Summary
Til observation af murine neonatale galdekanalforstyrrelser kræves en intakt galdekanal og effektiv forberedelse. Derfor blev en ny tilgang til isolering af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem i murine nyfødte med succes udviklet, samtidig med at galdekanalens integritet blev opretholdt.
Abstract
Dissektionen af murine neonatale galdekanaler er blevet beskrevet som vanskelig. Hovedformålet med den beskrevne standardoperationsprocedure er isolering af den ekstrahepatiske galdekanal (EBD) hos musenyfødte uden at beskadige galdekanalen under forberedelsen. På grund af dets usædvanligt tætte forberedelse sammenlignet med cholangiocytcellelinjen og høst af hele det ekstrahepatiske galdekanalsystem (EBDS) er den beskrevne tilgang yderst nyttig til forskning i dyremodeller af nyfødte galdekanalforstyrrelser, såsom galdeatresi. Efter eutanasi blev peritonealhulen tilgået, og galdekanalsystemet, tolvfingertarmen og leveren blev ekstraheret med den unikke En-bloc-Resection (EbR). Den ekstraherede prøve placeres på en skummåtte, og EBD dissekeres fra forurenende celler atraumatisk uden nødvendig berøring. Dissektionen af hele EBDS er en væsentlig fordel ved denne metode. Der skal udvises forsigtighed på grund af den lille størrelse og mængde galdegangsvæv. Ved hjælp af den beskrevne teknik er der ingen skade på cholangiocytterne. Endvidere er renheden af teknikken reproducerbar (n = 10). Derfor kan optimalt sammenlignelige prøver høstes. Desuden er intet galdegangsvæv skadet, fordi enhver kontakt med galdekanalsystemet kan undgås under forberedelsen, hvilket efterlader galdevæsken inde i galdeblæren. Vigtigst af alt, mens de udførte den endelige galdeblære og galdekanaldissektion, blev atraumatiske mikroinstrumenter kun brugt lidt lateralt af galdekanalen uden at klemme den. Dette er nøglen til en ren og intakt prøve og afgørende for yderligere histologisk undersøgelse eller isolering af cholangiocytter. For at opsummere gør den beskrevne innovative dissektionsteknik det muligt for især uerfarne operatører med det nødvendige udstyr at isolere EBDS så rent som muligt.
Introduction
Tilblivelsen og progressionen af cholangiopatier såsom galde atresi, primær skleroserende cholangitis (PSC) og primær galdekolangitis (PBC) er enten ukendte eller ufuldstændige 1,2. Den begrænsede forståelse af disse sygdommes oprindelse og progression fører til mangel på behandlingsmuligheder3. Den sværeste hindring for at studere neonatale galdekanalforstyrrelser er at få en molekylær forståelse af patofysiologien. En af de væsentlige nøgler til en bedre forståelse af molekylær patologi er den bedst mulige observation af berørt væv. For at undgå reduceret sammenlignelighed og uoverensstemmelser mellem forskning, såsom observation af potentiel viral ætiologi af galde atresi4, opstår behovet for den bedst mulige forberedelse og deling af de udførte dissektionsteknikker. En ren forberedelse af målvævet er nødvendig for senere mikroskopiske undersøgelser eller avlscelle- og 3D-organoidkulturer. Men i murine neonatale lidelser er vævsprøver sjældne og forekommer kun i en lille mængde på grund af den meget lille størrelse. Med hensyn til galdegangsforstyrrelser er der beskrevet vanskeligheder med en ren tilberedning af galdekanaler hos murine nyfødte5. På grund af det neonatale udviklingsstadium er vævsdifferentiering ikke alt for avanceret, hvilket komplicerer forberedelsen og øger vanskeligheden sammenlignet med forberedelsen af voksne prøver. Derfor undersøgte driftsarbejdsgruppen en ny strategi for forberedelse af EBDS i en neonatal musemodel. I denne undersøgelse muliggør teknikken en effektiv dissektion af hver prøve.
