Summary
لمراقبة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية للفئران ، يلزم وجود قناة صفراوية سليمة وإعداد فعال. لذلك ، تم تطوير نهج جديد لعزل نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بالكامل في حديثي الولادة الفئران بنجاح مع الحفاظ على سلامة القناة الصفراوية.
Abstract
تم وصف تشريح القنوات الصفراوية لحديثي الولادة في الفئران بأنه صعب. الهدف الرئيسي من إجراء التشغيل القياسي الموصوف هو عزل القناة الصفراوية خارج الكبد (EBD) في حديثي الولادة في الفئران دون الإضرار بالقناة الصفراوية أثناء التحضير. نظرا لإعداده الوثيق بشكل استثنائي مقارنة بخط خلايا الخلايا الصفراوية وحصاد نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بأكمله (EBDS) ، فإن النهج الموصوف مفيد للغاية في البحث عن النماذج الحيوانية لاضطرابات القناة الصفراوية لحديثي الولادة ، مثل رتق القناة الصفراوية. بعد القتل الرحيم ، تم الوصول إلى التجويف البريتوني ، وتم استخراج نظام القناة الصفراوية والاثني عشر والكبد باستخدام استئصال En-bloc-Resection الفريد (EbR). يتم وضع العينة المستخرجة على حصيرة رغوية ، ويتم تشريح EBD من الخلايا الملوثة بشكل غير مؤلم دون اللمس اللازم. يعد تشريح EBDS بالكامل ميزة مهمة لهذه الطريقة. يجب توخي الحذر بسبب صغر حجم وكمية أنسجة القناة الصفراوية. باستخدام التقنية الموصوفة ، لا يوجد أي ضرر للخلايا الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن نقاء التقنية قابل للتكرار (n = 10). لذلك ، يمكن حصاد عينات قابلة للمقارنة على النحو الأمثل. علاوة على ذلك ، لا تتضرر أنسجة القناة الصفراوية ، لأنه يمكن تجنب أي اتصال مع نظام القناة الصفراوية أثناء التحضير ، وترك السائل الصفراوي داخل المرارة. الأهم من ذلك ، أثناء إجراء تشريح المرارة والقناة الصفراوية النهائي ، تم استخدام الأدوات الدقيقة غير الرضحية فقط بشكل جانبي قليلا من القناة الصفراوية دون الضغط عليها. هذا هو المفتاح لعينة نظيفة وسليمة ، وضروري لمزيد من التحقيق النسيجي أو عزل الخلايا الصفراوية. للتلخيص ، تمكن تقنية التشريح المبتكرة الموصوفة المشغلين عديمي الخبرة بشكل خاص من المعدات اللازمة لعزل EBDS بشكل نظيف قدر الإمكان.
Introduction
نشأة وتطور اعتلال الأقنية الصفراوية مثل رتق القناة الصفراوية والتهاب الأقنية الصفراوية المصلب الأولي (PSC) والتهاب الأقنية الصفراوية الأولي (PBC) إما غير معروف أو غير مكتمل 1,2. يؤدي الفهم المحدود لأصل هذه الأمراض وتطورها إلى ندرة خيارات العلاج3. أصعب عقبة في دراسة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية هي اكتساب فهم جزيئي للفيزيولوجيا المرضية. أحد المفاتيح الأساسية لفهم أفضل لعلم الأمراض الجزيئي هو أفضل ملاحظة ممكنة للأنسجة المصابة. لتجنب انخفاض قابلية المقارنة والتناقضات بين الأبحاث ، مثل مراقبة المسببات الفيروسية المحتملة لرتق القناة الصفراوية4 ، تنشأ الحاجة إلى أفضل إعداد ممكن ومشاركة تقنيات التشريح التي يتم إجراؤها. يعد التحضير النقي للأنسجة المستهدفة ضروريا لإجراء تحقيقات مجهرية لاحقة أو تربية الثقافات العضوية الخلوية و 3D. ومع ذلك ، في اضطرابات حديثي الولادة الفئران ، تكون عينات الأنسجة نادرة ولا تحدث إلا بكمية صغيرة بسبب صغر حجمها. فيما يتعلق باضطرابات القناة الصفراوية ، تم وصف الصعوبات في التحضير النظيف للقنوات الصفراوية في حديثي الولادة الفئران5. نظرا لمرحلة تطور حديثي الولادة ، فإن تمايز الأنسجة ليس متقدما بشكل مفرط ، مما يعقد التحضير ويزيد من الصعوبة مقارنة بإعداد عينات البالغين. لذلك ، قامت مجموعة العمل التشغيلية بالتحقيق في استراتيجية جديدة لإعداد EBDS في نموذج فأر حديثي الولادة. في هذه الدراسة ، تسمح التقنية بتشريح فعال لكل عينة.
