Summary
为了观察小鼠新生儿胆管疾病，需要完整的胆管和有效的准备。因此，在保持胆管完整性的同时，成功研制出分离小鼠新生儿整个肝外胆管系统的新方法。
Abstract
小鼠新生儿胆管的清扫被描述为困难。所述标准操作程序的主要目的是在制备过程中在不损坏胆管的情况下分离小鼠新生儿的肝外胆管（EBD）。由于与胆管细胞系和整个肝外胆管系统（EBDS）的收获相比，其制备异常紧密，因此所描述的方法在研究新生儿胆管疾病（例如胆道闭锁）的动物模型时非常有用。安乐死后，进入腹膜腔，并通过独特的 En-bloc-切除术 （EbR） 提取胆管系统、十二指肠和肝脏。将提取的样品放在泡沫垫上，并在没有必要接触的情况下从无创伤性细胞中解剖EBD。解剖整个EBDS是这种方法的一个显着优势。由于胆管组织的体积和数量小，必须小心。使用所描述的技术，对胆管细胞没有损伤。此外，该技术的纯度是可重复的（n = 10）。因此，可以收获最佳可比的样品。此外，没有胆管组织受到伤害，因为在制备过程中可以避免与胆管系统的任何接触，将胆汁留在胆囊内。最重要的是，在进行最后的胆囊和胆管清扫时，无创伤的微器械只在胆管的稍微外侧使用，而不会挤压胆管。这是获得干净完整样本的关键，对于进一步的组织学检查或胆管细胞分离至关重要。总而言之，所描述的创新解剖技术使特别没有经验的操作人员能够使用必要的设备尽可能干净地隔离EBDS。
Introduction
胆管病（如胆道闭锁、原发性硬化性胆管炎 （PSC） 和原发性胆汁性胆管炎 （PBC））的起源和进展未知或不完全1，2。对这些疾病的起源和进展的了解有限，导致缺乏治疗选择3。研究新生儿胆管疾病的最困难的障碍是获得对病理生理学的分子理解。更好地了解分子病理学的重要关键之一是对受影响组织进行最佳观察。为了避免降低研究之间的可比性和差异，例如观察胆道闭锁4的潜在病毒性病因，需要尽可能最好地准备和共享所执行的解剖技术。靶组织的纯制备对于以后的显微镜研究或育种细胞和3D类器官培养物是必要的。然而，在小鼠新生儿疾病中，组织样本很少见，并且由于体积非常小，仅少量出现。关于胆管疾病，已经描述了小鼠新生儿胆管清洁制备的困难5。由于新生儿发育阶段，组织分化并不过分，与成人样品的制备相比，这会使制备复杂化并增加难度。因此，操作工作组研究了在新生小鼠模型中制备EBDS的新策略。在本研究中，该技术允许对每个样品进行有效解剖。
胆管系统腹膜内放置在右上腹部，起源于肝脏。胆囊位于肝脏右叶的内脏表面下方。胆管与门静脉和肝动脉一起嵌入肝十二指肠韧带中。它直接连接肝脏和十二指肠，并将胆汁排入十二指肠6。在解剖学上，胆管分为左右肝管、肝总管、胆囊管和胆总管，胆总管和胆总管7汇合而成。这个最终通过Vater壶腹 将 胆汁和唾液从胰管排空到十二指肠。
胆管细胞在肝内和肝外排列胆管，栖息在复杂的解剖壁龛中，在那里它们有助于胆汁的产生和稳态8。胆汁每天以高浓度通过这些专门的上皮细胞。特别是，HCO3-伞的维护对于防止胆汁酸毒性非常重要9。胆管细胞是肝胆系统中针对例如管腔微生物的第一道防线10。胆管细胞对毒性攻击的防御能力可能会因遗传易感性而减弱。毒性超负荷会导致损伤和破坏，因此可导致胆管病。此外，发育中的胆管不能完全具有所有自我保护机制，导致新生儿胆管对环境毒素的敏感性更高11。
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Protocol
在伦理批准（N045/2021）后，观察雄性和雌性C57BL / 6小鼠新生儿至9天大。这些动物由德国汉堡汉堡-埃彭多夫大学医学中心的动物设施出生并用于实验目的。新生儿与亲本动物一起被关在笼子里。环境条件控制在温度（20-24 °C）、12：12 h明暗循环、相对湿度40%-70%。
1. 实验准备
- 准备外科手术所需的设备，包括剪刀，镊子等（见 材料表）。
- 将消毒和高压灭菌的器械放在手术台旁边的无菌表面上。
