Summary
Для наблюдения за нарушениями желчных протоков новорожденных требуется интактный желчный проток и эффективная подготовка. Поэтому был успешно разработан новый подход к выделению всей внепеченочной системы желчных протоков у новорожденных мышей при сохранении целостности желчного протока.
Abstract
Рассечение мышиных неонатальных желчных протоков было описано как трудное. Основной целью описанной стандартной операционной процедуры является выделение внепеченочного желчного протока (EBD) у новорожденных мышей без повреждения желчного протока во время подготовки. Из-за его исключительно близкой подготовки по сравнению с клеточной линией холангиоцитов и сбором всей внепеченочной системы желчных протоков (EBDS), описанный подход чрезвычайно полезен при исследовании животных моделей нарушений желчных протоков новорожденных, таких как атрезия желчевыводящих путей. После эвтаназии была получена доступ к брюшной полости, а система желчных протоков, двенадцатиперстная кишка и печень были извлечены с помощью уникальной En-bloc-resection (EbR). Извлеченный образец помещают на пенопластовый мат, а EBD рассекают от загрязняющих клеток атравматично без необходимого прикосновения. Рассечение всей EBDS является существенным преимуществом этого метода. Следует соблюдать осторожность из-за небольшого размера и количества ткани желчных протоков. При использовании описанной методики не происходит повреждения холангиоцитов. Далее чистота методики воспроизводима (n = 10). Таким образом, можно собрать оптимально сопоставимые образцы. Кроме того, ткань желчных протоков не повреждается, потому что любого контакта с системой желчных протоков можно избежать во время приготовления, оставив желчную жидкость внутри желчного пузыря. Самое главное, что при выполнении заключительного рассечения желчного пузыря и желчных протоков атравматические микроинструменты использовались лишь незначительно латерально от желчного протока, не сдавливая его. Это ключ к чистому и неповрежденному образцу и необходим для дальнейшего гистологического исследования или выделения холангиоцитов. Подводя итог, можно сказать, что описанная инновационная методика вскрытия позволяет особенно неопытным операторам с необходимым оборудованием максимально четко изолировать EBDS.
Introduction
Генезис и прогрессирование холангиопатий, таких как билиарная атрезия, первичный склерозирующий холангит (PSC) и первичный билиарный холангит (PBC), либо неизвестны, либо неполны 1,2. Ограниченное понимание происхождения и прогрессирования этих заболеваний приводит к нехватке вариантов терапии3. Самым сложным препятствием в изучении неонатальных нарушений желчных протоков является получение молекулярного понимания патофизиологии. Одним из важных ключей к лучшему пониманию молекулярной патологии является наилучшее наблюдение за пораженной тканью. Чтобы избежать снижения сопоставимости и расхождений между исследованиями, таких как наблюдение за потенциальной вирусной этиологией атрезии желчевыводящихпутей 4, возникает необходимость в наилучшей возможной подготовке и совместном использовании выполненных методов диссекции. Чистая подготовка ткани-мишени необходима для последующих микроскопических исследований или разведения клеточных и 3D-органоидных культур. Однако при неонатальных заболеваниях мышей образцы тканей встречаются редко и встречаются только в небольшом количестве из-за очень маленького размера. Что касается нарушений желчных протоков, то описаны трудности в чистой подготовке желчных протоков у новорожденных мышей5. Из-за неонатальной стадии развития дифференцировка тканей не слишком развита, что затрудняет подготовку и увеличивает сложность по сравнению с подготовкой взрослых образцов. Поэтому операционная рабочая группа исследовала новую стратегию подготовки EBDS в модели неонатальной мыши. В настоящем исследовании этот метод позволяет эффективно распределять каждый образец.
Система желчных протоков внутрибрюшинно размещается в правой верхней части живота, возникая из печени. Желчный пузырь расположен под висцеральной поверхностью правой доли печени. Желчный проток вместе с воротной веной и печеночной артерией внедряется в гепатодуоденальную связку. Он соединяет печень и двенадцатиперстную кишку непосредственно и дренирует желчную жидкость в двенадцатиперстную кишку6. Анатомически желчный проток делится на правый и левый печеночный протоки, общий печеночный проток, кистозный проток и Ductus choledochus, который образуется слиянием кистозного протока и общего печеночного протока7. Этот в конечном итоге опорожняет желчную жидкость и слюну из протока поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку через ампулу Фатера.