Galdekanalsystemet er intraperitonealt placeret i højre øvre del af maven, der stammer fra leveren. Galdeblæren er placeret under den viscerale overflade af leverens højre lap. Galdekanalen er sammen med portalvenen og leverarterien indlejret i hepatoduodenalbåndet. Det forbinder leveren og tolvfingertarmen direkte og dræner galdevæske ind i tolvfingertarmen6. Anatomisk er galdekanalen opdelt i højre og venstre leverkanal, den fælles leverkanal, den cystiske kanal og Ductus choledochus, som dannes ved sammenløbet af den cystiske kanal og den fælles leverkanal7. Denne tømmer til sidst galdevæske og spyt fra bugspytkirtelkanalen ind i tolvfingertarmen via Vaters Ampulla.
Cholangiocytter beklæder galdekanalen intra- og ekstrahepatisk og bor i en kompliceret anatomisk niche, hvor de hjælper med galdeproduktion og homeostase8. Galdevæske passerer disse specialiserede epitelceller i høje koncentrationer dagligt. Især HCO3-paraplyvedligeholdelsen er meget vigtig for at beskytte mod galdesyretoksicitet9. Cholangiocytter er den første forsvarslinje i hepatobiliærsystemet mod for eksempel luminale mikroorganismer10. Cholangiocytternes forsvarseffektivitet mod giftige angreb kan svækkes af genetisk disposition. En giftig overbelastning forårsager skade og ødelæggelse og kan derfor føre til cholangiopatier. Desuden er den udviklende galdekanal ikke helt i stand til alle selvbeskyttende mekanismer, hvilket fører til en højere modtagelighed for miljøgifte i neonatale galdekanaler11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Efter etisk godkendelse (N045/2021) blev mandlige og kvindelige C57BL/6 mus nyfødte observeret indtil 9 dage gamle. Dyrene blev født og leveret til forsøgsformål af dyreanlægget på University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland. De nyfødte blev anbragt i et bur sammen med deres forældredyr. Miljøforholdene blev kontrolleret i temperatur (20-24 °C), 12:12 timers lys-mørk cyklus og relativ luftfugtighed på 40%-70%.
1. Eksperimentelt præparat
- Forbered det nødvendige udstyr til kirurgisk operation, herunder saks, tang osv. (se Materialetabel).
- Placer desinficerede og autoklaverede instrumenter på en steril overflade ved siden af operationsbordet.
- Afliv en P9-ældet neonatal mus hurtigt ved halshugning med en fungerende saks. Placer kroppen af den aflivede neonatale mus på et sterilt operationsfelt. Disseker EBDS'erne i 9 dage gamle musenyfødte (trin 5).
BEMÆRK: Den beskrevne dissektionsprocedure giver enhver videnskabsmand de rette værktøjer til at fjerne EBDS fra neonatale og ældre mus. Jo ældre musen er, desto lettere er forberedelsen.
2. Adgang til bughulen
- Tag fat i huden over placeringen af urinblæren med tang. Skær et hul på 2 mm i diameter ind i huden ved hjælp af en saks uden at beskadige bughinden og underliggende strukturer. Udvid snittet til halshugningens placering ved at følge venstre forreste axillarlinje. Fjern huden fra venstre til højre side med de atraumatiske tang.
- Tag fat i peritoneum omkring milten. Løft det forsigtigt op, indtil bughinden ligner en teltlignende struktur, og skær et hul på 1 mm i diameter i midten. Vent på, at "peritonealteltet" fyldes op med luft. Brug en 10x mikroskopisk forstørrelse til dette og følgende trin.
- Afskær peritoneum i et vindue indrammet af de nedre ribben, begge laterale maveområder og det nedre blæreområde for at sikre fuld adgang til leveren, galdekanalsystemet, maven, tyndtarmen og tyktarmen.