يتم وضع نظام القناة الصفراوية داخل الصفاق في الجزء العلوي الأيمن من البطن ، الناشئة عن الكبد. تقع المرارة تحت السطح الحشوي للفص الأيمن للكبد. القناة الصفراوية ، جنبا إلى جنب مع الوريد البابي والشريان الكبدي ، مضمنة في الرباط الكبدي الاثني عشر. ينضم إلى الكبد والاثني عشر مباشرة ويستنزف السائل الصفراوي في الاثني عشر6. تشريحيا ، تنقسم القناة الصفراوية إلى القنوات الكبدية اليمنى واليسرى ، والقناة الكبدية المشتركة ، والقناة الكيسية ، والقناة الصفراوية ، التي تتشكل من التقاء القناة الكيسية والقناة الكبدية المشتركة7. هذا واحد في نهاية المطاف يفرغ السائل الصفراوي واللعاب من القناة البنكرياسية إلى الاثني عشر عبر أمبولة فاتر.
تبطن الخلايا الصفراوية القناة الصفراوية داخل وخارج الكبد ، وتسكن في مكانة تشريحية معقدة حيث تساعد في إنتاج الصفراء والتوازن8. يمر السائل الصفراوي بهذه الخلايا الطلائية المتخصصة بتركيزات عالية يوميا. على وجه الخصوص ، تعتبر صيانة مظلة HCO3 مهمة جدا للحماية من سمية حمض الصفراء9. الخلايا الصفراوية هي خط الدفاع الأول في نظام الكبد الصفراوي ضد ، على سبيل المثال ، الكائنات الحية الدقيقة اللمعية10. قد تضعف الفعالية الدفاعية للخلايا الصفراوية ضد الاعتداءات السامة بسبب الاستعداد الوراثي. الحمل الزائد السام يسبب الضرر والدمار وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى اعتلال القنوات الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن القناة الصفراوية النامية ليست قادرة تماما على جميع آليات الحماية الذاتية ، مما يؤدي إلى زيادة التعرض للسموم البيئية في القنوات الصفراوية الوليدية11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بعد الموافقة الأخلاقية (N045 / 2021) ، تمت ملاحظة ذكور وإناث C57BL / 6 فئران حديثي الولادة حتى عمر 9 أيام. ولدت الحيوانات وقدمت لأغراض تجريبية من قبل مرفق الحيوانات في المركز الطبي الجامعي هامبورغ إيبندورف ، هامبورغ ، ألمانيا. تم إيواء حديثي الولادة في قفص مع حيواناتهم الأم. تم التحكم في الظروف البيئية في درجة حرارة (20-24 درجة مئوية) ، 12:12 ساعة دورة الضوء والظلام ، والرطوبة النسبية من 40٪ -70٪.
1. التحضير التجريبي
- قم بإعداد المعدات المطلوبة للعملية الجراحية ، بما في ذلك المقص والملقط وما إلى ذلك (انظر جدول المواد).
- ضع الأدوات المطهرة والمعقمة على سطح معقم بجوار طاولة العمليات.
- القتل الرحيم للفأر الوليدي البالغ من العمر P9 بسرعة عن طريق قطع الرأس بمقص التشغيل. ضع جسم الفأر الوليدي الرحيم في حقل عملية معقمة. تشريح EBDSs في حديثي الولادة الفئران بعمر 9 أيام (الخطوة 5).
ملاحظة: يعطي إجراء التشريح الموصوف أي عالم الأدوات المناسبة لإزالة EBDS من الفئران حديثي الولادة وكبار السن. كلما كبر الماوس ، كان التحضير أسهل.