Холангиоциты выстилают желчный проток внутри- и экстрагепатически, обитая в сложной анатомической нише, где они помогают в производстве желчи и гомеостазе8. Желчная жидкость ежедневно проходит через эти специализированные эпителиальные клетки в высоких концентрациях. В частности, поддержание зонтика HCO3 очень важно для защиты от токсичности желчных кислот9. Холангиоциты являются первой линией обороны в гепатобилиарной системе против, например, просветных микроорганизмов10. Защитная эффективность холангиоцитов от токсических атак может быть ослаблена генетической предрасположенностью. Токсическая перегрузка вызывает повреждение и разрушение и, следовательно, может привести к холангиопатии. Кроме того, развивающийся желчный проток не полностью способен ко всем самозащитным механизмам, что приводит к более высокой восприимчивости к токсинам окружающей среды в желчных протоках новорожденных11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
После этического одобрения (N045/2021) новорожденные самцы и самки мышей C57BL/6 наблюдались до 9-дневного возраста. Животные были рождены и предоставлены для экспериментальных целей учреждением для животных Университетской медицинской клиники Гамбург-Эппендорф, Гамбург, Германия. Новорожденных помещали в клетку вместе с родительскими животными. Условия окружающей среды контролировались при температуре (20-24 °C), цикле 12:12 ч свет-темнота и относительной влажности 40%-70%.
1. Экспериментальная подготовка
- Подготовить необходимое оборудование для хирургической операции, включая ножницы, щипцы и т.д. (см. Таблицу материалов).
- Поместите продезинфицированные и автоклавные инструменты на стерильную поверхность рядом с операционным столом.
- Быстро усыплите неонатальную мышь P9-возраста путем обезглавливания с помощью операционных ножниц. Поместите тело усыпленной неонатальной мыши на стерильное операционное поле. Рассечение EBDS у 9-дневных новорожденных мышей (шаг 5).
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная процедура рассечения дает любому ученому надлежащие инструменты для удаления EBDS у неонатальных и пожилых мышей. Чем старше мышь, тем легче подготовка.
2. Доступ к брюшной полости
- Обхватите кожу над расположением мочевого пузыря щипцами. Вырежьте отверстие диаметром 2 мм в кожу ножницами, не повреждая брюшину и нижележащие структуры. Разверните разрез до места обезглавливания, следуя левой передней подмышечной линии. Снимите кожу слева на правую сторону атравматическими щипцами.
- Возьмите в руки брюшину, окружающую селезенку. Осторожно поднимите его вверх, пока брюшина не станет похожа на шатровую структуру, и вырежьте отверстие диаметром 1 мм в центре. Подождите, пока «перитонеальная палатка» наполнится воздухом. Используйте 10-кратное микроскопическое увеличение для этого и следующих шагов.
- Отрежьте брюшину в окне, обрамленном нижними ребрами, как боковыми областями живота, так и областью нижнего мочевого пузыря, чтобы обеспечить полный доступ к печени, системе желчных протоков, желудку, тонкому кишечнику и толстой кишке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения доступа к печени может быть выполнен дополнительный разрез, удаляя три нижних ребра, оставляя мечевидный отросток, фальциформную связку, печень и структуры желчных протоков нетронутыми. Вид печени легко получить.
3. Обследование желчного пузыря и желчных протоков
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что образец должен оставаться влажным на регулярной основе в течение всех следующих этапов.
- Осторожно вытяните мечевидный отросток в черепно-вентральное положение, чтобы осмотреть желчный пузырь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Напряжение на фальциформной связке увеличивается с этим движением, и присоединенный желчный пузырь становится видимым.- Выполняйте лишь незначительное растяжение, чтобы избежать неконтролируемого разрыва фальциформной связки, что может привести к разрыву желчного пузыря из системы желчных протоков. Отпустите притяжение мечевидного процесса перед следующим шагом.
- Осторожно потяните вниз двенадцатиперстную кишку, чтобы освободить систему желчных протоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: По мере увеличения напряжения на гепатодуоденальной связке становится видимой ткань желчного протока.
4. Эн-блок-резекция
- Выполните нижнюю блочную мобилизацию, выполнив следующие действия.
- Определите дуоденальный сосочек, который соединяет систему желчных протоков с двенадцатиперстной кишкой.
- Прорежьте двенадцатиперстную кишку примерно на 2 см от правой боковой стороны сосочка.
- Прорежьте пилорическую область. Убедитесь, что содержимое желудка присутствует в пилорической области между местом разреза и дуоденальным сососком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный шаг для последующей безопасности ориентации для правильного расположения ротовой и аборальной дуоденальной частей.
