Summary
Murin neonatal safra kanalı bozukluklarının gözlenmesi için sağlam bir safra kanalı ve etkili bir hazırlık gereklidir. Bu nedenle, murin yenidoğanlarda tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin izole edilmesi için safra kanalının bütünlüğünü korurken başarılı bir şekilde yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Abstract
Murin neonatal safra kanallarının diseksiyonu zor olarak tanımlanmıştır. Tarif edilen standart çalışma prosedürünün temel amacı, fare yenidoğanlarında ekstrahepatik safra kanalının (EBD) hazırlık sırasında safra kanalına zarar vermeden izole edilmesidir. Kolanjiyositler hücre hattına kıyasla son derece yakın preparasyonu ve tüm ekstrahepatik safra kanalı sisteminin (EBDS) toplanması nedeniyle, tarif edilen yaklaşım, biliyer atrezi gibi yenidoğan safra kanalı bozukluklarının hayvan modellerinin araştırılmasında son derece yararlıdır. Ötanaziden sonra periton boşluğuna erişildi ve safra kanalı sistemi, duodenum ve karaciğer benzersiz En-bloc-Rezeksiyon (EbR) ile ekstrakte edildi. Ekstrakte edilen numune bir köpük paspas üzerine yerleştirilir ve EBD, gerekli dokunuş olmadan atravmatik olarak kirletici hücrelerden diseke edilir. EBDS'nin tamamının diseksiyonu bu yöntemin önemli bir avantajıdır. Safra kanalı dokusunun küçük boyutu ve miktarı nedeniyle dikkatli olunmalıdır. Tarif edilen tekniği kullanarak, kolanjiyositlere zarar verilmez. Ayrıca, tekniğin saflığı tekrarlanabilir (n = 10). Bu nedenle, optimum şekilde karşılaştırılabilir numuneler toplanabilir. Ayrıca, safra kanalı dokusu zarar görmez, çünkü safra kanalı sistemi ile herhangi bir temas, hazırlık sırasında önlenebilir ve safra sıvısı safra kesesi içinde bırakılır. En önemlisi, son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu yapılırken, safra kanalının sadece biraz yanalında sıkılmadan atravmatik mikroaletler kullanıldı. Bu, temiz ve sağlam bir numunenin anahtarıdır ve daha fazla histolojik araştırma veya kolanjiyositlerin izolasyonu için gereklidir. Özetlemek gerekirse, açıklanan yenilikçi diseksiyon tekniği, EBDS'yi mümkün olduğunca temiz bir şekilde izole etmek için gerekli ekipmana sahip özellikle deneyimsiz operatörlere olanak tanır.
Introduction
Biliyer atrezi, primer sklerozan kolanjit (PSK) ve primer biliyer kolanjit (PBK) gibi kolanjiyopatilerin oluşumu ve progresyonu bilinmemekte veya tamamlanmamıştır 1,2. Bu hastalıkların kökeni ve ilerlemesinin sınırlı bir şekilde anlaşılması, tedavi seçeneklerinin azlığına yol açmaktadır3. Yenidoğan safra yolu hastalıklarının incelenmesindeki en zor engel, patofizyolojinin moleküler olarak anlaşılmasını sağlamaktır. Moleküler patolojinin daha iyi anlaşılmasının temel anahtarlarından biri, etkilenen dokunun mümkün olan en iyi şekilde gözlemlenmesidir. Biliyer atrezi4'ün potansiyel viral etiyolojisini gözlemlemek gibi araştırmalar arasındaki karşılaştırılabilirliğin ve tutarsızlıkların azalmasını önlemek için, gerçekleştirilen diseksiyon tekniklerinin mümkün olan en iyi şekilde hazırlanması ve paylaşılması ihtiyacı ortaya çıkmaktadır. Hedef dokunun saf bir şekilde hazırlanması, daha sonraki mikroskobik araştırmalar veya üreme hücresi ve 3D organoid kültürleri için gereklidir. Bununla birlikte, murin yenidoğan bozukluklarında, doku örnekleri nadirdir ve çok küçük boyut nedeniyle sadece az miktarda ortaya çıkar. Safra yolu bozuklukları ile ilgili olarak, murin yenidoğanlarda safra kanallarının temiz bir şekilde hazırlanmasındaki zorluklar tanımlanmıştır5. Gelişimin yenidoğan aşaması nedeniyle, doku farklılaşması aşırı derecede gelişmiş değildir, bu da hazırlığı zorlaştırır ve yetişkin örneklerin hazırlanmasına kıyasla zorluğu arttırır. Bu nedenle, işletme çalışma grubu, EBDS'yi yenidoğan fare modelinde hazırlamak için yeni bir strateji araştırdı. Bu çalışmada, teknik her numunenin verimli bir şekilde diseksiyonuna izin vermektedir.