2. الوصول إلى التجويف البريتوني
- أمسك الجلد فوق موقع المثانة البولية بالملقط. شق ثقب قطره 2 مم في الجلد باستخدام مقص ، دون الإضرار بالصفاق والهياكل الأساسية. قم بتوسيع القطع إلى موقع قطع الرأس ، باتباع الخط الإبطي الأمامي الأيسر. إزالة الجلد من اليسار إلى الجانب الأيمن مع ملقط غير مؤلم.
- امسك الصفاق المحيط بالطحال. ارفعه برفق حتى يشبه الصفاق هيكلا يشبه الخيمة واقطع ثقبا قطره 1 مم في المنتصف. انتظر حتى تمتلئ "الخيمة البريتونية" بالهواء. استخدم تكبيرا مجهريا 10x لهذه الخطوة والخطوات التالية.
- اقطع الصفاق في نافذة محاطة بالأضلاع السفلية ، وكلا منطقتي البطن الجانبيتين ، ومنطقة المثانة السفلية لضمان الوصول الكامل إلى الكبد ونظام القناة الصفراوية والمعدة والأمعاء الدقيقة والقولون.
ملاحظة: لتحسين الوصول إلى الكبد ، يمكن إجراء شق إضافي ، وإزالة الأضلاع الثلاثة السفلية مع ترك عملية الخنجري ، والأربطة المنجلية ، والكبد ، وهياكل القناة الصفراوية سليمة. من السهل الحصول على منظر الكبد.
3. فحص المرارة والقنوات الصفراوية
ملاحظة: تأكد من إبقاء العينة رطبة بشكل منتظم خلال جميع الخطوات التالية.
- اسحب عملية الخنجري بعناية في وضع قحفي بطني لفحص المرارة.
ملاحظة: يزداد التوتر على الرباط المنجلي مع هذه الحركة ، وتصبح المرارة المرفقة مرئية.- قم بإجراء سحب طفيف فقط لتجنب تمزق الرباط المنجلي الذي لا يمكن السيطرة عليه ، مما قد يؤدي إلى تمزق المرارة من نظام القناة الصفراوية. حرر سحب عملية الخنجري قبل الخطوة التالية.
- اسحب الاثني عشر برفق لتحرير نظام القناة الصفراوية.
ملاحظة: مع زيادة التوتر على الرباط الكبدي الاثني عشر ، يصبح نسيج القناة الصفراوية مرئيا.
4. استئصال الكتلة
- قم بإجراء التعبئة الداخلية السفلية باتباع الخطوات أدناه.
- تحديد حليمة الاثني عشر ، التي تربط نظام القناة الصفراوية إلى الاثني عشر.
- قطع من خلال الاثني عشر حوالي 2 سم من إلى الجانب الجانبي الأيمن من الحليمة.
- قطع من خلال منطقة البواب. تأكد من وجود محتويات المعدة في منطقة البواب بين موقع القطع وحليمة الاثني عشر.
ملاحظة: هذه خطوة مهمة لأمان التوجه لاحقا للموقع الصحيح لأجزاء الاثني عشر الفموية والفموية.
- أداء التعبئة العليا en-bloc.
- اسحب عملية الخنجري برفق واحصل على إمكانية الوصول إلى الرباط المنجلي.
- قم بإجراء قطع بطول 1 سم من خلال الرباط المنجلي ، أقرب ما يمكن من عملية الخنجري ، بين المرارة وعملية الخنجري. تأكد من عدم تلف المرارة.
- قطع من خلال الهياكل المتصلة التالية بين الكبد والصدر: المريء ، الوريد الأجوف السفلي ، الشريان الأورطي الصدري ، جميع الأربطة التي تحيط بالمنطقة العارية من الكبد ، وجميع وصلات الأنسجة المتبقية ظهريا.
ملاحظة: يتم تشريح عينة en-bloc بالكامل. أنه يحتوي على الكبد ، ونظام القناة الصفراوية ، والجسم الاثني عشر ، الذي يرتبط مع منطقة البواب في المعدة.
5. تشريح المرارة والقناة الصفراوية النهائي
- قم بإجراء التحضير الإجمالي باتباع الخطوات أدناه.
