Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Abstract

Candida-soorten zijn de vierde meest voorkomende oorzaak van systemische nosocomiale infecties. Systemische of invasieve candidiasis omvat vaak biofilmvorming op geïmplanteerde apparaten of katheters, wat geassocieerd is met verhoogde virulentie en mortaliteit. Biofilms geproduceerd door verschillende Candida-soorten vertonen een verhoogde weerstand tegen verschillende antischimmelmiddelen. Daarom is het nodig om effectieve immunotherapieën of aanvullende behandelingen tegen Candida-biofilms te ontwikkelen. Hoewel de rol van cellulaire immuniteit goed is ingeburgerd bij anti-Candida-bescherming, is de rol van humorale immuniteit minder bestudeerd.

Er is verondersteld dat remming van biofilmvorming en rijping een van de belangrijkste functies van beschermende antilichamen is, en Candida albicans kiembuisantistoffen (CAGTA) hebben aangetoond dat ze in vitro groei en biofilmvorming van C. albicans eerder onderdrukken. Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de rol van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis. De methodologie voor dit protocol omvat C. tropicalis biofilmvorming in 96-well microtiter platen, die vervolgens werden geïncubeerd in de aan- of afwezigheid van antigeen-specifieke antilichamen, gevolgd door een 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) test voor het meten van de metabole activiteit van schimmelcellen in de biofilm.

De specificiteit werd bevestigd door het gebruik van geschikte serumcontroles, waaronder Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum. De resultaten tonen aan dat antilichamen in het serum van geïmmuniseerde dieren de rijping van candida-biofilm in vitro kunnen remmen. Samenvattend biedt dit artikel belangrijke inzichten met betrekking tot het potentieel van antilichamen bij het ontwikkelen van nieuwe immunotherapieën en synergetische of aanvullende behandelingen tegen biofilms tijdens invasieve candidiasis. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Introduction

Systemische candidiasis is de vierde belangrijke oorzaak van nosocomiale infecties, die wereldwijd worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers. Wereldwijd treft systemische candidiasis ongeveer 700.000 personen1. Candida-soorten, namelijk C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata en C. auris, zijn de meest voorkomende oorzaak van invasieve Candida-infecties 2. Candida-soorten zijn opportunistische pathogenen die biofilms produceren3. Biofilms worden voornamelijk geassocieerd met Candida virulentie, en Candida kan bestand zijn tegen oxidatieve en osmotische stressomstandigheden door biofilmvorming te induceren4. Biofilms moduleren verder de expressie van virulentiefactoren en celwandcomponenten en vormen een exopolymere beschermende matrix, waardoor Candida zich kan aanpassen aan verschillende gastheerniches4. Biofilms dragen bij tot de hechting van gist op gastheerweefsels en medische instrumenten5. Als zodanig is biofilmvorming geassocieerd met een voordeel voor gisten, omdat gistcellen in de biofilms de immuunrespons van de gastheer kunnen ontwijken6. Biofilmvorming beschermt ook de pathogene gisten tegen de werking van antischimmelmiddelen5. Verminderde gevoeligheid van C. albicans biofilms voor amfotericine B is aangetoond door Pierce et al.7,8. Bovendien tonen biofilms antischimmelresistentie tegen fluconazol, wat een effectief beheer van systemische candidiasis schaadt 9,10.

Microben hebben een intrinsieke neiging om zich te hechten aan verschillende biotische en abiotische oppervlakken, wat resulteert in biofilmvorming. Candida albicans, een dimorfe schimmel, komt voor in gist- en hyphale vormen en de biofilmvorming ervan is gekarakteriseerd in verschillende in vitro en in vivo modelsystemen11. De stappen van biofilmvorming omvatten de hechting van Candida-cellen aan het substraat, filamentatie, proliferatie en biofilmrijping11. Aanvankelijk hecht de gistvorm van C. albicans zich aan substraten, waaronder medische hulpmiddelen en menselijk weefsel, gevolgd door filamentatie en proliferatie van C. albicans in hyphale en pseudohyphale vormen, en ten slotte rijping van biofilms ingebed in extracellulaire matrix11. Biofilmvorming draagt grotendeels bij aan C. albicans pathogenese mechanismen12. Candida-soorten vormen resistente biofilms, waardoor hun uitroeiing uitdagendis 13. Een kleine subgroep van de C. albicans biofilmproducerende populatie is beschreven als zeer resistent tegen de antischimmelmiddelen amfotericine B en chloorhexidine14. Van belang is dat gistcellen in biofilms een hoge weerstand vertonen tegen multidrugtherapie in vergelijking met gistcellen in de planktonfase en proliferatiefase14. Er is gesuggereerd dat gistcellen in biofilms zeer tolerant zijn voor antischimmelmiddelen, wat bijdraagt aan de overleving van C. albicans in biofilms14. Deze bestaande cellen waren fenotypische varianten van C. albicans en geen mutanten14. Bovendien zijn cellen van Candida-biofilms die bekend staan als "persistercellen" tolerant voor hoge doses amfotericine-B-behandeling en dragen ze bij aan de overleving van Candida, waardoor ze een grote last vormen van terugkerende systemische Candida-infecties bij personen met een hoog risico15.