Safra kanalı sistemi, karaciğerden kaynaklanan sağ üst karın bölgesine intraperitoneal olarak yerleştirilir. Safra kesesi, karaciğerin sağ lobunun viseral yüzeyinin altında bulunur. Safra kanalı, portal ven ve hepatik arter ile birlikte, hepatoduodenal ligamente gömülüdür. Karaciğer ve duodenuma doğrudan katılır ve safra sıvısını duodenum6'ya boşaltır. Anatomik olarak, safra kanalı sağ ve sol hepatik kanallara, ortak hepatik kanala, kistik kanala ve kistik kanal ile ortak hepatik kanalın7'nin birleşmesiyle oluşan Ductus choledochus'a ayrılır. Bu sonunda safra sıvısını ve tükürüğü pankreas kanalından Vater'in Ampulla'sı aracılığıyla duodenuma boşaltır.
Kolanjiyositler safra kanalını intra- ve ekstrahepatik olarak hizalar, safra üretimine ve homeostaza yardımcı oldukları karmaşık bir anatomik niş içindebulunurlar 8. Safra sıvısı bu özel epitel hücrelerini günlük olarak yüksek konsantrasyonlarda geçirir. Özellikle, HCO3- şemsiye bakımı, safra asidi toksisitesine karşı korunmak için çok önemlidir9. Kolanjiyositler, hepatobiliyer sistemde, örneğin luminal mikroorganizmalara karşı ilk savunma hattıdır10. Kolanjiyositlerin toksik saldırılara karşı savunma etkinliği genetik yatkınlık nedeniyle zayıflayabilir. Toksik bir aşırı yük hasar ve yıkıma neden olur ve bu nedenle kolanjiyopatilere yol açabilir. Ayrıca, gelişmekte olan safra kanalı tüm kendini koruyucu mekanizmalara tamamen sahip değildir ve bu da yenidoğan safra kanallarında çevresel toksinlere karşı daha yüksek bir duyarlılığa yol açar11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik onayı takiben (N045/2021), erkek ve dişi C57BL/6 fare yenidoğanları 9 günlük olana kadar gözlendi. Hayvanlar, Hamburg, Almanya'daki Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi'nin hayvan tesisi tarafından deneysel amaçlar için doğdu ve sağlandı. Yenidoğanlar, ebeveyn hayvanlarıyla birlikte bir kafese yerleştirildi. Çevre koşulları sıcaklık (20-24 °C), 12:12 saat açık-karanlık döngüsü ve %40-%70 bağıl nem oranlarında kontrol edildi.
1. Deneysel hazırlık
- Makas, forseps vb. dahil olmak üzere cerrahi operasyon için gerekli ekipmanı hazırlayın (bkz.
- Dezenfekte edilmiş ve otoklavlanmış aletleri ameliyat masasının yanındaki steril bir yüzeye yerleştirin.
- P9 yaşındaki bir yenidoğan faresini, çalışan bir makasla kafasını keserek hızlı bir şekilde ötenazileştirin. Ötanize edilmiş yenidoğan faresinin gövdesini steril bir operasyon alanına yerleştirin. EBDS'leri 9 günlük fare yenidoğanlarında inceleyin (adım 5).
NOT: Açıklanan diseksiyon prosedürü, herhangi bir bilim insanına EBDS'yi yenidoğan ve yaşlı farelerden çıkarmak için uygun araçları sağlar. Fare ne kadar eski olursa, hazırlık o kadar kolay olur.
2. Peritoneal boşluğa erişim
- İdrar kesesinin bulunduğu yerin üzerindeki cildi forseps ile kavrayın. Periton ve altta yatan yapılara zarar vermeden makas kullanarak cilde 2 mm çapında bir delik açın. Sol ön aksiller çizgiyi takip ederek kesimi dekapitasyonun bulunduğu yere genişletin. Atravmatik forseps ile cildi soldan sağ tarafa doğru çıkarın.