- ضع عينة en-bloc على وسادة رغوية تستخدم عادة للتجفيف. استخدم تكبيرا مجهريا 20x وملقطين جراحيين مجهريين بدون رضوح بحد أقصى لحجم الطرف 6 مم لهذه الخطوة والخطوات التالية.
- قم بتجميع العينة على وسادة الرغوة. أعد تنظيم العينة في الموضع التشريحي الصحيح. تسطيح الجزء الفموي والفموي من الاثني عشر ، وأداء حركة لطيفة.
- ابدأ الحركة عند حليمة الاثني عشر واستمر في حواف القطع باستخدام ملقط غير مؤلم. قم بتنعيم محتويات اللب الأبيض للمعدة ، والتي لن تحدث إلا في الجزء الفموي من الاثني عشر. تأكد من تحديد الجزء الفموي والفموي من الاثني عشر لاستبعاد دوران القناة الصفراوية المحتمل.
- قطع بقايا كبيرة من الأنسجة الكبدية لبدء تشريح القناة الصفراوية.
- أداء العزل النهائي.
- اضغط برفق على الأنسجة الكبدية المتبقية في مسام حصيرة الرغوة. تأكد من أن حركات الكشط تبدأ من نظام القناة الصفراوية وتؤدي إلى حدود الكبد.
- انقل العينة إلى وضع أنظف على حصيرة الرغوة بعد بضع حركات كشط في اتجاهات مختلفة. استخدم ميزة أنسجة الكبد الأقل ضغطا في الخلفية لتحسين العرض للحصول على أفضل تمييز ممكن بين EBDS والخلايا غير المرغوب فيها. كشط الأنسجة الكبدية من القناة الصفراوية حتى لا يبقى شيء ، أو أقل قدر ممكن ، من الأنسجة الكبدية.
- قم بمعالجة الرباط الكبدي الاثني عشر حتى يبقى EBDS المعزول. إزالة الأوعية الدموية داخل الرباط مثل الشريان الكبدي والوريد البابي والبقايا الصغيرة. قم بإزالة هذا الخيط الرقيق ، مع سحب لطيف وعناية عالية ، إلى الجانب الجانبي الأيسر. قد تكون خطوة التشريح هذه قد بدأت بالفعل عن غير قصد أو جزئيا أثناء الإزالة السابقة للأنسجة الكبدية ، مما يؤدي في النهاية إلى نفس النتيجة.
ملاحظة: تظهر الأوعية الدموية كخيوط بيضاء وحساسة للغاية حوالي 3-5 مم عن طريق الفم من حليمة الاثني عشر وتنضم إلى الرباط الكبدي الاثني عشر من الجانب الجانبي الأيسر ، وتتراكم مع القناة الصفراوية إلى ثالوث جليسوني. مع الانتهاء من هذه الخطوة ، يتم عزل العينة النهائية تماما. إذا كانت هناك حاجة إلى سجل ، يمكن التقاط الصور بعد تنظيم هياكل القناة الصفراوية في موقعها التشريحي (الشكل 1). يوصى بالقيام بخطوات التحضير الأخيرة على حصيرة رغوية لأن العينة لن تلتصق كثيرا بسطح حقل التشغيل. إذا كانت المسام رطبة ، فإن القناة الصفراوية ترتفع أو تطفو. عند تحريك العينة ، لن تلتصق بقوة كما تفعل مع التحضير على قماش العملية ، مما يؤدي إلى عدم التمزيق أثناء تحريك العينة.
6. التحضير للتحليل النسيجي
- ضع العينة المعزولة في محلول مخزن أو وسيط خاص أو مثبتات تحتوي على الفورمالين (انظر جدول المواد) في أسرع وقت ممكن بعد التشريح.
- اختر حل تخزين مناسب اعتمادا على خطوات المعالجة المخطط لها.
تنبيه: استخدم المثبتات المحتوية على الفورمالين فقط تحت فتحة التهوية بسبب السمية الحادة والتآكل والمخاطر الصحية المتنوعة.
