri cellulari da 300 μm e 40 μm. Il contenuto del filtro cellulare da 40 μm viene risciacquato in una capsula di Petri quadrata, che viene ricercata per i follicoli usando uno stereomicroscopio. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
7. Ricerca e raccolta dei follicoli
- Trasferire la capsula di Petri quadrata (punto 6.6) su uno stereoscopio con un palco riscaldato impostato a 38,5 °C. L'ingrandimento dello stereoscopio deve essere impostato tra 1,25x e 3,2x a seconda delle preferenze del ricercatore.
- Pipettare 10 μL di gocce di FWM in una capsula di Petri da 60 mm e coprire le gocce con olio minerale per evitare che si secchi. Posizionare la capsula di Petri con gocce di fluido su una piastra riscaldante impostata a 38,5 °C.
NOTA: una piastra a 4 pozzetti può essere utilizzata per raccogliere i follicoli. Aggiungere 500 μL di materiale di lavaggio in uno o due pozzetti. Posizionare sulla piastra riscaldante a 38,5 °C. - Procurarsi uno stantuffo e una punta per micropipette.
NOTA: Si raccomanda una micropipetta in vetro da 1-5 μL (vedere Tabella dei materiali) perché è meno probabile che i follicoli aderiscano alla pipetta di vetro e vadano persi quando vengono trasferiti tra le soluzioni. È anche uno strumento abbastanza piccolo da consentire micromanipolazioni più facili e precise dei follicoli. - Identificare i follicoli dalla capsula di Petri quadrata e trasferire le gocce di media (FWM) utilizzando la micropipetta. È probabile che molti follicoli siano incorporati nei detriti tissutali e possano essere recuperati utilizzando uno dei due metodi descritti di seguito.
NOTA: I follicoli sono oblunghi, piuttosto che sfere perfette, e tipicamente hanno un ovocita, che si presenta come un cerchio bianco solido in contrasti più scuri, verso il centro del follicolo (Figura 3A-C). Fare attenzione a non confondere i follicoli con gli ovociti denudati. Gli ovociti tendono ad essere sfere perfette e sono circondati da una membrana spessa e chiara (la zona pellucida). Un microscopio invertito con un ingrandimento di 10x (o superiore) può essere utilizzato per un esame più approfondito dei follicoli (Figura 3D).- Separare accuratamente i follicoli dai detriti usando la punta della micropipetta o aghi sottili (27 G).
- In alternativa, utilizzare una pipetta Pasteur di vetro con un bulbo di gomma per raccogliere e spruzzare i detriti nel piatto più volte per rimuovere i follicoli dai detriti.
- Lavora rapidamente, impiegando non più di 30 minuti, per cercare la capsula di Petri per aiutare a preservare la vitalità del follicolo.
- Posizionare un massimo di soli cinque follicoli per 10 μL di goccia, poiché una densità più elevata può aumentare la probabilità che i follicoli aderiscano insieme.
8. Test di fattibilità di esclusione del blu di Trypan
NOTA: Utilizzare il coperchio di una capsula di Petri o una piastra a 4 pozzetti per tutti i passaggi successivi, poiché i follicoli aderiscono meno alla plastica del coperchio rispetto alla plastica del piatto reale.
- Preparare PBS + 0,2% polivinilpirrolidone (PVP) sciogliendo 100 mg di PVP in 50 ml di PBS.
NOTA: PVP viene utilizzato qui per ridurre la probabilità che i follicoli si attacchino al piatto. - Utilizzare la micropipetta per trasferire tutti i follicoli (media di 40) dalle gocce di media in una goccia di 50 μL di PBS + 0,2% PVP.
- Lavare i follicoli 2 volte trasferendoli sequenzialmente su gocce fresche da 50 μL di PBS + 0,2% PVP.
- Trasferire i follicoli a una caduta di 285 μL di PBS + 0,2% PVP.