- Dalağı çevreleyen peritona tutun. Periton çadır benzeri bir yapıya benzeyene kadar yavaşça kaldırın ve merkezde 1 mm çapında bir delik açın. "Peritoneal çadırın" havayla dolmasını bekleyin. Bu ve sonraki adımlar için 10x mikroskobik büyütme kullanın.
- Karaciğere, safra kanalı sistemine, mideye, ince bağırsaklara ve kolona tam erişim sağlamak için peritonu, alt kaburgalar, hem lateral karın bölgeleri hem de alt mesane bölgesi tarafından çerçevelenmiş bir pencerede kesin.
NOT: Karaciğere erişimi iyileştirmek için, ksifoid süreci, falsiform ligamenti, karaciğeri ve safra kanalı yapılarını sağlam bırakırken en düşük üç kaburgayı çıkararak ek bir kesi yapılabilir. Karaciğerin görünümünü elde etmek kolaydır.
3. Safra kesesi ve safra kanallarının incelenmesi
NOT: Aşağıdaki adımların tümü sırasında numuneyi düzenli olarak ıslak tuttuğunuzdan emin olun.
- Safra kesesini incelemek için ksifoid süreci kraniyoventral pozisyonda dikkatlice çekin.
NOT: Falciform ligament üzerindeki gerginlik bu hareketle artar ve bağlı safra kesesi görünür hale gelir.- Safra kesesi kanalının safra kanalı sisteminden yırtılmasına yol açabilecek falsiform ligamentin kontrol edilemeyen yırtılmasını önlemek için sadece hafif bir çekme işlemi yapın. Bir sonraki adımdan önce ksifoid işlemin çekişini serbest bırakın.
- Safra kanalı sistemini serbest bırakmak için duodenumu yavaşça aşağı çekin.
NOT: Hepatoduodenal ligament üzerindeki gerginlik arttıkça, safra kanalı dokusu görünür hale gelir.
4. En-blok-rezeksiyon
- Aşağıdaki adımları izleyerek alt en-blok mobilizasyonunu gerçekleştirin.
- Safra kanalı sistemini duodenuma bağlayan duodenal papillayı tanımlayın.
- Duodenumdan papillanın sağ lateral tarafına yaklaşık 2 cm kesin.
- Pilor bölgesinden kesin. Mide içeriğinin, kesme yeri ile duodenal papilla arasındaki pilorik bölgede bulunduğundan emin olun.
NOT: Bu, oral ve aboral duodenal parçaların doğru yeri için daha sonra oryantasyon güvenliği için önemli bir adımdır.
- Üst en-blok mobilizasyonunu gerçekleştirin.
- Ksifoid işlemi yavaşça çekin ve falciform ligamente erişin.
- Safra kesesi ile ksifoid süreç arasında, ksifoid sürece mümkün olduğunca yakın, falsiform ligamentten 1 cm uzunluğunda bir kesim yapın. Safra kesesine zarar vermediğinizden emin olun.
- Karaciğer ve toraks arasındaki aşağıdaki bağlantı yapılarını kesin: yemek borusu, inferior vena kava, torasik aort, karaciğerin çıplak alanını çevreleyen tüm bağlar ve dorsal olarak kalan tüm doku bağlantıları.
NOT: en-bloc örneği tamamen disseke edilmiştir. Karaciğer, safra kanalı sistemi ve midenin pilorik bölgesi ile bağlantılı duodenal korpus içerir.
5. Son safra kesesi ve safra kanalı diseksiyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek brüt hazırlığı gerçekleştirin.
- En-blok numunesini genellikle dehidrasyon için kullanılan bir köpük ped üzerine yerleştirin. Bu ve sonraki adımlar için 20x mikroskobik büyütme ve maksimum uç boyutu 6 mm olan iki mikrocerrahi atravmatik forseps kullanın.
- Numuneyi köpük ped üzerine monte edin. Numuneyi doğru anatomik konumda yeniden düzenleyin. Duodenumun oral ve aboral kısmını düzleştirerek yumuşak bir hareket gerçekleştirin.