- 用手术剪刀斩首快速对 P9 岁的新生小鼠实施安乐死。将安乐死的新生小鼠的身体放在无菌手术场上。解剖9日龄小鼠新生儿的EBDS（步骤5）。
注意：所描述的解剖程序为任何科学家提供了从新生儿和老年小鼠中去除EBDS的适当工具。鼠标越老，准备越容易。
2. 进入腹膜腔
- 用镊子抓住膀胱位置上方的皮肤。用剪刀在皮肤上切一个直径为2毫米的孔，而不会损坏腹膜和底层结构。沿着左前腋线将切口扩展到斩首的位置。用无创伤镊子从左到右取出皮肤。
- 抓住脾脏周围的腹膜。轻轻提起它，直到腹膜类似于帐篷状结构，并在中心切一个直径为 1 毫米的孔。等待“腹膜帐篷”充满空气。使用10倍显微放大倍率进行此步骤和以下步骤。
- 在由下肋骨、腹部外侧区域和下膀胱区域构成的窗口中切断腹膜，以确保完全进入肝脏、胆管系统、胃、小肠和结肠。
注意：为了改善进入肝脏的途径，可以进行额外的切口，去除三个最低的肋骨，同时保持剑突，恶性韧带，肝脏和胆管结构完整。肝脏的视图很容易获得。
3.胆囊和胆管检查
注意：确保在以下所有步骤中定期保持样品湿润。
- 小心地将剑突拉到颅室位置以检查胆囊。
注意：镰状韧带上的张力随着这种运动而增加，并且附着的胆囊变得可见。- 只需轻微拉扯即可避免无法控制的镰状韧带撕裂，这可能导致胆囊从胆管系统撕裂。在下一步之前释放剑突的拉力。
- 轻轻拉下十二指肠以释放胆管系统。
注意：随着肝十二指肠韧带上的张力增加，胆管组织变得可见。
4. 整体切除术
- 按照以下步骤执行较低的整体动员。
- 识别十二指肠，它连接胆管系统和十二指肠。
- 从的右侧切开十二指肠约2厘米。
- 切开幽门区域。确保胃内容物存在于切割位置和十二指肠之间的幽门区域。
注意：这是以后确定口腔和口腔十二指肠部分正确位置的方向的重要步骤。
- 执行上层整体动员。
- 轻轻拉动剑突并进入镰状韧带。
- 在胆囊和剑突之间对镰状韧带进行 1 cm 长的切口，尽可能靠近剑突。确保不要损坏胆囊。
- 切开肝脏和胸部之间的以下连接结构：食道、下腔静脉、胸主动脉、围绕肝脏裸露区域的所有韧带以及所有背侧剩余的组织连接。
注意：整体样品被完全剖析。它包含肝脏、胆管系统和十二指肠体，十二指肠体与胃的幽门区域相连。
5.最终胆囊和胆管清扫术
- 按照以下步骤进行粗略准备。
- 将整体样品放在通常用于脱水的泡沫垫上。使用20倍显微放大倍率和两个显微外科无创伤钳，最大尖端尺寸为6毫米，用于此步骤和以下步骤。
- 将样品组装在泡沫垫上。在正确的解剖位置重新组织样品。平整十二指肠的口腔和腹部，进行轻柔的运动。
- 在十二指肠处开始运动，然后使用无创伤钳继续到切削刃。抚平胃的白色髓状内容物，这只会发生在十二指肠的口腔部分。确保识别十二指肠的口腔和腹部，以排除可能的胆管旋转。
- 切掉大块残留的肝组织，开始解剖胆管。
- 执行最终隔离。
- 轻轻地将剩余的肝脏组织按入泡沫垫的孔中。确保刮擦运动从胆管系统开始并通向肝脏边界。
- 在各个方向上刮几次后，将样品转移到泡沫垫上的清洁位置。利用背景中较少挤压肝组织的优势来优化视图，以最好地区分EBDS和不需要的细胞。从胆管中刮下肝组织，直到肝组织没有或尽可能少地残留。
- 处理肝十二指肠韧带，直到孤立的EBDS仍然存在。切除韧带内血管，如肝动脉、门静脉和小残留物。取下这根细丝，轻轻拉动并高度小心，向左侧侧移开。该解剖步骤可能在先前切除肝组织期间无意或部分完成，最终导致相同的结果。
注意：血管在十二指肠口服约3-5毫米处呈白色且非常脆弱的细丝，并从左侧加入肝十二指肠韧带，与胆管一起积聚到滑松三联征。完成此步骤后，最终样品被完全隔离。如果需要记录，可以在将胆管结构组织到其解剖位置后捕获图像（图1）。建议在泡沫垫上进行最后的制备步骤，因为样品不会粘在操作区域的表面上。如果毛孔潮湿，胆管会悬浮或漂浮。移动样品时，它不会像在手术布上的制备物那样牢固地粘住，导致在移动样品时不会撕裂。
6. 组织学分析的准备
- 解剖后尽快将分离的样品放入缓冲溶液、特殊培养基或含福尔马林的固定剂中（参见 材料表）。