De toename van antischimmelresistentie bij Candida-stammen vereist onderzoek naar nieuwe antischimmelmiddelen en immunotherapieën. Zoals blijkt uit de bovengenoemde studies, tonen Candida-biofilms een verminderde gevoeligheid voor antischimmelmiddelen. Daarom is er behoefte aan verbeterde immunotherapieën om candida biofilmvorming onder controle te houden. Eerdere studies hebben aangetoond dat CAGTA effectieve bescherming kan bieden tegen systemische Candida-infecties door de vorming van C. albicans biofilm in vitrote remmen 16. Een andere studie meldde dat immunisatie van muizen met C. albicans rAls3-N-eiwit hoge antilichaamtiters induceert die interfereren met de vorming van C. albicans biofilm in vitro17. Anti-Als3-N antilichamen oefenden ook een remmend effect uit op C. albicans dispersie uit biofilms17. NDV-3A-vaccin op basis van C. albicans wordt momenteel klinisch getest en anti-NDV-3A-sera bleken ook de vorming van C. auris-biofilm te verminderen18. Een recente studie identificeerde remming van biofilmvorming door Sap2-antilichamen als een beschermingsmechanisme in een muizenmodel van systemische candidiasis19.

Dit artikel schetst een gedetailleerd in vitro protocol voor het evalueren van het effect van antigeenspecifieke antilichamen aanwezig in polyklonaal serum verkregen uit verschillende groepen Sap2-gevaccineerde muizen op voorgevormde Candida tropicalis-biofilms . Om dit te bereiken, werd een methode op basis van een XTT-reductietest geoptimaliseerd en ontwikkeld in het laboratorium, die de levensvatbaarheid van biofilm op een snelle, gevoelige en high-throughput manier kan meten, in de aan- of afwezigheid van antilichamen.

De XTT-test wordt gebruikt om cellulaire metabole activiteit te meten als een indicator van de levensvatbaarheid van cellen, cellulaire proliferatie en cytotoxiciteit20. Deze colorimetrische test is gebaseerd op de reductie van een geel tetrazoliumzout, natrium 3'-[1-(fenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis (4-methoxy-6-nitro) benzeensulfonzuurhydraat (XTT) tot een oranje formazankleurstof door metabolisch actieve cellen. Omdat alleen levensvatbare cellen XTT kunnen verminderen, is de hoeveelheid verminderde XTT-formazan evenredig met de intensiteit van kleur en levensvatbaarheid van cellen. De gevormde formazankleurstof is wateroplosbaar en wordt direct gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer. Vanwege de in water oplosbare aard maakt de XTT-test de studie van intacte biofilms mogelijk, evenals het onderzoek van de gevoeligheid van biofilmgeneesmiddelen, zonder verstoring van de biofilmstructuur21. Bovendien wordt deze methode geïmplementeerd in Candida schimmel levensvatbaarheid beoordelingen vanwege het gebruiksgemak, snelheid, nauwkeurigheid, hoge doorvoer en hoge mate van reproduceerbaarheid 7,22.