- Hareketi duodenal papillada başlatın ve atravmatik forseps kullanarak kesici kenarlara devam edin. Sadece duodenumun oral kısmında ortaya çıkacak olan midenin beyaz hamurlu içeriğini yumuşatın. Olası safra kanalı rotasyonunu dışlamak için duodenumun oral ve aboral kısmını tanımladığınızdan emin olun.
- Safra kanalının diseksiyonuna başlamak için büyük karaciğer dokusu kalıntılarını kesin.
- Son yalıtımı gerçekleştirin.
- Kalan karaciğer dokusunu köpük paspasın gözeneklerine hafifçe bastırın. Kazıma hareketlerinin safra kanalı sisteminden başlayıp karaciğer sınırlarına yol açtığından emin olun.
- Çeşitli yönlerde birkaç kazıma hareketinden sonra numuneyi köpük paspas üzerinde daha temiz bir konuma aktarın. EBDS ve istenmeyen hücreler arasında mümkün olan en iyi ayrım için görünümü optimize etmek üzere arka planda daha az sıkılmış karaciğer dokusunun avantajını kullanın. Hepatik dokuyu safra kanalından hiçbir şey kalmayıncaya kadar veya mümkün olduğunca az kalana kadar kazıyın.
- İzole EBDS kalana kadar hepatoduodenal ligamenti işleyin. Hepatik arter, portal ven ve küçük kalıntılar gibi intraligamentöz kan damarlarını çıkarın. Bu hassas filamenti, yumuşak bir çekiş ve yüksek özenle sol yanal tarafa çıkarın. Bu diseksiyon adımı, hepatik dokunun önceden çıkarılması sırasında istemeden veya kısmen tamamlanmış olabilir, bu da sonunda aynı sonuca yol açar.
NOT: Kan damarları, duodenal papillanın oral yoldan yaklaşık 3-5 mm beyaz ve çok hassas bir filament olarak ortaya çıkar ve sol lateral taraftan hepatoduodenal ligamente katılır ve safra kanalı ile glissonian üçlüsüne birikir. Bu adımın tamamlanmasıyla, son numune tamamen izole edilir. Kayıt ihtiyacı varsa, safra kanalı yapılarını anatomik konumlarına göre düzenledikten sonra görüntüler yakalanabilir (Şekil 1). Son hazırlık adımlarının bir köpük paspas üzerinde yapılması önerilir, çünkü numune operasyon alanının yüzeyine çok fazla yapışmayacaktır. Gözenekler ıslaksa, safra kanalı yükselir veya yüzer. Numuneyi hareket ettirirken, operasyon bezi üzerindeki preparatta olduğu kadar sıkı yapışmaz, bu da numuneyi hareket ettirirken yırtılmaya neden olmaz.
6. Histolojik analiz için hazırlık
- İzole edilmiş numuneyi, diseksiyondan sonra mümkün olan en kısa sürede tamponlanmış bir çözeltiye, özel bir ortama veya formalin içeren fiksatif maddelere (bakınız Malzeme Tablosu) koyun.
- Daha fazla planlanan işleme adımlarına bağlı olarak uygun bir depolama çözümü seçin.
DİKKAT: Formalin içeren fiksatörleri akut toksisite, aşındırıcılık ve çeşitli sağlık tehlikeleri nedeniyle sadece bir havalandırma deliği altında kullanın.