- Выполните верхнюю ан-блок-мобилизацию.
- Осторожно потяните мечевидный отросток и получите доступ к фальциформной связке.
- Выполните разрез длиной 1 см через фальциформную связку, максимально приближенную к мечевидному отростку, между желчным пузырем и мечевидным отростком. Следите за тем, чтобы не повредить желчный пузырь.
- Прорежьте следующие соединительные структуры между печенью и грудной клеткой: пищевод, нижняя полая вена, грудная аорта, все связки, которые окружают голую область печени, и все дорсально оставшиеся тканевые соединения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец en-bloc полностью рассечен. Он содержит печень, систему желчных протоков и двенадцатиперстную кишку, которая связана с пилорической областью желудка.
5. Окончательное рассечение желчного пузыря и желчных протоков
- Выполните комплексную подготовку, выполнив следующие действия.
- Поместите образец en-bloc на пенопластовую прокладку, обычно используемую для обезвоживания. Используйте 20-кратное микроскопическое увеличение и два микрохирургических атравматических щипца с максимальным размером наконечника 6 мм для этого и следующих шагов.
- Соберите образец на поролоновой прокладке. Реорганизуйте образец в правильном анатомическом положении. Сгладить ротовую и аборальную часть двенадцатиперстной кишки, выполнив нежное движение.
- Начните движение в двенадцатиперстной кишке и продолжайте к режущим краям с помощью атравматических щипцов. Разгладьте белое пульповое содержимое желудка, которое будет возникать только в ротовой части двенадцатиперстной кишки. Убедитесь, что идентифицирована оральная и аборальная часть двенадцатиперстной кишки, чтобы исключить вероятное вращение желчных протоков.
- Отрежьте крупные остатки печеночной ткани, чтобы начать рассечение желчного протока.
- Выполните окончательную изоляцию.
- Аккуратно вдавите оставшуюся печеночную ткань в поры пенопластового мата. Убедитесь, что движения соскоба начинаются с системы желчных протоков и приводят к границам печени.
- Переместите образец в более чистое положение на пенопластовом коврике после нескольких скребковых движений в различных направлениях. Используйте преимущество менее сжатой ткани печени на заднем плане, чтобы оптимизировать вид для наилучшей возможной дифференциации между EBDS и нежелательными клетками. Соскоблите печеночную ткань из желчного протока до тех пор, пока ничего или как можно меньше от печеночной ткани не останется.
- Обрабатывайте гепатодуоденальную связку до тех пор, пока не останется изолированная EBDS. Удалите интралигаментозные кровеносные сосуды, такие как печеночная артерия, воротная вена и небольшие остатки. Удалите эту нежную нить, с легким натяжением и высоким уходом, с левой боковой стороны. Этот этап рассечения, возможно, уже начался непреднамеренно или частично завершен во время предварительного удаления печеночной ткани, что в конечном итоге приводит к тому же результату.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровеносные сосуды проявляются в виде белой и очень нежной нити примерно в 3-5 мм перорально дуоденального сосочка и соединяются с гепатодуоденальной связкой с левой боковой стороны, накапливаясь с желчным протоком к глиссонианской триаде. По завершении этого этапа окончательный образец полностью изолируется. Если есть необходимость в записи, изображения могут быть получены после организации структур желчных протоков в их анатомическое положение (рисунок 1). Рекомендуется делать последние шаги подготовки на пенопластовом коврике, потому что образец не будет прилипать так сильно к поверхности рабочего поля. Если поры влажные, желчный проток левитирует или плавает. При перемещении образца он не будет прилипать так же прочно, как при подготовке на операционной ткани, что приводит к отсутствию разрыва при перемещении образца.
6. Подготовка к гистологическому анализу
- Поместите изолированный образец в буферный раствор, специальную среду или формалинсодержащие фиксаторы (см. Таблицу материалов) как можно скорее после рассечения.
- Выберите подходящее решение для хранения в зависимости от дальнейших запланированных этапов обработки.
ВНИМАНИЕ: Используйте формалинсодержащие фиксаторы только под вентиляционным отверстием из-за острой токсичности, коррозионной активности и различных опасностей для здоровья.
ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном исследовании образцы EBDS были вставлены в параформальдегид, обезвожены и внедрены в парафин. Они хранятся при комнатной температуре и охлаждаются перед секционированием. В нагревательном шкафу 2 мкм ломтики хранились в течение ночи и окрашивались с использованием обычного гематоксилина и эозина4 (см. Таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1А показана EBDS новорожденного мыша, которая была рассечена с помощью описанной методики. Микроскопически больше печеночной ткани не видно. Печеночная ткань была удалена во время заключительных этапов выделения протокола и может быть легко отличима от ткани желчных протоков в отношении цвета и консистенции. На рисунке 1B показан изолированный образец в сравнении с миллиметровой шкалой. Длина EBD (измеряется от желчного пузыря до дуоденального сосочка) составляет менее 10 мм. Диаметр очень деликатного Ductus choledochus варьировался от 0,05-0,2 мм. На рисунке 2 изображено гематоксилин-эозиновое окрашивание продольного сечения EBDS с открытым просветом. Холангиоциты могут быть идентифицированы вокруг просвета как монослой и окрашены в более темный цвет. Микроскопию проводили с использованием 20-кратного увеличения. Рисунки показывают, что использование описанного протокола рассечения позволяет оператору микроскопически рассекать EBDS вблизи краев протока, даже у неонатальных мышей. Образцы были взяты у 9-дневных новорожденных мышей.
Рисунок 1: Рассечение EBDS. (A) Окончательный образец EBDS мышиного новорожденного. (1) Желчный пузырь, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Шкала бар = 500 мкм. (B) Размерный размер рассеченной EBDS по сравнению с миллиметровой шкалой. Шкала = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Продольный участок EBDS. Окрашивание гематоксилин-эозином показывает EBDS, содержащий открытый просвет. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Развитие веса новорожденных C57BL/6 до девятого дня их жизни. Новорожденных взвешивали до двух раз в день. Предоставленные данные показывают вес контрольных животных (n = 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье сообщалось и обсуждалось создание и валидация нового хирургического подхода к удалению EBDS усыпленных неонатальных мышей. Микроскопические и гистологические данные показывают, что подход быстро обнаруживает ЭБД и рассекает их вблизи краев протока, даже у неонатальных мышей. Для описываемого протокола требуются только хирургические инструменты и микроскоп с 20-кратным увеличением. Кроме того, этот подход позволяет изолировать всю EBDS. Техника очень эффективна, проста и проста в воспроизведении.
Для изучения заболеваний желчных протоков, таких как билиарная атрезия, PSC и PBC, часто требуется механическая экстракция всей системы желчных протоков. Из-за небольшого размера, особенно у новорожденных, трудно препарировать, обрабатывать и анализировать. Выделение внепеченочных протоковых клеток 1-дневных новорожденных мышей EBD уже установлено, однако метод был описан как сложный. Как правило, люди, не знакомые с этой процедурой, борются из-за технических проблем с методами рассечения, а также очищения небольших желчных протоков5. Поэтому операционная рабочая группа исследовала новую стратегию подготовки EBDS в модели неонатальной мыши. В настоящем исследовании этот метод позволяет эффективно распределять каждый образец. Новорожденных приносили в жертву в возрасте 9 дней, а желчные протоки собирали, как описано в протоколе. Кроме того, этот метод был также применим у молодых новорожденных. Некоторые люди умерли или должны были быть принесены в жертву до достижения девятого дня, включая новорожденных весом менее 2 г (дополнительный рисунок 1). Операторы должны учитывать более длительное время работы из-за неонатальной стадии развития. Дифференцировка тканей не слишком развита, что затрудняет подготовку и увеличивает сложность по сравнению с подготовкой взрослых образцов.
Еще одним побочным эффектом, касающимся сложности препарата, является высокая вероятность нежелательных клеток в образце, что может привести к загрязнению клеточных культур. Напротив, новый метод рассечения позволяет неопытным операторам с необходимым оборудованием удалять EBDS как можно более чистым. В результате еще более важно использовать наилучший подход, возможный для рассечения EBD у неонатальных мышей. При использовании, как указано в протоколе, атравматическое оборудование, сопровождаемое пенным ковриком, не будет или просто очень незначительно повреждать желчный проток. Поролоновая прокладка будет мягко противодействовать движениям оператора, рассекая нежелательную ткань, содержащую такие клетки, как гепатоциты и фибробласты EBD, не нанося ей вреда. На самом деле, даже желчь может быть сохранена. Кроме того, протокол описывает безопасный доступ к системе желчных протоков благодаря осторожному прогрессированию слой за слоем. В результате врожденные аномалии и спайки брюшины будут видны до того, как какая-либо ткань будет повреждена.