Naast de XTT-reductietest zijn er ook tal van alternatieve technieken geïdentificeerd voor het meten van de hoeveelheid biofilm. Sommige hiervan omvatten het gebruik van de MTT-reductietest, kristalvioletkleuring, DNA-kwantificering, kwantitatieve PCR, eiwitkwantificering, droge celgewichtmeting en levensvatbare kolonietelling. Deze procedures variëren sterk in termen van hun tijd- en kostenvereisten. Taff et al. voerden een vergelijkende analyse uit van zeven verschillende Candida biofilm quantitatie assays en vonden dat de XTT assay de meest reproduceerbare, nauwkeurige en efficiënte methode leverde voor de kwantitatieve schatting van C. albicans biofilms23. Kleuringstechnieken zoals kristalviolet hebben bepaalde beperkingen; de kristalviolettest bepaalt indirect de hoeveelheid biofilm door de optische dichtheid van de met kristalvioleten gekleurde biofilmmatrix en cellen te meten. Hoewel de kristalviolettest een goede maat voor de biofilmmassa biedt, geeft het geen maat voor de levensvatbaarheid van de biofilm, omdat het zowel microbiële cellen als de extracellulaire matrixkleurt 24. Dhale et al. rapporteerden verder dat de XTT-reductietest de meest gevoelige, reproduceerbare, nauwkeurige, efficiënte en specifieke methode was om biofilmproductie te detecteren in vergelijking met kristalviolettest25. Literatuurrapporten hebben aangetoond dat de XTT-test goed correleert met de CFU / ml-parameter in de CFU-telmethode. In vergelijking met de XTT-test is de CFU-methode echter arbeidsintensief en traag26. Bovendien is de fractie van losse levende cellen mogelijk niet representatief voor de initiële biofilmpopulatie27. Hoewel de XTT-reductietest de best beschikbare optie lijkt om de levensvatbaarheid te kwantificeren, zijn er een paar beperkingen van deze techniek. Hoewel de XTT-methode nuttig is voor vergelijkingen met één schimmelstam, kan het gebruik ervan beperkt zijn bij het vergelijken van verschillende schimmelstammen en soorten. Interstrain-vergelijkingen kunnen moeilijk zijn bij gebrek aan gedetailleerde standaardisatie, omdat verschillende stammen substraten metaboliseren met verschillende mogelijkheden21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BALB/c muizen werden ondergebracht in de Small Animal Facility bij IIT Roorkee. Alle dieren werden gehouden in een 12 h:12 h licht:donker cyclus bij 25 °C en werden voorzien van een pelletdieet en water ad libitum. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) van IIT Roorkee.

1. Bereiding van C. tropicalis

OPMERKING: De schimmel Candida tropicalis behoort tot de pathogenen van risicogroep 2 en is geclassificeerd als een BSL2-micro-organisme. Gebruik altijd gecertificeerde klasse II biologische veiligheidskasten bij het werken met Candida-soorten . Oefen aseptische en steriele technieken tijdens het werken met C. tropicalis en volg de aanbevolen bioveiligheidsprocedures voor een goede verwijdering van deze ziekteverwekker.

  1. Streak C. tropicalis (stam ATCC 750) op een Sabouraud dextrose (SAB) agar plaat.
  2. Bereid een 's nachts gekweekte kweek van C. tropicalis door een enkele kolonie van de SAB-agarplaat in een steriele conische buis van 50 ml met 10 ml SAB-bouillonmedium te enten. U kunt ook een bevroren glycerolvoorraad van C. tropicalis gebruiken en 100 μL van de glycerolvoorraad inenten in een steriele erlenmeyer van 250 ml met 50 ml SAB-bouillonmedium.
  3. Incubeer C. tropicalis cultuur in een orbitale shaker bij 180 rpm bij 30 °C gedurende 24-48 h.
  4. Centrifugeer de schimmelcultuur (cellen in logaritmische fase) bij 2.150 × g gedurende 15 minuten bij 21 °C.
  5. Gooi het supernatant weg en voeg 50 ml steriele 1x PBS toe aan de pellet. Was en resuspendeer de pellet in steriele 1x PBS met zachte vortexing.
  6. Centrifugeer opnieuw bij 2.150 × g gedurende 15 minuten bij 21 °C. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de schimmelkorrel in 10 ml steriele 1x PBS.
  7. Bereken de concentratie van cellen door te tellen met een hemocytometer.
  8. Bereid schimmelvoorraden met een uiteindelijke dichtheid van 1,0 × 106 cellen / ml in RPMI 1640 morfolinepropanenulfonzuur (MOPS) medium. Gebruik de celsuspensie uit stap 1.6 onmiddellijk.
    OPMERKING: Om één 96-well plaat op te zetten, is het totale benodigde schimmelbestandvolume 10 ml (100 μL / put). Schaal indien nodig.