NOT: Sunulan çalışmada, EBDS örnekleri paraformaldehit içine yerleştirilmiş, dehidrate edilmiş ve parafin içine gömülmüştür. Oda sıcaklığında saklanmışlar ve bölümlemeden önce soğutulmuşlardır. Bir ısıtma kabininde, 2 μm dilimler gece boyunca tutuldu ve geleneksel hematoksilin ve eozin4 kullanılarak boyandı (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1A , tarif edilen teknikle diseke edilen bir murin yenidoğanının EBDS'sini göstermektedir. Mikroskopik olarak, başka karaciğer dokusu görülmez. Hepatik doku, protokolün son izolasyon aşamalarında çıkarılmıştır ve renk ve kıvam açısından safra kanalı dokusundan kolayca ayırt edilebilir. Şekil 1B , milimetre ölçeğine kıyasla izole edilmiş numuneyi göstermektedir. EBD'nin uzunluğu (safra kesesinden duodenal papillaya kadar ölçülür) 10 mm'den azdır. Çok hassas Ductus choledochus'un çapı 0.05-0.2 mm arasında değişmektedir. Şekil 2 , EBDS'nin uzunlamasına bir bölümünün hematoksilin-eozin boyamasını açık bir lümen ile göstermektedir. Kolanjiyositler, lümeni çevreleyen tek katmanlı ve daha koyu boyalı olarak tanımlanabilir. Mikroskopi 20x büyütme kullanılarak yapıldı. Rakamlar, açıklanan diseksiyon protokolünün kullanılmasının, operatörün yenidoğan farelerde bile, kanalın kenar boşluklarına yakın EBDS'yi mikroskobik olarak diseke etmesini sağladığını göstermektedir. Örnekler 9 günlük murin yenidoğanlardan alındı.
Şekil 1: EBDS diseksiyonu. (A) Bir murin yenidoğanının nihai EBDS örneği. (1) Safra kesesi, (2) Ductus cysticus, (3) Ductus hepaticus dexter, (4) Ductus hepaticus sinister, (5) Ductus hepaticus communis, (6) Ductus choledochus, (7) Duodenum. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Disseke edilen EBDS'nin milimetre ölçeğine kıyasla boyut boyutu. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: EBDS'nin uzunlamasına kesiti. Hematoksilin-eozin boyaması, açık lümen içeren EBDS'yi gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: C57BL/6-yenidoğanların yaşamlarının dokuzuncu gününe kadar ağırlık gelişimi. Yenidoğanlar günde iki defaya kadar tartıldı. Sağlanan veriler kontrol hayvanlarının ağırlığını göstermektedir (n = 5). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, ötenazi yenidoğan farelerinin EBDS'lerinin çıkarılması için yeni bir cerrahi yaklaşımın oluşturulması ve doğrulanması bildirilmiş ve tartışılmıştır. Mikroskopik ve histolojik bulgular, yaklaşımın EBD'leri hızlı bir şekilde tespit ettiğini ve yenidoğan farelerde bile kanal kenarlarına yakın bir yerde diseke ettiğini ortaya koymaktadır. Tarif edilen protokol için sadece cerrahi aletler ve 20x büyütmeli bir mikroskop gereklidir. Ayrıca, yaklaşım tüm EBDS'nin izolasyonuna izin verir. Teknik son derece verimli, basit ve çoğaltılması kolaydır.
Biliyer atrezi, PSC ve PBC gibi safra kanalı hastalıklarının incelenmesi için, tüm safra kanalı sisteminin mekanik ekstraksiyonu sıklıkla gereklidir. Küçük boyut nedeniyle, özellikle yenidoğanlarda, diseksiyon, işleme ve analiz etmek zordur. 1 günlük yenidoğan fare EBD'lerinin ekstrahepatik duktal hücrelerinin izolasyonu zaten kurulmuştur, ancak yöntem zor olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, bu prosedüre yeni başlayan bireyler, diseksiyon tekniklerinin yanı sıra küçük safra kanallarının temizlenmesi ile ilgili teknik zorluklar nedeniyle mücadele ederler5. Bu nedenle, işletme çalışma grubu, EBDS'yi yenidoğan fare modelinde hazırlamak için yeni bir strateji araştırdı. Bu çalışmada, teknik her numunenin verimli bir şekilde diseksiyonuna izin vermektedir. Yenidoğanlar 9 günlükken kurban edildi ve protokolde açıklandığı gibi safra kanalları toplandı. Ayrıca, teknik genç yenidoğanlarda da uygulanabilirdi. Bazı bireyler, 2 g'dan daha hafif yenidoğanlar da dahil olmak üzere, dokuzuncu güne ulaşmadan önce öldü veya kurban edilmek zorunda kaldı (Ek Şekil 1). Operatörler, gelişimin yenidoğan aşaması nedeniyle daha uzun bir çalışma süresi düşünmelidir. Doku farklılaşması aşırı gelişmiş değildir, bu da hazırlığı zorlaştırır ve yetişkin örneklerin hazırlanmasına kıyasla zorluğu arttırır.
