القناة الصفراوية خارج الكبد وتسلخ المرارة في حديثي الولادة في الفأر البالغ من العمر تسعة أيام
Summary
لمراقبة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية للفئران ، يلزم وجود قناة صفراوية سليمة وإعداد فعال. لذلك ، تم تطوير نهج جديد لعزل نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بالكامل في حديثي الولادة الفئران بنجاح مع الحفاظ على سلامة القناة الصفراوية.
Abstract
تم وصف تشريح القنوات الصفراوية لحديثي الولادة في الفئران بأنه صعب. الهدف الرئيسي من إجراء التشغيل القياسي الموصوف هو عزل القناة الصفراوية خارج الكبد (EBD) في حديثي الولادة في الفئران دون الإضرار بالقناة الصفراوية أثناء التحضير. نظرا لإعداده الوثيق بشكل استثنائي مقارنة بخط خلايا الخلايا الصفراوية وحصاد نظام القناة الصفراوية خارج الكبد بأكمله (EBDS) ، فإن النهج الموصوف مفيد للغاية في البحث عن النماذج الحيوانية لاضطرابات القناة الصفراوية لحديثي الولادة ، مثل رتق القناة الصفراوية. بعد القتل الرحيم ، تم الوصول إلى التجويف البريتوني ، وتم استخراج نظام القناة الصفراوية والاثني عشر والكبد باستخدام استئصال En-bloc-Resection الفريد (EbR). يتم وضع العينة المستخرجة على حصيرة رغوية ، ويتم تشريح EBD من الخلايا الملوثة بشكل غير مؤلم دون اللمس اللازم. يعد تشريح EBDS بالكامل ميزة مهمة لهذه الطريقة. يجب توخي الحذر بسبب صغر حجم وكمية أنسجة القناة الصفراوية. باستخدام التقنية الموصوفة ، لا يوجد أي ضرر للخلايا الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن نقاء التقنية قابل للتكرار (n = 10). لذلك ، يمكن حصاد عينات قابلة للمقارنة على النحو الأمثل. علاوة على ذلك ، لا تتضرر أنسجة القناة الصفراوية ، لأنه يمكن تجنب أي اتصال مع نظام القناة الصفراوية أثناء التحضير ، وترك السائل الصفراوي داخل المرارة. الأهم من ذلك ، أثناء إجراء تشريح المرارة والقناة الصفراوية النهائي ، تم استخدام الأدوات الدقيقة غير الرضحية فقط بشكل جانبي قليلا من القناة الصفراوية دون الضغط عليها. هذا هو المفتاح لعينة نظيفة وسليمة ، وضروري لمزيد من التحقيق النسيجي أو عزل الخلايا الصفراوية. للتلخيص ، تمكن تقنية التشريح المبتكرة الموصوفة المشغلين عديمي الخبرة بشكل خاص من المعدات اللازمة لعزل EBDS بشكل نظيف قدر الإمكان.
Introduction
نشأة وتطور اعتلال الأقنية الصفراوية مثل رتق القناة الصفراوية والتهاب الأقنية الصفراوية المصلب الأولي (PSC) والتهاب الأقنية الصفراوية الأولي (PBC) إما غير معروف أو غير مكتمل 1,2. يؤدي الفهم المحدود لأصل هذه الأمراض وتطورها إلى ندرة خيارات العلاج3. أصعب عقبة في دراسة اضطرابات القناة الصفراوية الوليدية هي اكتساب فهم جزيئي للفيزيولوجيا المرضية. أحد المفاتيح الأساسية لفهم أفضل لعلم الأمراض الجزيئي هو أفضل ملاحظة ممكنة للأنسجة المصابة. لتجنب انخفاض قابلية المقارنة والتناقضات بين الأبحاث ، مثل مراقبة المسببات الفيروسية المحتملة لرتق القناة الصفراوية4 ، تنشأ الحاجة إلى أفضل إعداد ممكن ومشاركة تقنيات التشريح التي يتم إجراؤها. يعد التحضير النقي للأنسجة المستهدفة ضروريا لإجراء تحقيقات مجهرية لاحقة أو تربية الثقافات العضوية الخلوية و 3D. ومع ذلك ، في اضطرابات حديثي الولادة الفئران ، تكون عينات الأنسجة نادرة ولا تحدث إلا بكمية صغيرة بسبب صغر حجمها. فيما يتعلق باضطرابات القناة الصفراوية ، تم وصف الصعوبات في التحضير النظيف للقنوات الصفراوية في حديثي الولادة الفئران5. نظرا لمرحلة تطور حديثي الولادة ، فإن تمايز الأنسجة ليس متقدما بشكل مفرط ، مما يعقد التحضير ويزيد من الصعوبة مقارنة بإعداد عينات البالغين. لذلك ، قامت مجموعة العمل التشغيلية بالتحقيق في استراتيجية جديدة لإعداد EBDS في نموذج فأر حديثي الولادة. في هذه الدراسة ، تسمح التقنية بتشريح فعال لكل عينة.