- 根据进一步计划的处理步骤选择合适的存储解决方案。
注意：仅在通风口下使用含福尔马林的固定剂，因为具有急性毒性、腐蚀性和多种健康危害。
注意：在所介绍的研究中，EBDS样品已插入多聚甲醛中，脱水并嵌入石蜡中。它们在室温下储存并在切片前冷却。在加热柜中，将2μm切片保持过夜，并使用常规苏木精和伊红4 染色（参见 材料表）。
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Representative Results
图1A 显示了用所述技术解剖的小鼠新生儿的EBDS。显微镜下，看不到进一步的肝组织。在方案的最后分离步骤中，肝组织已被移除，并且在颜色和稠度方面可以很容易地与胆管组织区分开来。 图1B 显示了分离的样品与毫米尺度的比较。EBD的长度（从胆囊到十二指肠测量）小于10毫米。非常脆弱的胆总管的直径从0.05-0.2毫米不等。 图2 描绘了具有开放腔的EBDS纵向切片的苏木精-伊红染色。胆管细胞可以在管腔周围被识别为单层，并且颜色较深。使用20倍放大镜进行显微镜检查。这些图表明，使用所描述的解剖方案使操作员能够在导管边缘附近显微镜解剖EBDS，即使在新生小鼠中也是如此。样本取自9日龄小鼠新生儿。
图1：EBDS解剖 。 （A）小鼠新生儿的最终EBDS样本。（1）胆囊，（2）囊性导管，（3）肝导管，（4）恶性肝导管，（5）肝导管，（6）胆管，（7）十二指肠。比例尺 = 500 μm。 （B） 解剖的 EBDS 与毫米尺度的尺寸尺寸。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。
图2：EBDS的纵向截面。 苏木精-伊红染色显示含有开放管腔的 EBDS。比例尺 = 50 μm。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：C57BL / 6新生儿的体重发育，直到其生命的第九天。 新生儿每天称重两次。提供的数据显示对照动物的体重（n = 5）。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文报道并讨论了一种新的手术方法的创建和验证，用于去除安乐死新生小鼠的EBDS。显微镜和组织学发现表明，该方法可快速检测EBD并在导管边缘附近解剖它们，即使在新生小鼠中也是如此。所述方案只需要手术器械和20倍放大倍率的显微镜。此外，该方法允许隔离整个EBDS。该技术高效、简单且易于复制。
为了研究胆管疾病，如胆道闭锁，PSC和PBC，经常需要机械提取整个胆管系统。由于体积小，特别是在新生儿中，很难解剖、处理和分析。已经建立了1日龄新生小鼠EBD的肝外导管细胞的分离，然而，该方法已被描述为困难。一般来说，由于解剖技术以及小胆管清洁的技术挑战，刚接触此程序的个人会感到挣扎5.因此，操作工作组研究了在新生小鼠模型中制备EBDS的新策略。在本研究中，该技术允许对每个样品进行有效解剖。新生儿在9日龄时处死，并按照方案所述收获胆管。此外，该技术也适用于年轻的新生儿。有些人在达到第九天之前死亡或不得不被处死，包括体重小于2克的新生儿（补充图1）。由于新生儿发育阶段，操作者应考虑更长的操作时间。与成人样品的制备相比，组织分化并不过分化，这使制备复杂化并增加了难度。
关于制备难度的另一个副作用是样品中出现不需要的细胞的可能性很高，这可能导致细胞培养物中的污染。相比之下，新颖的解剖技术使没有经验的操作员能够使用必要的设备尽可能干净地去除EBDS。因此，在新生小鼠中使用可行的最佳EBD解剖方法更为关键。如果按照协议中所述使用，无创伤设备伴随着泡沫垫，不会或只是非常轻微地伤害胆管。泡沫垫将柔和地对抗操作员的动作，同时解剖不需要的组织，其中包含EBD的肝细胞和成纤维细胞等细胞，而不会伤害它。事实上，即使是胆汁也可以保存。此外，该协议描述了由于逐层谨慎地进展而安全访问胆管系统。因此，在任何组织受损之前，先天性异常和腹膜粘连都将可见。