ملاحظة: في الدراسة المقدمة ، تم إدخال عينات EBDS في بارافورمالدهيد ، مجففة ، ومضمنة في البارافين. تم تخزينها في درجة حرارة الغرفة وتبريدها قبل التقسيم. في خزانة الاحترار ، تم الاحتفاظ بشرائح 2 ميكرومتر طوال الليل وتلطيخها باستخدام الهيماتوكسيلين التقليدي والإيوزين4 (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح الشكل 1A EBDS لحديث الولادة الفئران ، والذي تم تشريحه باستخدام التقنية الموصوفة. مجهريا ، لا يوجد مزيد من الأنسجة الكبدية مرئية. تمت إزالة الأنسجة الكبدية خلال خطوات العزل النهائية للبروتوكول ويمكن تمييزها بسهولة عن أنسجة القناة الصفراوية فيما يتعلق باللون والاتساق. يعرض الشكل 1B العينة المعزولة مقارنة بمقياس ملليمتر. طول EBD (يقاس من المرارة إلى حليمة الاثني عشر) أقل من 10 ملم. يتراوح قطر القناة الصفراوية الحساسة للغاية من 0.05-0.2 مم. يصور الشكل 2 تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين لمقطع طولي من EBDS مع تجويف مفتوح. يمكن تحديد الخلايا الصفراوية المحيطة بالتجويف على أنها أحادية الطبقة ومصبوغة أغمق. تم إجراء الفحص المجهري باستخدام تكبير 20x. توضح الأشكال أن استخدام بروتوكول التشريح الموصوف يمكن المشغل من تشريح EBDS مجهريا بالقرب من حواف القناة ، حتى في الفئران حديثي الولادة. تم أخذ العينات من حديثي الولادة الفئران بعمر 9 أيام.
الشكل 1: تشريح EBDS . (أ) عينة EBDS النهائية لحديث الولادة الفأر. (1) المرارة ، (2) القناة الكيسية ، (3) القناة الكبدية دكستر ، (4) القناة الكبدية الشريرة ، (5) القناة الكبدية المجتمعية ، (6) القناة الصفراوية ، (7) الاثني عشر. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) أبعاد حجم EBDS المشرحة مقارنة بمقياس ملليمتر. شريط المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: القسم الطولي من EBDS. يظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين EBDS يحتوي على تجويف مفتوح. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل التكميلي 1: تطور وزن C57BL / 6-neonate حتى اليوم التاسع من حياتهم. تم وزن حديثي الولادة مرتين في اليوم. توضح البيانات المقدمة وزن الحيوانات الضابطة (ن = 5). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ذكرت هذه المقالة وناقشت إنشاء والتحقق من صحة نهج جراحي جديد لإزالة EBDS من الفئران حديثي الولادة القتل الرحيم. تكشف النتائج المجهرية والنسيجية أن النهج يكتشف بسرعة EBDs ويشريحها بالقرب من حواف القناة ، حتى في الفئران حديثي الولادة. مطلوب فقط الأدوات الجراحية والمجهر مع تكبير 20x للبروتوكول الموصوف. علاوة على ذلك ، يسمح النهج بعزل EBDS بالكامل. هذه التقنية عالية الكفاءة ومباشرة وسهلة التكرار.
لدراسة أمراض القناة الصفراوية مثل رتق القناة الصفراوية و PSC و PBC ، غالبا ما يكون الاستخراج الميكانيكي لنظام القناة الصفراوية بأكمله مطلوبا. نظرا لصغر حجمه ، خاصة عند حديثي الولادة ، يصعب تشريحه ومعالجته وتحليله. تم بالفعل إنشاء عزل الخلايا الأقنية خارج الكبد من EBDs الفأر حديثي الولادة 1 يوم ، ومع ذلك ، فقد وصفت الطريقة بأنها صعبة. بشكل عام ، يعاني الأفراد الجدد في هذا الإجراء بسبب التحديات التقنية مع تقنيات التشريح وكذلك تطهير القنوات الصفراوية الصغيرة5. لذلك ، قامت مجموعة العمل التشغيلية بالتحقيق في استراتيجية جديدة لإعداد EBDS في نموذج فأر حديثي الولادة. في هذه الدراسة ، تسمح التقنية بتشريح فعال لكل عينة. تم التضحية بحديثي الولادة في عمر 9 أيام وتم حصاد القنوات الصفراوية كما هو موضح في البروتوكول. علاوة على ذلك ، كانت هذه التقنية قابلة للتطبيق أيضا في حديثي الولادة الأصغر سنا. توفي بعض الأفراد أو كان لا بد من التضحية بهم قبل بلوغ اليوم التاسع ، بما في ذلك حديثي الولادة الذين يقل وزنهم عن 2 غرام (الشكل التكميلي 1). يجب على المشغلين التفكير في وقت تشغيل أطول بسبب مرحلة تطور حديثي الولادة. تمايز الأنسجة ليس متقدما بشكل مفرط ، مما يعقد التحضير ويزيد من الصعوبة مقارنة بإعداد عينات البالغين.