- Aggiungere 15 μL di blu tripano alla goccia di 285 μL di PBS + 0,2% PVP (concentrazione finale di 0,05% di tripano blu) e mescolare accuratamente la goccia utilizzando una punta di pipetta da 200 μL impostata su 100 μL.
NOTA: Se si utilizza la piastra a 4 pozzetti per il test di vitalità del tripano, aggiungere 475 μL di PBS + 0,2% PVP e 25 μL di blu tripano in un pozzetto. - Incubare i follicoli per 1 minuto nella goccia blu di tripano, quindi trasferire i follicoli in una goccia di 50 μL (o pozzo da 500 μL) di PBS + 0,2% PVP.
- Lavare i follicoli 3 volte secondo il passaggio 8.3 con gocce fresche da 50 μL (o 500 μL per pozzetto) di PBS + 0,2% PVP.
- Scartare tutti i follicoli che appaiono ancora blu dopo tre lavaggi in PBS + 0,2% PVP, poiché questi non sono vitali. Tutti i follicoli che non mantengono la colorazione blu dopo tre lavaggi sono vitali e possono essere utilizzati per immunofluorescenza, coltura o altre procedure (Figura 3E). Congelare i follicoli in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo, se necessario.
- Eseguire l'analisi RT-qPCR e la colorazione immunofluorescenza dei follicoli come descritto nei passaggi 9 e 10.
Figura 3: Follicoli isolati e test di esclusione del blu tripano. (A-C) I follicoli isolati sono stati ripresi attraverso uno stereomicroscopio a diversi ingrandimenti. (A) Follicoli isolati tra i detriti all'interno del piatto di ricerca iniziale. I singoli follicoli sono cerchiati in rosso. Barra della scala = 2.000 μm. (B) Follicoli isolati e detriti all'interno di una goccia di mezzo di lavaggio follicolo coperto di olio minerale. Barra di scala = 1.000 μm. (C) Follicoli isolati senza detriti ad un ingrandimento maggiore. Barra di scala = 1.000 μm. (D) Follicoli isolati ripresi utilizzando un microscopio a campo luminoso invertito. Barra della scala = 100 μm. (E) Immagini rappresentative di follicoli vitali (non colorati) e non vitali (macchie blu) ripresi utilizzando un microscopio a campo luminoso invertito e un obiettivo 20x. Barra di scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
9. Analisi RT-qPCR
- Isolare l'RNA dai follicoli vitali (dal punto 8.8) usando un reagente di isolamento dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali). Purificare l'RNA e trattare con DNasi utilizzando un kit di pulizia disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Eluire l'RNA con 14 μL di acqua priva di RNasi e quantificare utilizzando uno spettrofotometro. L'RNA può essere conservato a -80 °C fino alla sintesi del cDNA.
- Eseguire la sintesi del cDNA da quantità uguali di RNA estratto dai follicoli primari e secondari precoci, utilizzando un kit di sintesi del cDNA disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Incubare la miscela di reazione per 5 minuti a 25 °C seguita da 60 minuti a 42 °C, quindi terminare la reazione riscaldando a 70 °C per 5 minuti.
- Eseguire RT-qPCR con il cDNA sintetizzato (5 ng per reazione) e primer (Tabella 1) utilizzando un mix di reazioni disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare condizioni di ciclo termico: 30 s a 95 °C per l'attivazione della polimerasi, seguiti da 40 cicli di amplificazione, dove ogni ciclo includeva 15 s a 95 °C per la denaturazione e 30 s a 60 °C per la ricottura/estensione. Analizzare l'RT-qPCR quantificando i valori di soglia del ciclo (Ct) e/o visualizzare i prodotti PCR utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
NOTA: L'espressione del trascritto del marcatore delle cellule granulari FSHR e del marcatore delle cellule germinali DAZL sono stati valutati in questo studio. I geni di riferimento erano H2A e ACTB. - Eseguire un'analisi della curva di fusione aumentando la temperatura da 65 °C a incrementi di 0,5 °C ogni 5 s fino a raggiungere 95 °C.