BEMÆRK: For at forbedre adgangen til leveren kan der udføres et ekstra snit, der fjerner de tre laveste ribben, mens xiphoidprocessen, falciform ledbånd, lever og galdekanalstrukturer forbliver intakte. Udsigten over leveren er let at få.
3. Undersøgelse af galdeblæren og galdegangene
BEMÆRK: Sørg for at holde prøven våd regelmæssigt under alle følgende trin.
- Træk forsigtigt xiphoidprocessen i en kranioventral position for at undersøge galdeblæren.
BEMÆRK: Spændingen på det falciforme ledbånd øges med denne bevægelse, og den vedhæftede galdeblære bliver synlig.- Udfør kun et lille træk for at undgå ukontrollabel rivning af det falciforme ledbånd, hvilket kan føre til, at galdeblæren rives fra galdekanalsystemet. Slip trækket af xiphoid-processen inden næste trin.
- Træk forsigtigt tolvfingertarmen ned for at frigøre galdekanalsystemet.
BEMÆRK: Når spændingen på hepatoduodenalbåndet øges, bliver galdekanalvævet synligt.
4. En-bloc-resektion
- Udfør den lavere en-bloc-mobilisering ved at følge nedenstående trin.
- Identificer duodenal papilla, som forbinder galdekanalsystemet med tolvfingertarmen.
- Skær gennem tolvfingertarmen ca. 2 cm fra til højre sideside af papillen.
- Skær gennem pylorområdet. Sørg for, at maveindholdet er til stede i pylorområdet mellem skærestedet og duodenalpapillen.
BEMÆRK: Dette er et vigtigt skridt for senere orienteringssikkerhed for den korrekte placering af orale og aboral duodenale dele.
- Udfør den øvre en-bloc-mobilisering.
- Træk forsigtigt xiphoidprocessen og få adgang til det falciforme ledbånd.
- Udfør et 1 cm langt snit gennem det falciforme ledbånd, så tæt som muligt på xiphoidprocessen, mellem galdeblæren og xiphoidprocessen. Sørg for ikke at beskadige galdeblæren.
- Skær gennem følgende forbindelsesstrukturer mellem leveren og thoraxen: spiserør, ringere vena cava, thorax aorta, alle ledbånd, der omgiver det blotte område af leveren, og alle dorsalt resterende vævsforbindelser.
BEMÆRK: En-bloc-prøven er fuldstændig dissekeret. Den indeholder leveren, galdekanalsystemet og duodenalkorpuset, som er forbundet med det pyloriske område i maven.
5. Endelig galdeblære og galdegangsdissektion
- Udfør bruttoforberedelsen ved at følge nedenstående trin.
- Placer en-bloc-prøven på en skumpude, der normalt bruges til dehydrering. Brug en 20x mikroskopisk forstørrelse og to mikrokirurgiske atraumatiske tang med en maksimal spidsstørrelse på 6 mm til dette og følgende trin.
- Saml prøven på skumpuden. Reorganiser prøven i den korrekte anatomiske position. Flad den orale og aborale del af tolvfingertarmen, og udfør en blid bevægelse.
- Start bevægelsen ved duodenal papilla og fortsæt til skærekanterne ved hjælp af atraumatisk tang. Glat ud det hvide pulpy indhold i maven, som kun vil forekomme i den orale del af tolvfingertarmen. Sørg for at identificere den orale og den aborale del af tolvfingertarmen for at udelukke sandsynlig galdegangsrotation.
- Skær store rester af levervæv væk for at begynde dissektion af galdekanalen.
- Udfør den endelige isolering.
- Tryk forsigtigt det resterende levervæv ind i skummåttens porer. Sørg for, at skrabebevægelserne starter fra galdekanalsystemet og fører til levergrænserne.
- Prøven overføres til en renere position på skummåtten efter et par skrabebevægelser i forskellige retninger. Brug fordelen ved mindre presset levervæv i baggrunden for at optimere visningen for den bedst mulige differentiering mellem EBDS og uønskede celler. Skrab levervævet fra galdekanalen, indtil intet eller så lidt som muligt af levervævet er tilbage.