من الآثار الجانبية الأخرى المتعلقة بصعوبة التحضير الاحتمال الكبير لوجود خلايا غير مرغوب فيها في العينة ، مما قد يؤدي إلى تلوث مزارع الخلايا. في المقابل ، تمكن تقنية التشريح الجديدة المشغلين عديمي الخبرة من المعدات اللازمة لإزالة EBDS نظيفة قدر الإمكان. نتيجة لذلك ، من الأهمية بمكان استخدام أفضل نهج ممكن لتشريح EBD في الفئران حديثي الولادة. إذا تم استخدامها كما هو مذكور في البروتوكول ، فإن المعدات غير الرضحية ، مصحوبة بحصيرة رغوية ، لن تؤدي إلى إصابة القناة الصفراوية أو بشكل طفيف جدا. ستقاوم وسادة الرغوة حركات المشغل بهدوء أثناء تشريح الأنسجة غير المرغوب فيها ، والتي تحتوي على خلايا مثل خلايا الكبد والخلايا الليفية ل EBD دون الإضرار بها. في الواقع ، حتى الصفراء يمكن الحفاظ عليها. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول الوصول الآمن إلى نظام القناة الصفراوية بسبب التقدم بحذر طبقة تلو الأخرى. نتيجة لذلك ، ستكون التشوهات الخلقية والالتصاقات البريتونية مرئية قبل تلف أي نسيج.
أحد المبادئ الجراحية الرئيسية أثناء العملية بهدف الإزالة (على سبيل المثال ، استئصال الورم أو استئصال المرارة لدى الأفراد الأحياء) هو تجنيب أكبر قدر ممكن من الأنسجة السليمة. يجب طلب تطبيق هذا المبدأ لتنفيذ التحضير الجراحي في الفئران الرحيمة. بالنسبة لتشريح EBD ، تقرر عدم تجنيب أنسجة الكبد بل إجراء EbR ل EBDS والكبد وجسم الاثني عشر ، والذي أثبت أنه ميزة تقنية كبيرة وأقل صعوبة من إزالة EBD حصريا من تجويف البطن. بعد EbR ، تم نقل عينة en-bloc إلى حصيرة رغوية لحركة أنسجة الكبد وبقايا التلوث.
لا يمكن النظر في استخدام التقنيات الجراحية البديلة لإزالة نظام القناة الصفراوية خارج الكبد الكامل لإعداد الفئران بعد القتل الرحيم. والسبب في ذلك هو تسلسل حركات العملية ؛ يبدأ التحضير من أعلى إلى أسفل ، كما يوحي الاسم ، في الأعلى (في هذه الحالة ، المرارة) ويتقدم إلى تقاطع الاثني عشر والقناة الصفراوية. للبدء ، قم بإزالة المرارة من أنسجة الكبد ، ثم القناة الكيسية ، وأخيرا القناة الكبدية والقناة الصفراوية الشائعة إلى تقاطع الاثني عشر والقناة الصفراوية. أدت تقنية العزل هذه المستخدمة أثناء الجراحة في بطن الفئران الوليدية إلى إصابة القناة الصفراوية أو لف القناة الصفراوية المعزولة. كان سبب اللف نتيجة لكون القبضة فضفاضة للغاية. من الصعب للغاية تحديد موقع القناة الصفراوية بعد اللف. في محاولة لتجنب الالتفاف في مزيد من التشريح ، تم شد القناة الصفراوية أو الرباط المنجلي المرتبط بشكل أكثر إحكاما ، مما يوقف اللف غير المرغوب فيه ولكنه قد يؤدي إلى تلف خلوي مع نتائج سيئة في الفحص النسيجي اللاحق. لتشريح المرارة المفردة ، ينصح بتشريح من أعلى إلى أسفل.