Одним из основных хирургических принципов во время операции с целью удаления (например, резекция опухоли или холецистэктомия у живых людей) является сохранение как можно большего количества здоровой ткани. Применимость этого принципа должна быть запрошена для выполнения хирургической подготовки у эвтанатизированных мышей. Для рассечения EBD было решено не щадить ткань печени, а скорее провести EbR EBDS, печени и двенадцатиперстной кишки, что оказалось большим техническим преимуществом и менее сложным, чем исключительно удаление EBD из брюшной полости. После EbR образец en-bloc переносили на пенный мат для перемещения ткани печени и загрязнения остатков.
Использование альтернативных хирургических методов для удаления всей внепеченочной системы желчных протоков не может рассматриваться для подготовки мышей после эвтаназии. Причиной этого является последовательность рабочих движений; Препарат сверху вниз, как следует из названия, начинается в верхней части (в данном случае желчного пузыря) и прогрессирует до соединения двенадцатиперстной кишки и холедохового протока. Для начала удалите желчный пузырь из ткани печени, затем кистозный проток и, наконец, общий печеночный и холедохусный проток к соединению двенадцатиперстной кишки и холедохового протока. Этот метод изоляции, используемый интраоперационно в брюшной полости неонатальных мышей, приводил к повреждению желчных протоков или сворачиванию изолированного желчного протока. Намотка была вызвана тем, что хватка была слишком свободной. Найти желчный проток после обмотки крайне сложно. Пытаясь избежать свертывания при дальнейших рассечениях, желчный проток или связанная фальциформная связка были затянуты более прочно, что останавливает нежелательное свертывание, но может привести к повреждению клеток с плохими результатами при последующем гистологическом исследовании. Для однократного рассечения желчного пузыря рекомендуется рассечение сверху вниз.
В альтернативной технике подготовка снизу вверх производится в противоположном порядке. Препарат начинают на стыке двенадцатиперстной кишки и холедохового протока. Во-вторых, двенадцатиперстную кишку нужно стянуть вниз каудально с помощью атравматических щипцов правой рукой, вызывая растяжение гепатодуоденальной связки и тем самым раскрывая желчный проток. В то же время используйте атравматические щипцы в левой руке для доступа к сальниковой бурсе и поддержания напряжения на гепатодуоденальной связке. Начиная с двенадцатиперстной кишки, достижима точная подготовка вплоть до слияния кистозного и общего печеночного протоков. Однако при дальнейшем рассечении кистозного протока печени и желчного пузыря напряжение может накапливаться в одной точке, что приводит к разрыву и сворачиванию желчного протока. Эксперименты показали, что препарат снизу вверх рекомендуется только для рассечения Ductus choledochus у новорожденных мышей.
Подводя итог, можно сказать, что препараты сверху вниз и снизу вверх продемонстрировали значительные недостатки в подготовке новорожденных мышей. В результате была разработана новая модель для облегчения рассечения полного EBDS, что позволяет надежно и эффективно идентифицировать и переносить местоположения желчных протоков в более поздние исследуемые гистологические контексты.
В дополнение к механическим и хирургическим подходам, ферментативное пищеварение стало более актуальным в обработке тканей за последние десятилетия 5,12. Высокоочищенные ферменты обеспечивают точную альтернативу нацеливанию на конкретные структуры, не нанося вреда клеткам, отобранным для дальнейших экспериментов.
Выделение экстра- и внутрипеченочных холангиоцитов успешно установлено у мышей и крыс 5,13,14,15,16. Тем не менее, оба метода позволяют изолировать отдельные клетки, когда неповрежденный желчный проток имеет решающее значение для определенных методов, в частности гистологических подходов. Кроме того, даже для подходов к клеточным культурам все опубликованные исследования требуют этапа механического рассечения до ферментативного пищеварения без предоставления подробного пошагового протокола. Предшествующее рассечение приводит к уменьшению загрязнения клеточной культуры, доказывая, что метод рассечения будет полезен для гистологических и различных экспериментальных подходов.
Вначале техника может потребовать некоторого времени для обучения. Практика увеличит скорость и результат. Операторы могут быть уверены, что простое следование поэтапному подходу приведет к легкой воспроизводимости и точной изоляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность Йоханне Хагенс, Паулине Шупперт, Кларе Филиппи, доктору медицинских наук Кристиану Томушату, Свенье Варнке, доктору Диане Линднер, профессору доктору Дирку Вестерманну, Мириам Томчак, Николь Людер, Надин Курзаве, доктору рер нат. Лайе Пагеролс Ралуй, Биргит Аппль и Магдалене Трохимюк за их вклад. Ганс Христиан Шмидт получил финансовую поддержку от стипендии Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Гамбург.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