- Behandl hepatoduodenal ligamentet, indtil det isolerede EBDS forbliver. Fjern intraligamentøse blodkar som leverarterien, portalvenen og små rester. Fjern dette sarte filament med et blidt træk og høj pleje til venstre side. Dette dissektionstrin kan allerede være startet utilsigtet eller delvist afsluttet under den forudgående fjernelse af levervæv, hvilket i sidste ende fører til det samme resultat.
BEMÆRK: Blodkarrene fremstår som et hvidt og meget delikat filament ca. 3-5 mm oralt af duodenal papilla og slutter sig til hepatoduodenalbåndet fra venstre laterale side og akkumuleres med galdekanalen til den glissoniske triade. Med afslutningen af dette trin isoleres den endelige prøve fuldstændigt. Hvis der er behov for en post, kan billeder tages efter at have organiseret galdekanalstrukturerne i deres anatomiske position (figur 1). Det anbefales at udføre de sidste forberedelsestrin på en skummåtte, fordi prøven ikke klæber så meget til overfladen af operationsfeltet. Hvis porerne er våde, svæver galdekanalen eller flyder. Når prøven flyttes, klæber den ikke så fast som den ville med forberedelse på operationskluden, hvilket resulterer i ingen rivning, mens prøven flyttes.
6. Forberedelse til histologisk analyse
- Den isolerede prøve anbringes i en bufferopløsning, et specielt medium eller formalinholdige fikseringsmidler (se Materialetabel) så hurtigt som muligt efter dissektionen.
- Vælg en passende opbevaringsløsning afhængigt af yderligere planlagte behandlingstrin.
FORSIGTIG: Brug kun formalinholdige fikseringsmidler under en udluftning på grund af akut toksicitet, ætsning og forskellige sundhedsfarer.
BEMÆRK: I den præsenterede undersøgelse er EBDS-prøverne blevet indsat i paraformaldehyd, dehydreret og indlejret i paraffin. De er blevet opbevaret ved stuetemperatur og afkølet inden sektionering. I et varmeskab blev 2 μm skiver opbevaret natten over og farvet ved hjælp af konventionel hæmatoxylin og eosin4 (se Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A viser EBDS af en murine nyfødt, som blev dissekeret med den beskrevne teknik. Mikroskopisk er der ikke yderligere levervæv synligt. Levervævet er blevet fjernet under protokollens sidste isolationstrin og kunne let skelnes fra galdegangsvæv med hensyn til farve og konsistens. Figur 1B viser den isolerede prøve sammenlignet med en millimeterskala. EBD's længde (målt fra galdeblære til duodenal papilla) er mindre end 10 mm. Diameteren af den meget sarte Ductus choledochus varierede fra 0,05-0,2 mm. Figur 2 viser hæmatoxylin-eosin farvning af en langsgående del af EBDS med et åbent lumen. Cholangiocytterne kan identificeres omkring lumen som et monolag og farvet mørkere. Mikroskopi blev udført ved hjælp af 20x forstørrelse. Tallene viser, at brugen af den beskrevne dissektionsprotokol gør det muligt for operatøren mikroskopisk at dissekere EBDS nær kanalens margener, selv hos neonatale mus. Prøverne blev taget fra 9 dage gamle murine nyfødte.