2. C. tropicalis biofilmvorming

  1. Bereid Candida-biofilms in een polystyreen microtiterplaat met 96 goed platte bodem zoals eerder beschreven (figuur 1)28,29.
  2. Voeg 100 μL C. tropicalis-cultuur (uit 106 cellen/ml bouillon, bereid zoals hierboven) toe aan een 96-well microtiterplaat met behulp van een meerkanaals pipet (figuur 2A). Houd de laatste twee kolommen (11 en 12) als 'geen schimmel plus serum' en 'geen schimmel en geen serum' negatieve controles door geen schimmelcellen toe te voegen. Vul kolommen 11 en 12 met alleen 100 μL RPMI 1640 MOPS-medium.
  3. Bedek de microtiterplaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C onder stationaire omstandigheden.
  4. De volgende dag ademt u het medium voorzichtig op met een meerkanaals pipet (zonder de biofilms aan te raken of te verstoren). Tik de plaat voorzichtig in omgekeerde positie op vloeiplaten om eventuele resten te verwijderen.
  5. Was de plaat met 200 μL 1x PBS (per putje) met een meerkanaals pipet. Voeg PBS heel voorzichtig toe langs de zijwanden van de put om te voorkomen dat biofilms worden verstoord. Aspirateer de PBS voorzichtig met behulp van een meerkanaals pipet. Herhaal de PBS-was 2x (in totaal drie wasbeurten).
  6. Om overtollige PBS te verwijderen, droogt u de plaat (zonder deksel) gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur, in een biologische veiligheidskast.

3. Behandeling van biofilm met antilichamen

OPMERKING: Biofilms kunnen nu worden verwerkt voor het beoordelen van de remming van biofilmrijping door antilichamen. Muizenserum werd gebruikt als bron van polyklonale antilichamen. Verschillende groepen sap2-geïmmuniseerde (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis en Sap2-parapsilosis) samen met sham-geïmmuniseerde muizen werden retro-orbitaal gebloed en serum werd geïsoleerd zoals eerder beschreven19. De aanwezigheid van anti-Sap2-antilichamen werd bevestigd met sap2-specifieke ELISA zoals eerder beschreven19.

  1. Voer warmte-inactivatie van het serum (bron van polyklonale antilichamen) uit bij 56 °C gedurende 30 minuten vóór gebruik om de rol van complement in de remmende activiteit uit te sluiten. Inactiveer het serum op warmte voordat u de serumverdunning maakt.
    OPMERKING: Gebruik serum van sham-geïmmuniseerde muizen, preimmune muizen en Sap2-specifiek antilichaam-uitgeput serum als aanvullende controles19. Antilichaam-uitgeput serum werd bereid volgens een eerdere studie19. Onder de seriële verdunningen (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 en 1:12,800) voor serum getest in dit protocol, werd remming van biofilmrijping waargenomen bij 1:25, 1:50 en 1:100; daarom werd 1:50 geselecteerd om een evenwicht te vinden tussen remming en serumconsumptie.
  2. Bereid seriële verdunningen van warmte-geïnactiveerde serummonsters in steriel RPMI 1640 MOPS-medium (1:50). Gebruik een gemeenschappelijke serumverdunning (1:50) voor alle serummonsters die moeten worden getest op remming van biofilmrijping30.
  3. Voeg 100 μL van de geselecteerde serumverdunning toe aan elk putje van de 96-well microtiterplaat. Voeg voor elk monster serumverdunningen in tweevoud toe volgens de bijgevoegde lay-out (figuur 2B).
    1. Voeg in kolom 10 geen serumverdunning toe; voeg alleen RPMI 1640 MOPS-medium toe voor de schimmel-only positieve controle.
      OPMERKING: Kolom 10, rijen G1-G8 en H1-H8 hadden aanvankelijk schimmelcellen in RPMI-MOPS. Hoewel RPMI-MOPS zelfs na 24 uur aan kolom 10 werd toegevoegd, dienden rijen G1-G8 als PBS-controle en rijen H1-H8 als no-serumcontrole na 24 uur.
    2. Voeg in kolom 11 een 1:50 verdunning van serum toe aan alle putten om te dienen als de geen schimmel plus serumnegatieve controle.
    3. Voeg in kolom 12 geen serumverdunning toe aan een put; houd dit als de geen schimmel geen serum negatieve controle.
  4. Bedek de plaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 37 °C.