手术期间的一个主要手术原则是切除（例如，活体个体的肿瘤切除或胆囊切除术）是尽可能多地保留健康组织。需要要求该原则的适用性用于在安乐死小鼠中执行手术准备。对于EBD解剖，决定不保留肝组织，而是对EBDS，肝脏和十二指肠体进行EbR，这被证明是一个很大的技术优势，并且比仅从腹腔中取出EBD困难。在EbR之后，将整体样品转移到泡沫垫上，以移动肝组织和污染残留物。
安乐死后的小鼠准备不能考虑使用替代手术技术切除完整的肝外胆管系统。其原因是操作运动的顺序;顾名思义，自上而下的准备从顶部（在这种情况下为胆囊）开始，然后发展到十二指肠和胆总管的交界处。首先，从肝组织中取出胆囊，然后切除胆囊管，最后从十二指肠和胆总管到十二指肠和胆总管的交界处切除胆囊。这种在新生小鼠腹部术中使用的分离技术导致胆管损伤或分离的胆管盘绕。卷绕是由于抓握太松造成的。卷曲后很难找到胆管。为了避免在进一步的夹层中卷曲，胆管或连接的镰状韧带被更牢固地收紧，这阻止了不必要的卷曲，但可能导致细胞损伤，在随后的组织学检查中出现不良结果。对于单胆囊清扫术，建议自上而下清扫。
在另一种技术中，自下而上的准备以相反的顺序完成。准备工作从十二指肠和胆总管的交界处开始。其次，需要用右手用无创伤钳将十二指肠向下拉，导致肝十二指肠韧带拉伸，从而露出胆管。同时，使用左手的无创伤钳进入网膜滑囊并保持肝十二指肠韧带的张力。从十二指肠开始，可以实现准确的准备，直到囊性和肝总管的汇合。然而，在进一步解剖肝脏的胆囊管和胆囊时，张力可能会在某一点积聚，导致胆管撕裂和盘绕。实验表明，自下而上的制备仅用于解剖新生小鼠胆总管。
总而言之，自上而下和自下而上的制备在制备新生小鼠时表现出明显的缺点。因此，开发了新模型，以便更轻松地解剖完整的EBDS，从而可以可靠有效地识别胆管位置并将其转移到以后检查的组织学环境中。
除了机械和手术方法外，在过去的几十年中，酶消化在组织加工中变得越来越重要5，12。高度纯化的酶为靶向特定结构提供了一种精确的替代方案，而不会伤害为进一步实验选择的细胞。
已在小鼠和大鼠中成功建立了肝外和肝内胆管细胞的分离5，13，14，15，16。然而，当完整的胆管对某些技术（特别是组织学方法）至关重要时，这两种技术都允许分离单个细胞。此外，即使对于细胞培养方法，所有已发表的研究都需要在酶消化之前进行机械解剖步骤，而无需提供详细的分步方案。先前的解剖可减少细胞培养物污染，证明解剖技术将有利于组织学和各种实验方法。
一开始，该技术可能需要一些时间进行培训。练习将提高速度和结果。操作员可以确信，只需遵循分步方法即可轻松实现重现性和准确分离。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢Johanna Hagens，Pauline Schuppert，Clara Philippi，PD Dr. Medicine Christian Tomuschat，Svenja Warnke，PD Dr. Diana Lindner，Dirk Westermann教授，Miriam Tomczak，Nicole Lüder，Nadine Kurzawa，Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy，Birgit Appl和Magdalena Trochimiuk的贡献。汉斯·克里斯蒂安·施密特（Hans Christian Schmidt）得到了汉堡UKE的Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME奖学金（2021_EKPK.10）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
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