Figur 1: EBDS dissektion . (A) Endelig EBDS-prøve af en murine nyfødt. (1) Galdeblære, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Skalabjælke = 500 μm. (B) Størrelsesdimension af den dissekerede EBDS sammenlignet med en millimeterskala. Skalastang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Længdeafsnit af EBDS. Hæmatoxylin-eosin farvning viser EBDS indeholdende et åbent lumen. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende figur 1: Vægtudvikling af C57BL/6-nyfødte indtil deres niende levedag. Nyfødte blev vejet op til to gange om dagen. Forudsat data viser vægten af kontroldyr (n = 5). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel rapporterede og diskuterede oprettelsen og valideringen af en ny kirurgisk tilgang til fjernelse af EBDS af aflivede neonatale mus. Mikroskopiske og histologiske fund afslører, at tilgangen hurtigt registrerer EBD'er og dissekerer dem nær kanalens margener, selv hos neonatale mus. Kun kirurgiske instrumenter og et mikroskop med en 20x forstørrelse er påkrævet for den beskrevne protokol. Desuden tillader tilgangen isolering af hele EBDS. Teknikken er meget effektiv, ligetil og enkel at replikere.
Til undersøgelse af galdekanalsygdomme som galdeatresi, PSC og PBC er den mekaniske ekstraktion af hele galdekanalsystemet ofte påkrævet. På grund af den lille størrelse, især hos nyfødte, er det svært at dissekere, behandle og analysere. Isoleringen af ekstrahepatiske kanalceller fra 1 dag gamle nyfødte mus EBD'er er allerede blevet etableret, men metoden er blevet beskrevet som vanskelig. Generelt kæmper personer, der er nye i denne procedure, på grund af tekniske udfordringer med dissektionsteknikkerne samt rensning af de små galdekanaler5. Derfor undersøgte driftsarbejdsgruppen en ny strategi for forberedelse af EBDS i en neonatal musemodel. I denne undersøgelse muliggør teknikken en effektiv dissektion af hver prøve. Nyfødte blev ofret ved 9 dage, og galdekanaler blev høstet som beskrevet i protokollen. Desuden var teknikken også anvendelig hos yngre nyfødte. Nogle individer døde eller måtte ofres, før de nåede dag ni, herunder nyfødte, der vejer mindre end 2 g (supplerende figur 1). Operatører bør overveje en længere driftstid på grund af det neonatale udviklingsstadium. Vævsdifferentieringen er ikke alt for avanceret, hvilket komplicerer forberedelsen og øger vanskeligheden sammenlignet med forberedelsen af voksne prøver.
En yderligere bivirkning med hensyn til præparatets vanskelighed er den store mulighed for uønskede celler i prøven, hvilket kan føre til forurening i cellekulturer. I modsætning hertil gør den nye dissektionsteknik det muligt for uerfarne operatører med det nødvendige udstyr at fjerne EBDS så rent som muligt. Som et resultat er det endnu mere kritisk at bruge den bedst mulige tilgang til EBD-dissektion i neonatale mus. Hvis det anvendes som angivet i protokollen, vil det atraumatiske udstyr ledsaget af en skummåtte ikke eller bare meget lidt skade galdekanalen. Skumpuden vil blødt modvirke operatørens bevægelser, mens den dissekerer det uønskede væv, der indeholder celler som hepatocytter og fibroblaster af EBD uden at skade det. Faktisk kan selv galden bevares. Derudover beskriver protokollen sikker adgang til galdekanalsystemet på grund af forsigtigt fremadskridende lag for lag. Som følge heraf vil medfødte abnormiteter og peritoneale adhæsioner være synlige, før noget væv er beskadiget.
Et vigtigt kirurgisk princip under operation med det formål at fjerne (fx tumorresektion eller cholecystektomi hos levende individer) er at skåne så meget sundt væv som muligt. Anvendeligheden af dette princip skal anmodes om til udførelse af kirurgisk forberedelse i euthanatiserede mus. For EBD-dissektionen blev det besluttet ikke at skåne levervævet, men snarere at udføre en EbR af EBDS, lever og duodenalkorpus, hvilket viste sig at være en stor teknisk fordel og at være mindre vanskelig end udelukkende at fjerne EBD fra bughulen. Efter EbR blev en-bloc-prøven overført til en skummåtte til bevægelse af levervæv og forurenende rester.