Preparatın zorluğu ile ilgili bir diğer yan etki, numunede istenmeyen hücrelerin bulunma olasılığının yüksek olmasıdır ve bu da hücre kültürlerinde kontaminasyona neden olabilir. Buna karşılık, yeni diseksiyon tekniği, deneyimsiz operatörlerin EBDS'yi mümkün olduğunca temiz bir şekilde çıkarmak için gerekli ekipmana sahip olmalarını sağlar. Sonuç olarak, yenidoğan farelerde EBD diseksiyonu için mümkün olan en iyi yaklaşımı kullanmak daha da kritiktir. Protokolde belirtildiği gibi kullanılırsa, bir köpük paspas eşliğinde atravmatik ekipman, safra kanalına zarar vermez veya çok hafif bir şekilde zarar verir. Köpük ped, istenmeyen dokuyu parçalara ayırırken, EBD'nin hepatositleri ve fibroblastları gibi hücreleri zarar vermeden parçalara ayırırken operatörün hareketlerine yumuşak bir şekilde karşı koyacaktır. Aslında, safra bile korunabilir. Ek olarak, protokol, katman katman dikkatli bir şekilde ilerlemesi nedeniyle safra kanalı sistemine güvenli erişimi tanımlar. Sonuç olarak, herhangi bir doku hasar görmeden önce konjenital anormallikler ve periton yapışıklıkları görülecektir.
Operasyon sırasında çıkarılması amacıyla (örneğin, canlı bireylerde tümör rezeksiyonu veya kolesistektomi) önemli bir cerrahi prensip, mümkün olduğunca sağlıklı dokuyu ayırmaktır. Bu prensibin uygulanabilirliği, ötenazi farelerde cerrahi preparatın uygulanması için talep edilmelidir. EBD diseksiyonu için, karaciğer dokusunun yedeklenmemesine, bunun yerine EBDS, karaciğer ve duodenum korpusunun bir EbR'sinin uygulanmasına karar verildi, bu da büyük bir teknik avantaj olduğu ve EBD'nin karın boşluğundan çıkarılmasından daha az zor olduğu kanıtlandı. EbR'den sonra, en-blok numunesi karaciğer dokusunun hareketi ve kirletici kalıntılar için bir köpük paspasa aktarıldı.
Tüm ekstrahepatik safra kanalı sistemini çıkarmak için alternatif cerrahi tekniklerin kullanılması, ötenazi sonrası fare hazırlığı için düşünülemez. Bunun nedeni operasyon hareketlerinin sırasıdır; Yukarıdan aşağıya hazırlık, adından da anlaşılacağı gibi, üstten başlar (bu durumda, safra kesesi) ve duodenum ve Ductus choledochus'un birleşme noktasına kadar ilerler. Başlamak için, safra kesesini karaciğer dokusundan, daha sonra kistik kanaldan ve son olarak ortak hepatik ve duktus choledochus'u duodenum ve ductus choledochus'un birleşme noktasına çıkarın. Yenidoğan farelerin karnında intraoperatif olarak kullanılan bu izolasyon tekniği safra kanalı yaralanmasına veya izole safra kanalının sarılmasına neden olmuştur. Sarmal, kavramanın çok gevşek olmasının bir sonucu olarak ortaya çıktı. Bobinlemeden sonra safra kanalını bulmak son derece zordur. Daha sonraki diseksiyonlarda sargıdan kaçınmaya çalışarak, safra kanalı veya bağlı falsiform ligament daha sıkı sıkılaştırıldı, bu da istenmeyen sarmalları durdurdu, ancak sonraki histolojik incelemede kötü sonuçlarla hücresel hasara neden olabilir. Tek safra kesesi diseksiyonu için yukarıdan aşağıya diseksiyon önerilir.
Alternatif bir teknikte, aşağıdan yukarıya hazırlık ters sırada yapılır. Hazırlık, duodenum ve Ductus choledochus'un birleşme noktasında başlar. İkincisi, duodenumun sağ elle atravmatik forseps kullanılarak kaudal olarak aşağı çekilmesi gerekir, bu da hepatoduodenal ligamentin gerilmesine neden olur ve böylece safra kanalını ortaya çıkarır. Bu arada, omental bursaya erişmek ve hepatoduodenal ligament üzerindeki gerginliği korumak için sol eldeki atravmatik forsepsleri kullanın. Duodenumdan başlayarak, kistik ve ortak hepatik kanalın birleşmesine kadar doğru bir preparat elde edilebilir. Bununla birlikte, karaciğerin kistik kanalını ve safra kesesini daha da diseke ederken, gerginlik bir noktada birikebilir ve safra kanalının yırtılmasına ve sarılmasına neden olabilir. Deneyler, aşağıdan yukarıya hazırlığın sadece yenidoğan farelerde Ductus choledochus'un diseksiyonu için önerildiğini göstermiştir.