في تقنية بديلة ، يتم التحضير من أسفل إلى أعلى بالترتيب المعاكس. يبدأ التحضير عند تقاطع الاثني عشر والقناة الصفراوية. ثانيا ، يجب سحب الاثني عشر لأسفل باستخدام ملقط غير رضحي باليد اليمنى ، مما يتسبب في تمدد الرباط الكبدي الاثني عشر وبالتالي الكشف عن القناة الصفراوية. في غضون ذلك ، استخدم الملقط الرضحي في اليد اليسرى للوصول إلى الجراب omental والحفاظ على التوتر على الرباط الكبدي الاثني عشر. بدءا من الاثني عشر ، يمكن تحقيق إعداد دقيق حتى التقاء الكيسي والقناة الكبدية المشتركة. ومع ذلك ، أثناء تشريح القناة الكيسية والمرارة في الكبد ، قد يتراكم التوتر عند نقطة واحدة ، مما يؤدي إلى تمزق القناة الصفراوية ولفها. أظهرت التجارب أن التحضير من أسفل إلى أعلى ينصح به فقط لتشريح القناة الصفراوية في الفئران حديثي الولادة.
للتلخيص ، أظهرت الاستعدادات من أعلى إلى أسفل ومن أسفل إلى أعلى عيوبا كبيرة في إعداد الفئران حديثي الولادة. نتيجة لذلك ، تم تطوير النموذج الجديد لتحقيق تشريح EBDS الكامل بشكل أسهل ، مما يسمح بتحديد ونقل مواقع القناة الصفراوية إلى السياقات النسيجية التي تم فحصها لاحقا بشكل موثوق وفعال.
بالإضافة إلى الأساليب الميكانيكية والجراحية ، أصبح الهضم الأنزيمي أكثر أهمية في معالجة الأنسجة على مدى العقود الماضية 5,12. توفر الإنزيمات عالية النقاء بديلا دقيقا لاستهداف هياكل معينة دون الإضرار بالخلايا المختارة لإجراء مزيد من التجارب.
تم تأسيس عزل الخلايا الصفراوية خارج وداخل الكبد بنجاح في الفئران والجرذان5،13،14،15،16. ومع ذلك ، تسمح كلتا التقنيتين بعزل الخلايا المفردة عندما تكون القناة الصفراوية السليمة ضرورية لتقنيات معينة - ولا سيما الأساليب النسيجية. بالإضافة إلى ذلك ، حتى بالنسبة لنهج زراعة الخلايا ، تتطلب جميع الدراسات المنشورة خطوة تشريح ميكانيكية قبل الهضم الأنزيمي دون تقديم بروتوكول مفصل خطوة بخطوة. يؤدي التشريح السابق إلى تقليل تلوث زراعة الخلايا ، مما يثبت أن تقنية التشريح ستكون مفيدة للنهج النسيجية والتجريبية المختلفة.
في البداية ، قد تتطلب التقنية بعض الوقت للتدريب. الممارسة ستزيد من السرعة والنتيجة. قد يكون المشغلون واثقين من أن مجرد اتباع النهج التدريجي سيؤدي إلى سهولة التكرار والعزل الدقيق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بجوانا هاجنز ، وبولين شوبرت ، وكلارا فيليبي ، والمحاضر الجامعي الدكتور كريستيان توموشات ، وسفينيا وارنك ، والمحاضر الجامعي الدكتورة ديانا ليندنر ، والأستاذ الدكتور ديرك ويسترمان ، وميريام تومزاك ، ونيكول لودر ، ونادين كورزاوا ، والدكتورة لايا باجيرولز رالوي ، وبيرجيت أبل، وماجدالينا تروشيميوك لمساهماتهم. حصل هانز كريستيان شميدت على دعم مالي من منحة Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME الدراسية (2021_EKPK.10) ، UKE ، هامبورغ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