10. Analisi di immunofluorescenza
- Fissare i follicoli vitali (dal punto 8.8) per 15 minuti in una caduta di 100 μL del 4% (v/v) di paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente (RT), seguita da un lavaggio 3x in gocce da 100 μL di PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
- Bloccare i follicoli per 1 ora a RT in un tampone bloccante costituito da 1x PBS + 5% (v/v) siero normale d'asina (NDS). Dopo il blocco, incubare i follicoli per una notte a 4 °C in una caduta di 100 μL di 4 μg/mL di anticorpo CX37 anti-umano di coniglio o 4 μg/mL di isotipo IgG di coniglio (controllo negativo) diluito in tampone bloccante.
- Lavare i follicoli 3 volte in gocce da 100 μL di PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20, quindi incubarli per 1 ora a RT al buio in una goccia di 100 μL di 2 μg / mL di anticorpo secondario AlexaFluor 488 asino-anti-coniglio diluito in tampone bloccante.
- Incubare i follicoli per 5 minuti a RT al buio in una goccia di 100 μL di 1 μg/mL Hoechst 33342 diluito in tampone bloccante per marcare il DNA.
- Trasferire i follicoli su una goccia di 5 μL di supporto di montaggio (vedere Tabella dei materiali) su un vetrino da microscopio di vetro e coprire con un vetrino di copertura. Lasciare i vetrini a polimerizzare a RT durante la notte, quindi sigillare con lo smalto. Conservarli a 4 °C fino all'imaging.
- Immagina tutte le diapositive entro 48 ore dallo scivolamento del coperchio. Eseguire l'imaging utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertita (vedi Tabella dei materiali) sotto filtri DAPI (eccitazione 380 nm ed emissione 450 nm) e FITC (eccitazione 470 nm ed emissione 525 nm).
- Fissare il tempo di esposizione per entrambi i canali. Regolare il tempo di esposizione al FITC (CX37) in base al controllo negativo dell'isotipo del coniglio. Utilizzare un obiettivo 20x e il canale DAPI impostato su 50 ms di tempo di esposizione per identificare i follicoli marcati con isotipo di coniglio.
- Immagina questi follicoli sotto il canale FITC e diminuisci il tempo di esposizione fino a quando tutto il segnale verde di fondo non viene abolito. Notare questo tempo di esposizione.
- Immagine di tutti i follicoli marcati con anticorpi CX37 utilizzando il tempo di esposizione impostato per il canale FITC isotipo e il tempo di esposizione di 50 ms per il canale DAPI.
- Elaborare l'intensità del segnale, misurata dall'area grigia media dopo la soglia, utilizzando un programma di elaborazione delle immagini del computer29 (vedere Tabella dei materiali).
- Regolare il file tiff dell'immagine DAPI per ciascun follicolo in modo che l'intero follicolo sia delineato. Utilizzare la funzione Analizza particelle del programma per selezionare l'intero follicolo come regione di interesse (ROI).
- Aprire il file tiff dell'immagine FITC per il follicolo corrispondente e sovrapporre il ROI generato dall'immagine DAPI sopra l'immagine FITC. Utilizzare la funzione Misura del programma per quantificare l'area grigia media dell'immagine FITC, che rappresenta l'intensità del segnale.