Brugen af alternative kirurgiske teknikker til at fjerne det komplette ekstrahepatiske galdekanalsystem kan ikke overvejes til museforberedelse efter eutanasi. Årsagen til dette er rækkefølgen af operationsbevægelser; top-down forberedelse, som navnet antyder, begynder øverst (i dette tilfælde galdeblæren) og skrider frem til krydset mellem tolvfingertarmen og Ductus choledochus. Til at begynde med skal du fjerne galdeblæren fra levervævet, derefter den cystiske kanal og til sidst den fælles lever- og ductus choledochus til krydset mellem tolvfingertarmen og ductus choledochus. Denne isolationsteknik, der blev brugt intraoperativt i maven hos neonatale mus, resulterede i galdekanalskade eller opspolering af den isolerede galdekanal. Spolingen blev forårsaget som følge af, at grebet var for løst. Det er ekstremt vanskeligt at lokalisere galdekanalen efter opspoling. Forsøg på at undgå spole i yderligere dissektioner blev galdekanalen eller det sammenkædede falciforme ledbånd strammet mere fast, hvilket stopper uønsket oprullen, men kan resultere i cellulær skade med dårlige resultater ved den efterfølgende histologiske undersøgelse. Til dissektion af enkeltgaldeblæren anbefales top-down dissektion.
I en alternativ teknik udføres bottom-up-forberedelsen i modsat rækkefølge. Forberedelsen starter ved krydset mellem tolvfingertarmen og Ductus choledochus. For det andet skal tolvfingertarmen trækkes ned caudalt ved hjælp af atraumatisk tang med højre hånd, hvilket forårsager en strækning af hepatoduodenalbåndet og dermed afslører galdekanalen. I mellemtiden skal du bruge de atraumatiske tang i venstre hånd til at få adgang til omental bursa og opretholde spændinger på hepatoduodenal ledbåndet. Begyndende med tolvfingertarmen opnås en nøjagtig forberedelse op til sammenløbet af den cystiske og den fælles leverkanal. Men mens yderligere dissekering af leverens cystiske kanal og galdeblære, kan spændinger opbygges på et tidspunkt, hvilket resulterer i, at galdekanalen rives og spoles. Forsøgene viste, at bottom-up-præparat kun anbefales til dissektion af Ductus choledochus hos nyfødte mus.
For at opsummere viste top-down og bottom-up præparater betydelige ulemper ved at forberede nyfødte mus. Som et resultat blev den nye model udviklet for at opnå dissektion af den komplette EBDS lettere, hvilket gør det muligt at identificere og overføre galdekanalplaceringer til senere undersøgte histologiske sammenhænge pålideligt og effektivt.
Ud over mekaniske og kirurgiske tilgange er enzymatisk fordøjelse blevet mere relevant i vævsbehandling i løbet af de sidste årtier 5,12. Højt oprensede enzymer giver et præcist alternativ til at målrette specifikke strukturer uden at skade de celler, der er udvalgt til yderligere eksperimenter.
Isoleringen af ekstra- og intrahepatiske cholangiocytter er med succes blevet etableret hos mus og rotter 5,13,14,15,16. Begge teknikker giver imidlertid mulighed for at isolere enkeltceller, når en intakt galdekanal er kritisk for visse teknikker - især histologiske tilgange. Derudover, selv for cellekulturmetoder, kræver alle offentliggjorte undersøgelser et mekanisk dissektionstrin før enzymatisk fordøjelse uden at give en detaljeret trin-for-trin protokol. Forudgående dissektion resulterer i en reduktion af cellekulturforurening, hvilket beviser, at dissektionsteknikken vil være fordelagtig for histologiske og forskellige eksperimentelle tilgange.
I begyndelsen kan teknikken kræve lidt tid til træning. Øvelse vil øge hastigheden og resultatet. Operatører kan være sikre på, at blot at følge den trinvise tilgang vil føre til let reproducerbarhed og nøjagtig isolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Hans Christian Schmidt blev støttet økonomisk af Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Scholarship (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