4. Schatting van de metabole activiteit van biofilm

  1. De volgende dag aspirateer het serum voorzichtig met behulp van een meerkanaals pipet (zonder de biofilms aan te raken of te verstoren). Tik de plaat zachtjes in omgekeerde positie op de vlekkenvellen om eventuele restserum te verwijderen.
  2. Was de plaat met 200 μL 1x PBS (per put) met behulp van een meerkanaals pipet en voeg de PBS toe langs de zijwanden van de put om te voorkomen dat de biofilms worden verstoord. Adem de PBS voorzichtig aan met een meerkanaals pipet en herhaal de PBS-was 2x (in totaal drie wasbeurten). Droog de plaat (zonder deksel) gedurende 30 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur, in een biologische veiligheidskast om overtollige PBS te drogen.
  3. Bereiding van XTT/menadion:
    1. Bereid XTT in steriel Ringers Lactaat als een 0,5 g/L oplossing. Los 25 mg XTT op in 50 ml filter-gesteriliseerd Ringers Lactaat. Aliquot 10 ml in afzonderlijke buizen bedekt met aluminiumfolie en bewaren bij -80 °C.
    2. Bereid menadion als een bouillon van 10 mM. Los 8,6 mg menadion op in 5 ml aceton en verdeel 50 μL in 100 afzonderlijke microbuisjes. Bewaar de aliquots bij -80 °C.
    3. Bereid XTT/menadione-oplossing vlak voor gebruik door 10 ml XTT in te nemen en 1 μL menadion toe te voegen om een werkoplossing van 1 μM te verkrijgen.
  4. Voeg 100 μL XTT/menadionoplossing toe per putje van de 96-well microtiterplaat. Bedek de plaat met een deksel en aluminiumfolie. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 °C in het donker.
  5. Breng 80 μL van het gekleurde supernatant uit elke put over in een verse 96-well plaat. Lees de plaat af bij 490 nm.
  6. Bereken het gemiddelde van de absorptiewaarden van de putten in kolom 10 (alleen schimmelpositieve controle), die als referentiewaarde zal dienen voor de berekening van het percentage biofilmremming door elk serummonster met behulp van vergelijking (1).
    % Biofilm remming = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Candida tropicalis biofilms werden gekweekt in 96-well microtiter platen en in beeld gebracht op 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1A). De biofilm werd verder gekleurd met kristalviolet en waargenomen bij 40x met behulp van een omgekeerde microscoop (figuur 1B). Scanning elektronenmicroscopie toont een representatief beeld van C. tropicalis biofilm (figuur 1C). Voor het uitvoeren van de biofilm remmingstest werden 105 cellen van Candida toegevoegd aan de putten van de 96-well microtiter plaat op tijdstip 0, volgens de lay-out (figuur 2A). Na 24 uur werd de plaat gewassen en werden serummonsters toegevoegd aan de voorgevormde biofilms. Een gemeenschappelijke serumverdunning van 1:50 werd geselecteerd om verschillende serummonsters te vergelijken die zijn verkregen uit verschillende groepen Sap2-geïmmuniseerde en schijn-geïmmuniseerde muizen volgens een pilotstudie en een eerder gepubliceerd rapport30.

Verschillende serummonsters werden toegevoegd aan de 96-well microtiter plaat volgens lay-out (figuur 2B) en beoordeeld in tweevoud. Sera verkregen op dag 30 na immunisatie van drie muizen per groep (Sap2-albicans geïmmuniseerd, Sap2-tropicalis geïmmuniseerd, Sap2-parapsilosis geïmmuniseerd, sham-geïmmuniseerde groep, preimmune muizen en Sap2-uitgeput controlemonster) werden geanalyseerd met een verdunning van 1:50. De plaat werd afgelezen op een golflengte van 490 nm met behulp van een ELISA-lezer voor het verkrijgen van XTT-colorimetrische metingen (OD490-waarden ) voor C. tropicalis-biofilms gevormd in de aan- of afwezigheid van serum (tabel 1). Negatieve blanco werd berekend met behulp van het gemiddelde van de kolommen 11 en 12 (0,04). Positieve controle werd berekend door een gemiddelde van schimmelputten te berekenen (kolom 10; 0,8165). Vóór berekeningen werd de gemiddelde absorptiewaarde van de controleputten in kolom 11 en 12 (0,04) afgetrokken van de absorptiemetingen van de experimentele putten. Zo werd de referentiewaarde van de biofilmpositieve controle (kolom 10) ingesteld op 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