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Representative Results
Panoramica e passaggi critici
Utilizzando questo protocollo, i piccoli follicoli preantrali bovini possono essere isolati in modo affidabile dalle singole ovaie in numeri sperimentalmente rilevanti. Da un totale di 30 repliche, sono stati ottenuti in media 41 follicoli per replica, con un intervallo da 11 a 135 follicoli (Figura 4A). In 14 repliche, i follicoli sono stati caratterizzati per lo stadio di sviluppo come precedentemente descritto26 misurando il diametro del follicolo utilizzando un vetrino di calibrazione al microscopio da 1 μm sotto lo stereomicroscopio. Utilizzando questo metodo, un totale di 476 follicoli sono stati classificati come follicoli primari (follicoli che misurano 40-79 μm), secondari precoci (80-119 μm) o secondari (≥120 μm) (Figura 4B). I follicoli primordiali sono stati esclusi a causa della fase di filtrazione di 40 μm. La vitalità del follicolo è stata valutata utilizzando il test di esclusione del blu tripano come descritto in precedenza30. I follicoli isolati sono stati brevemente incubati per 1 minuto in blu tripano allo 0,05% (v / v) in PBS contenente PVP allo 0,2%, seguiti da tre lavaggi con PBS + PVP ed esame sotto uno stereoscopio. Utilizzando la procedura descritta, il 100% dei follicoli isolati era vitale in tutte le repliche. Nel complesso, il processo di isolamento meccanico, dalla raccolta delle ovaie fino a immediatamente prima della ricerca della capsula di Petri, richiede circa 30-45 minuti. Il tempo impiegato per la ricerca e l'identificazione dei follicoli non richiede più di 30 minuti, risultando in un processo che richiede un totale di 1-1,25 ore per ovaio.
Il passo più critico di questo protocollo è garantire che il tessuto ovarico sia adeguatamente omogeneizzato. L'aumento del tempo di omogeneizzazione da 5 minuti a 6 minuti ha portato ad un aumento del numero di follicoli isolati (P < 0,05). Una media di 41 follicoli sono stati isolati per ovaio da 30 studi utilizzando un'omogeneizzazione di 6 minuti, che è un aumento di quasi tre volte rispetto alla media di 13,8 follicoli per ovaio ottenuti da 22 studi con un tempo di omogeneizzazione di 5 minuti (Figura 5). Un altro passo importante è la velocità di omogeneizzazione, che deve rimanere entro 9.000-11.000 giri/min. Velocità più elevate portano a una diminuzione dei rendimenti, presumibilmente a causa di danni eccessivi e / o rottura dei follicoli. L'isolamento del follicolo può essere ulteriormente migliorato dopo le fasi di filtrazione facendo passare più volte il contenuto del piatto di ricerca attraverso una pipetta Pasteur di vetro con un bulbo di gomma. Utilizzando la pipetta Pasteur, i follicoli vengono rimossi dai detriti e più follicoli possono essere visti nel piatto.
Se i follicoli devono essere coltivati dopo l'isolamento, è importante mitigare la contaminazione microbica. La contaminazione può essere prevenuta tagliando qualsiasi tessuto connettivo e grasso in eccesso da tutta l'ovaia e quindi eseguendo una serie di fasi di lavaggio. Le ovaie tagliate devono essere brevemente lavate in etanolo al 70% per ridurre la carica microbica, seguite da diversi lavaggi in soluzione calda (38,5 ° C) PBS + PenStrep per lavare via l'etanolo al 70% e rimuovere ulteriormente eventuali microrganismi. Questi lavaggi possono essere eseguiti senza compromettere la vitalità del follicolo. Per prevenire ulteriormente la contaminazione, è possibile eseguire l'intero protocollo di isolamento all'interno di un armadio di biosicurezza o di un banco pulito con apparecchiature sterilizzate.
Isolamento dell'RNA e RT-qPCR
Sono stati raggruppati follicoli dello stesso stadio e provenienti da isolamenti separati e un totale di 46 follicoli primari e 34 follicoli secondari precoci sono stati utilizzati per l'analisi dell'espressione dell'mRNA. L'RNA è stato isolato dai follicoli aggregati (follicoli primari = 259 ng di RNA totale e follicoli secondari precoci = 91 ng di RNA totale) e utilizzato per la sintesi del cDNA. L'espressione del trascritto del marcatore cellulare della granulosa FSHR19 e del marcatore delle cellule germinali DAZL nei follicoli è stata quindi valutata utilizzando RT-qPCR. Come previsto, sia i follicoli primari che quelli secondari iniziali hanno espresso trascritti di FSHR e DAZL, confermando un precedente rapporto nei follicoli umani31 e dimostrando che l'FSHR è espresso nei follicoli bovini nella fase primaria di sviluppo32 (Figura 6A,B).