يتم وضع نظام القناة الصفراوية داخل الصفاق في الجزء العلوي الأيمن من البطن ، الناشئة عن الكبد. تقع المرارة تحت السطح الحشوي للفص الأيمن للكبد. القناة الصفراوية ، جنبا إلى جنب مع الوريد البابي والشريان الكبدي ، مضمنة في الرباط الكبدي الاثني عشر. ينضم إلى الكبد والاثني عشر مباشرة ويستنزف السائل الصفراوي في الاثني عشر6. تشريحيا ، تنقسم القناة الصفراوية إلى القنوات الكبدية اليمنى واليسرى ، والقناة الكبدية المشتركة ، والقناة الكيسية ، والقناة الصفراوية ، التي تتشكل من التقاء القناة الكيسية والقناة الكبدية المشتركة7. هذا واحد في نهاية المطاف يفرغ السائل الصفراوي واللعاب من القناة البنكرياسية إلى الاثني عشر عبر أمبولة فاتر.
تبطن الخلايا الصفراوية القناة الصفراوية داخل وخارج الكبد ، وتسكن في مكانة تشريحية معقدة حيث تساعد في إنتاج الصفراء والتوازن8. يمر السائل الصفراوي بهذه الخلايا الطلائية المتخصصة بتركيزات عالية يوميا. على وجه الخصوص ، تعتبر صيانة مظلة HCO3 مهمة جدا للحماية من سمية حمض الصفراء9. الخلايا الصفراوية هي خط الدفاع الأول في نظام الكبد الصفراوي ضد ، على سبيل المثال ، الكائنات الحية الدقيقة اللمعية10. قد تضعف الفعالية الدفاعية للخلايا الصفراوية ضد الاعتداءات السامة بسبب الاستعداد الوراثي. الحمل الزائد السام يسبب الضرر والدمار وبالتالي يمكن أن يؤدي إلى اعتلال القنوات الصفراوية. علاوة على ذلك ، فإن القناة الصفراوية النامية ليست قادرة تماما على جميع آليات الحماية الذاتية ، مما يؤدي إلى زيادة التعرض للسموم البيئية في القنوات الصفراوية الوليدية11.
Protocol
Representative Results
Discussion
ذكرت هذه المقالة وناقشت إنشاء والتحقق من صحة نهج جراحي جديد لإزالة EBDS من الفئران حديثي الولادة القتل الرحيم. تكشف النتائج المجهرية والنسيجية أن النهج يكتشف بسرعة EBDs ويشريحها بالقرب من حواف القناة ، حتى في الفئران حديثي الولادة. مطلوب فقط الأدوات الجراحية والمجهر مع تكبير 20x للبروتوكول ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بجوانا هاجنز ، وبولين شوبرت ، وكلارا فيليبي ، والمحاضر الجامعي الدكتور كريستيان توموشات ، وسفينيا وارنك ، والمحاضر الجامعي الدكتورة ديانا ليندنر ، والأستاذ الدكتور ديرك ويسترمان ، وميريام تومزاك ، ونيكول لودر ، ونادين كورزاوا ، والدكتورة لايا باجيرولز رالوي ، وبيرجيت أبل، وماجدالينا تروشيميوك لمساهماتهم. حصل هانز كريستيان شميدت على دعم مالي من منحة Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME الدراسية (2021_EKPK.10) ، UKE ، هامبورغ.
Materials
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the ‘biliary HCO3- umbrella’: an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