Özetlemek gerekirse, yukarıdan aşağıya ve aşağıdan yukarıya hazırlıklar, yenidoğan farelerin hazırlanmasında önemli dezavantajlar göstermiştir. Sonuç olarak, yeni model, tüm EBDS'nin diseksiyonunu daha kolay sağlamak için geliştirilmiştir, bu da safra kanalı konumlarının tanımlanmasına ve daha sonra incelenen histolojik bağlamlara güvenilir ve verimli bir şekilde aktarılmasına olanak tanır.
Mekanik ve cerrahi yaklaşımlara ek olarak, enzimatik sindirim son yıllarda doku işlemede daha alakalı hale gelmiştir 5,12. Yüksek saflıkta enzimler, daha ileri deneyler için seçilen hücrelere zarar vermeden spesifik yapıları hedeflemek için kesin bir alternatif sunar.
Ekstra- ve intrahepatik kolanjiyositlerin izolasyonu farelerde ve sıçanlarda 5,13,14,15,16 başarıyla kurulmuştur. Bununla birlikte, her iki teknik de, sağlam bir safra kanalı belirli teknikler için, özellikle de histolojik yaklaşımlar için kritik olduğunda tek hücrelerin izole edilmesine izin verir. Ek olarak, hücre kültürü yaklaşımları için bile, yayınlanmış tüm çalışmalar, ayrıntılı bir adım adım protokol sağlamadan enzimatik sindirimden önce mekanik bir diseksiyon adımı gerektirir. Önceki diseksiyon, hücre kültürü kontaminasyonunun azalmasıyla sonuçlanır, bu da diseksiyon tekniğinin histolojik ve çeşitli deneysel yaklaşımlar için avantajlı olacağını kanıtlar.
Başlangıçta, teknik eğitim için biraz zaman gerektirebilir. Pratik yapmak hızı ve sonucu artıracaktır. Operatörler, adım adım yaklaşımı izlemenin kolay tekrarlanabilirlik ve doğru izolasyona yol açacağından emin olabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl ve Magdalena Trochimiuk'a katkılarından dolayı teşekkür eder. Hans Christian Schmidt, Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME Bursu (2021_EKPK.10), UKE, Hamburg tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | used as a dehydrating agent |
| 30 G canula | B Braun/Sterican, Melsungen Germany | 4656300 | canula for hydration of the sample |
| Air vent | C + P Möbelsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Germany | Tec-Ononmic AZ 1200 | the use of an air vent helps to avoid inhalation of formalin-containing fixatives |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Germany | 2351744 | saline; Container: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, sterile |
| Bigger microsurgical Forceps | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | straight, 180 mm (7"), platform tip, round handle, width: 0,800 mm, diamond dust coated, non-sterile, reusable optional tool for observation and every step of preparation except very final preparation; Dividing skin of the peritoneum |
| Camera “SmartCAM 5” | Basler and Vision Engineering, Send, United Kingdom | EVC131A | optional Lynx Exo camera modul: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2"; Used for videoproduction and technical evaluation |
| Dehydration machine/Citadel 2000 Tissue Processor | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 12612613 | used for automatic dehydration, short program (approx. 4.8 h) |
| Dehydration sponge | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | TT56.1 | sponge for final dissection step, other sponges/foam pads with a minimum pore size of 60 pores per inch are also suitable, the use of two foam pads per embedding cassette is recomended to cover the sample from below and above to prevent sliding through the perforation of the embedding cassettes |
| Dulbecco´s Phosphat Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn´t contain Calzium or Magnesium, 500 mL |
| Embedding cassettes | Engelbrecht GmbH, Edermünde, Germany | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-6660-00 | staining solution, ready to use |
| Fine Scissors CeramaCut | FST, Heidelberg Germany | 14959-09 | Tips: Sharp-Sharp, Alloy / Material: Ceramic Coated Stainless Steel, Serrated:, Yes; Feature: CeramaCut, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 22 mm, Length: 9 cm; Skin incision, incision of the peritoneal window |
| Graefe Forceps | FST, Heidelberg Germany | 11051-10 | Length: 10 cm, Tip Shape: curved, serrated, Tip width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 x 0.7 mm, Alloy /Material: Stainless Steel |