Localizzazione immunofarinescente di Connexin 37
La localizzazione immunofluorescente delle proteine può essere eseguita in follicoli interi. Qui, questa tecnica è stata utilizzata per localizzare la proteina di giunzione gap Connexin 37 (CX37) in follicoli preantrali isolati sia allo stadio primario che a quello secondario precoce. CX37 è fondamentale per la comunicazione tra le cellule dell'ovocita e della granulosa del follicolo ed è stato identificato in entrambi i tipi cellulari in tutte le fasi dello sviluppo del follicolo nelle specie bovine nelle analisi istologiche33. Dopo il test di esclusione del blu di tripano, i follicoli vitali sono stati fissati in PFA e incubati con anticorpi CX37 anti-umani di coniglio o isotipo IgG di coniglio (controllo negativo), seguiti da incubazione con anticorpo secondario AlexaFluor 488 di asino-anti-coniglio. Hoechst 33342 è stato utilizzato per marcare il DNA. I follicoli sono stati ripresi utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertita sotto filtri DAPI e FITC, e l'intensità del segnale è stata quantificata. CX37 è risultato localizzarsi nell'ooplasma, sebbene notevolmente assente dal nucleo dell'ovocita, e nella membrana delle cellule della granulosa (Figura 7). Questi risultati sono coerenti con la localizzazione nota di CX37 nell'ovocita e nella membrana delle cellule della granulosa33. L'immunolocalizzazione di proteine note per essere critiche per la comunicazione cellulare e la crescita dei follicoli, come CX37 (mostrato qui) e FSHR32 è uno strumento vitale per studiare lo sviluppo dei follicoli preantrali, gli effetti degli interventi sulla crescita, la struttura e la qualità del follicolo, nonché per valutare l'efficacia della coltura confrontando follicoli ottenuti in vivo e in coltura in vitro.
| Gene | Sequenza in avanti (5'-3') | Sequenza inversa (5'-3') | Dimensioni del prodotto (bp) | ||||
| FSHR | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | CAT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| DAZL | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG A | ATTO TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| ACTB | CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati per RT-qPCR.
Figura 4: Numero e stadio di sviluppo dei follicoli preantrali isolati. (A) Numero totale di follicoli preantrali isolati per replica utilizzando 6 min di omogeneizzazione tissutale (n = 30 repliche). Il numero medio di follicoli è rappresentato dalla linea rossa attraverso le barre. (B) In 14 repliche, è stato registrato lo stadio di sviluppo dei follicoli isolati. Il grafico a torta mostra la distribuzione delle fasi di sviluppo in proporzione ai follicoli totali isolati (n = 476). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Confronto tra l'omogeneizzazione di 5 e 6 minuti. L'omogeneizzazione della corteccia ovarica per 6 minuti ha prodotto un numero maggiore di follicoli preantrali rispetto all'omogeneizzazione alla stessa velocità per 5 minuti (n = 22 repliche per 5 minuti e 30 repliche per 6 minuti; P < 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: PCR quantitativa a trascrizione inversa di trascritti espressi in follicoli preantrali isolati. I follicoli preantrali primari e secondari iniziali hanno espresso trascritti di mRNA per marcatori di cellule della granulosa (FSHR), cellule germinali (DAZL) e geni di riferimento (H2A e ACTB). (A) Gel di agarosio di prodotti PCR per ciascun gene con le rispettive dimensioni del prodotto della coppia di basi (bp). (B) L'espressione dei trascritti di FSHR e DAZL è stata quantificata rispetto a quella del gene di riferimento ACTB. NTC = controllo non modello, CT = soglia del ciclo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Localizzazione immunofluorescente di CX37 in follicoli preantrali isolati. Immagini rappresentative dell'immunolocalizzazione CX37 in un follicolo preantrale bovino primario (A) e secondario precoce (B). (C) Immagine rappresentativa dell'etichettatura dell'isotipo di coniglio a controllo negativo in un follicolo preantrale bovino secondario precoce. Pannello di sinistra: marcatura del DNA (DAPI). Pannello centrale: anticorpo primario coniglio anti-umano CX37 etichettatura (FITC). Pannello di destra: DAPI e FITC fusi. Barre di scala = 50 μm. (D) Intensità media del segnale CX37 in base allo stadio di sviluppo del follicolo (n = 21 follicoli primari e 11 follicoli secondari precoci in due repliche). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile per recuperare i follicoli preantrali in fase iniziale, in particolare nelle fasi primarie e secondarie, dall'ovaio bovino. Questo protocollo si basa sui precedenti rapporti 20,25,30,34,35,36 e fornisce ottimizzazioni che si traducono nell'isolamento di un numero significativo di follicoli da una singola ovaia. I follicoli preantrali isolati con questo metodo sono vitali e possono essere utilizzati per applicazioni a valle come l'immunolocalizzazione delle proteine e l'estrazione dell'RNA per l'analisi dell'espressione genica. La coltura dei follicoli isolati non è stata tentata in questo studio. Tuttavia, sono attualmente in corso sforzi per ottenere una coltura a lungo termine di piccoli follicoli preantrali bovini, che sarà un'importante applicazione a valle di questo protocollo che contribuirà a migliorare la comprensione della follicologenesi ovarica, eseguire test tossicologici e escogitare modi per manipolare con successo i follicoli per la conservazione della fertilità.
I dati di questi esperimenti mostrano che l'omogeneizzazione di 6 minuti è fondamentale per la corretta dispersione del tessuto corticale ovarico e il rilascio del follicolo (Figura 4). Ulteriori passaggi che contribuiscono alla completa omogeneizzazione del tessuto sono la dissezione iniziale della corteccia dal midollo che garantisce il corretto spessore della corteccia (~ 1 mm), tagliando via il tessuto connettivo in eccesso e tagliando la corteccia in piccoli frammenti. Questi passaggi impediscono l'intasamento della sonda omogeneizzatore e detriti non necessari nella piastra di ricerca. La dimensione dei pori del filtro cellulare è importante per escludere detriti e follicoli di dimensioni e stadio indesiderati; Nel caso di questo protocollo, il passo finale è la raccolta del contenuto di un filtro cellulare da 40 μm in modo da escludere i follicoli primordiali, che hanno tipicamente un diametro di <40 μm nei bovini26. Infine, si consiglia di utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere i follicoli dai detriti nel piatto di ricerca rispetto al tentativo di sezionare manualmente i follicoli dai detriti, poiché quest'ultima tecnica richiede più abilità tecniche e, se eseguita in modo improprio, può danneggiare i follicoli.
Sebbene questo protocollo presenti miglioramenti rispetto ai metodi esistenti, ci sono limitazioni che devono essere considerate. In primo luogo, a causa della natura eterogenea della popolazione di follicoli ovarici15 e della storia sconosciuta degli animali da cui sono state recuperate le ovaie, il numero di follicoli isolati dopo l'esecuzione di questo protocollo era altamente variabile. Un fattore che deve essere considerato è l'età degli animali, poiché la riserva ovarica è nota per diminuire con l'etàdi 37 anni.