De waarden (gemiddeld minus blanco) verkregen voor de experimentele putten werden vervolgens gedeeld door deze positieve controle (0,7765) en het percentage werd verkregen door te vermenigvuldigen met 100. Het percentage biofilmremming werd berekend door de verkregen waarde verder af te trekken van 100. Een staafdiagram toont alle uitgezette waarden (figuur 3). Gewone eenrichtings-ANOVA gevolgd door Dunnett's post hoc test voor meerdere vergelijkingen werd gebruikt om p-waarden te berekenen voor het beoordelen van statistische verschillen tussen verschillende serumgroepen. Een p-waarde van <0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Serum van Sap2-parapsilosis geïmmuniseerde muizen zou de rijping van voorgevormde C. tropicalis biofilms met 65% kunnen voorkomen, in vergelijking met serum van Sap2-albicans (45%) en Sap2-tropicalis (55%) geïmmuniseerde muizen. Over het algemeen was de biofilmremming door Sap2-immuunserum significant hoger dan die door respectievelijk sham-immuunserum (16%) en pre-immuunserum (13%). Bij het uitputten van Sap2-specifieke antilichamen uit serum zoals elders beschreven19, werd het biofilmremmingsvermogen verminderd tot 10%. Biofilmremming was bijna verwaarloosbaar bij gebruik van PBS (5%) en no-serumcontrole (5%).

Figure 1
Figuur 1: Imaging Candida tropicalis biofilm. (A) Visualisatie van Candida tropicalis biofilm gevormd op de bodem van een 96-well microtiter plaat na verwijdering van RPMI medium, met behulp van een omgekeerde microscoop. Het beeld werd vastgelegd met behulp van brightfield microscopie (er werd geen vlek gebruikt). (B) Visualisatie van C. tropicalis biofilm gevormd op de bodem van een 96-well microtiter plaat na kristal violet kleuring. (C) Visualisatie van C. tropicalis biofilm gevormd op glasdia's met behulp van scanning elektronenmicroscopie. Schaalstaven = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Lay-out van het 96-well plaatformaat. Toevoeging van (A) schimmelcellen aan de putten en (B) serumverdunningen van verschillende muizengroepen (Sap2-albicans geïmmuniseerd, Sap2-tropicalis geïmmuniseerd, Sap2-parapsilosis geïmmuniseerd en sham-geïmmuniseerd; n = 3) beoordeeld in duplicaat bij een verdunning van 1:50. Aanvullende controles omvatten Sap2-uitgeput serum, pre-immuun serum, PBS en no-serumcontrole. In kolom 10 was geen serum toegevoegd (aanwezige schimmelcellen, positieve controle). In kolom 11 waren geen schimmelcellen toegevoegd (serum aanwezig). In kolom 12 waren geen schimmelcellen toegevoegd (serum afwezig). Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; Sap2 = uitgescheiden aspartylproteïnase 2. De termen m1, m2 en m3 verwijzen naar verschillende muizen in elke groep (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Grafiek met de effectiviteit van Sap2-specifieke polyklonale antilichamen tegen voorgevormde C. tropicalis biofilms. De bron van immuunserum wordt weergegeven op de x-as, terwijl het percentage remming van C. tropicalis biofilmrijping wordt weergegeven op de y-as. Balken vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM (n = 3). Gewone eenrichtings-ANOVA gevolgd door Dunnett's post hoc test voor meerdere vergelijkingen werd gebruikt om p-waarden te berekenen. Balken en symbolen vertegenwoordigen de verschillen tussen Sap2-geïmmuniseerde muizengroepen met schijn-geïmmuniseerde muizen. , blz < 0,0001. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; Sap2 = uitgescheiden aspartylproteïnase 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Een 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabel 1: Absorptiemetingen bij 490 nm voor de 96-well microtiter plaat. Een standaardplaatlezer (Tecan) werd gebruikt om de absorptiemetingen te verkrijgen en de metingen werden afgestemd op de lay-out beschreven in figuur 2. Met behulp van deze gegevens werden vervolgens berekeningen uitgevoerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Schimmelinfecties veroorzaakt door Candida-soorten worden geassocieerd met hoge morbiditeits- en sterftecijfers wereldwijd. De groeiende dreiging van invasieve schimmelinfectie vereist het vroege beheer van dergelijke levensbedreigende ziekten. De meeste Candida-infecties omvatten de vorming van biofilms, die zich hechten aan een verscheidenheid aan medische hulpmiddelen en verantwoordelijk zijn voor de persistentie en herhaling van schimmelinfecties in ziekenhuisomgevingen31. Biofilms zijn samengesteld uit gist of hyphale cellen en vertonen aanzienlijke resistentie tegen een meerderheid van conventionele antischimmelmiddelen32. Antischimmelresistentie door Candida-biofilms is toegeschreven aan verschillende mechanismen, waaronder verminderde antischimmelpenetratie, aanwezigheid van extracellulaire matrix, overexpressie van geneesmiddel-effluxpompen, veranderde samenstelling van celmembraansterol, langzame groei en ruimtelijke heterogeniteit, activering van verschillende signaalroutes en de aanwezigheid van geneesmiddeltolerante persistercellen33,34. Remming van Candida-adhesie en biofilmvorming zijn de belangrijkste strategieën om Candida-infectie te voorkomen.