| Hematoxylin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | 41-5130-00 | staining solution, ready to use |
| Highresolotion microscope | Vision Engineering, Send United Kingdom | EVO503 | Capable of enlargement up to 60x magnification, only 6x to 20x magnification were used |
| Microscope | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburg, Germany | BX60F5 | |
| Microscope Cover Glases | Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 101244 | 60 mm broad, made of SCHOTT D 263 glass |
| Microscope Slides | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Germany | 03-0060 | |
| Microtome | Leica, Nußloch, Germany | SM2010R | Tool for sectioning (2 µm-slices) |
| Omnifix-F 1 mL syringe | B Braun, Melsungen, Germany | 9161406V | syringe without canula |
| Paraffin | Sakura Finetec, Torrance, USA | 4511 | Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO |
| Paraffin embedding machine | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Germany | TES 99 | The embedding machine used in this study contained the following three individual modules: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. The sample should be embedded in Paraffin directly after the dehydration, no interim storage in a fridge should be performed due to possible shrinking and moisture in the fridge |
| Paraformaldehyde (PFA) | Morphisto | 1176201000 | Prepare 1 mL Aliquots in 2 mL Eppendorf conical Tubes for liver samples and 0.5 mL Aliquots in 1 mL Eppendorf conical Tubes for extrahepatic bile duct samples, 4% in PBS ph 7.4 |
| Small Microsurgical Forceps | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bütthard, Bayern, Germany | (00)165 | Round handle, straight, 0.3 mm tip, tool for observation and every step of preparation, especially useful in final preparation |
| Stainless Steel Ruler | Agntho's AB, Lidingö, Sweden | 30085-15 | 150mm With Metric & Inch Graduations |
| Surgical Scissors – Sharp-blunt for decapitation | FST, Heidelberg Germany | 14001-14 | Device for decapitation |
| Warming cabinet | Haraeus, Hanau, Germany | T 6060 | the sliced samples should be kept in the warming cabinet to ensure the attachement of the sample on the microscope slides |
References
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G. Biliary tract: Newly identified biliatresone causes biliary atresia. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 12 (7), 369 (2015).
- Mack, C. L., Sokol, R. J. Unraveling the pathogenesis and etiology of biliary atresia. Pediatric Research. 57 (5), 87-94 (2005).
- Karjoo, S., Wells, R. G. Isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes. Journal of Visualized Experiments. (88), e51621 (2014).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Functional anatomy of normal bile ducts. The Anatomical Record: Advances in Integrative Anatomy and Evolutionary Biology. 291 (6), 653-660 (2008).
- Nakanuma, Y., Hoso, M., Sanzen, T., Sasaki, M. Microstructure and development of the normal and pathologic biliary tract in humans, including blood supply. Microscopy Research and Technique. 38 (6), 552-570 (1997).
- Banales, J. M., et al. Cholangiocyte pathobiology. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (5), 269-281 (2019).
- de Buy Wenniger, L. J., et al. The cholangiocyte glycocalyx stabilizes the 'biliary HCO3- umbrella': an integrated line of defense against toxic bile acids. Digestive Diseases. 33 (3), 397-407 (2015).
- Pinto, C., Giordano, D. M., Maroni, L., Marzioni, M. Role of inflammation and proinflammatory cytokines in cholangiocyte pathophysiology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (4), 1270-1278 (2018).
- Khandekar, G., et al. Coordinated development of the mouse extrahepatic bile duct: Implications for neonatal susceptibility to biliary injury. Journal of Hepatology. 72 (1), 135-145 (2020).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schäfer, K. -H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5 (1), 9226 (2015).
- Ishii, M., Vroman, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Laboratory Investigation. 74 (1), 303-313 (1996).
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 113 (6), 689-694 (1989).