L'isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino offre l'opportunità di indagare questioni scientifiche di base a livello di singolo campione, un approccio che è stato difficile da condurre in precedenza. Ad esempio, tutti gli stadi del follicolo preantrale qui valutati hanno mostrato espressione di CX37, una proteina critica per la comunicazione cellulare ovocita-granulosa. Allo stesso modo, l'espressione del recettore FSH è stata precedentemente dimostrata in follicoli preantrali isolati individualmente32. Altri marcatori specifici delle cellule della granulosa, come gli enzimi steroidogenici CYP17 e CYP1938, sarebbero aggiunte rilevanti al pannello di espressione genica/proteica dei follicoli preantrali e saranno oggetto di progetti futuri. La visualizzazione dell'intera struttura follicolare tramite microscopia regolare o confocale è più completa rispetto all'esame istologico, dove solo un segmento del follicolo può essere analizzato alla volta. Ciò è particolarmente vantaggioso negli studi che potrebbero voler utilizzare l'immunocolorazione o l'ibridazione in situ , dove è richiesta una localizzazione spaziale dettagliata dell'espressione. Inoltre, i follicoli preantrali isolati possono essere utilizzati per studiare l'espressione genica di un singolo follicolo utilizzando kit sensibili per RT-qPCR30. La capacità di analizzare i follicoli individualmente e senza l'influenza dell'ambiente ovarico è un passo avanti fondamentale nella comprensione della complessità della follicologenesi preantrale.
La crioconservazione del tessuto della corteccia ovarica è diventata una tecnica promettente per salvaguardare la fertilità nelle femmine di mammiferi39, comprese le donne40. La conservazione e il ripristino della fertilità con follicoli preantrali rappresenta un'interessante tecnologia di riproduzione assistita e un metodo promettente per lo studio della follicologenesi41. Dopo il congelamento e lo scongelamento, il tessuto può essere sottoposto a questo protocollo di isolamento per il recupero dei follicoli preantrali vitali. Sebbene la potenziale capacità di questo protocollo di recuperare follicoli da tessuto precedentemente crioconservato non sia stata specificamente valutata, altri hanno dimostrato successo e hanno utilizzato piccoli follicoli preantrali vitali isolati da tessuto congelato-scongelato per colture in vitro 42,43,44,45. Inoltre, i follicoli preantrali appena isolati possono essere crioconservati individualmente tramite vitrificazione e mantenere l'integrità strutturale36.
In letteratura manca un aggiornamento sui dettagli per l'isolamento efficiente dei follicoli preantrali da una grande specie di mammiferi come il bovino. Inoltre, è molto necessaria una guida visiva ed esplicita su come isolare i follicoli preantrali bovini, poiché la mancanza di riproducibilità è stata un collo di bottiglia nel campo. Recentemente, Bus et al.36 hanno descritto l'isolamento dei follicoli preantrali bovini utilizzando un metodo meccanico, con una resa media calcolata di 6,1 follicoli primari per ovaio. Il metodo di isolamento meccanico qui descritto comporta l'isolamento di una media di 41 follicoli preantrali per ovaio, la maggior parte dei quali allo stadio primario. Pertanto, questa tecnica è particolarmente utile per gli studi incentrati sulla fisiologia e lo sviluppo del follicolo primario. I follicoli primari rappresentano il primo stadio del pool di crescita e sono abbondanti nella corteccia ovarica. Pertanto, l'uso della tecnica descritta, che è ottimizzata per raccogliere questa fase di sviluppo, è nuova e può essere particolarmente desiderabile per sfruttare la riserva ovarica evitando la manipolazione più difficile dei follicoli primordiali. Un altro vantaggio dell'isolamento dei follicoli primari sarebbe quello di associare la coltura del tessuto ovarico per l'attivazione iniziale dei follicoli primordiali con il successivo isolamento dei follicoli primari per un'ulteriore coltura. Dato l'interesse per la coltura dei follicoli dalla fase primaria più abbondante, il metodo presentato qui può incentivare i ricercatori a perseguire strade che potrebbero aver precedentemente evitato a causa della sfida di isolare i follicoli primari.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo progetto è stato parzialmente finanziato dal progetto multi-stato USDA W4112 e dal premio UC Davis Jastro Shields a SM.
Gli autori vorrebbero estendere il loro apprezzamento a Central Valley Meat, Inc. per aver fornito le ovaie bovine utilizzate in tutti gli esperimenti. Gli autori ringraziano anche Olivia Silvera per l'assistenza nell'elaborazione delle ovaie e nell'isolamento del follicolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
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