Verschillende in vitro assays, zoals cel levensvatbaarheid assays, microtiter plaat assays, en droge gewicht meting assays, zijn gebruikt om Candida biofilm vorming te bestuderen, die zijn gebaseerd op de specifieke tijdspunt beoordeling van biofilms23. Meer geavanceerde assays zoals microfluïdische apparaatgebaseerde assays zijn ontwikkeld, die kunnen worden gebruikt om real-time biofilmvorming te beoordelen35. Tot nu toe is biofilmvorming bestudeerd met behulp van in vitro assays, maar er is behoefte om het dynamische proces van biofilmvorming onder in vivo omstandigheden te begrijpen, evenals 36,37. Momenteel zijn de meeste biofilmremmingsstudies van toepassing op C. albicans en zijn er weinig studies beschikbaar voor de uitroeiing van niet-albicans Candida-biofilms. Het spectrum van Candida-infecties is de afgelopen decennia geleidelijk veranderd en opkomende niet-albicans Candida-soorten vormen wereldwijd een hoge last van morbiditeit en mortaliteit. Daarom is er een opkomende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe strategieën om biofilmvorming te beheersen en de ontwikkeling van biofilmremmingstests gericht op niet-albicans Candida-soorten. Immunotherapie, met name antilichamen, heeft een groot potentieel om de vorming van biofilms te remmen en kan worden gebruikt om systemische Candida-infectie te behandelen38. Verschillende rapporten hebben de rol van antilichamen in biofilmremming in eerdere stadia van biofilmvorming aangetoond. Er werd gemeld dat polyklonale antilichamen gegenereerd als reactie op complement receptor 3-gerelateerd eiwit (CR3-RP, met een potentiële rol in schimmeltrouw) immunisatie bij konijnen de therapietrouw en biofilmvorming van C. albicans op buccale epitheelcellen verminderde39. Verder werden Candida-stammen, waaronder katheterisolaten, vooraf geïncubeerd met polyklonaal anti-CR3-RP-antilichaam en monoklonaal antilichaam, OKM1, wat de therapietrouw en biofilmvorming verminderde. De levensvatbaarheid van cellen van C. albicans werd geëvalueerd met behulp van de XTT-test tijdens de therapietrouwfase en de biofilmvormingsfase40. Weinig studies hebben de rol van antilichamen tegen niet-albicans Candida-soorten biofilmvorming geëvalueerd. Chupacova et al. evalueerden de effectiviteit van polyklonale anti-CR3-RP antilichamen tegen C. albicans samen met C. dubliniensis met behulp van de XTT-test. Polyklonale anti-CR3-RP-antilichamen remden de therapietrouw en biofilmvorming van zowel C. albicans als C. dubliniensis41.

In deze studie wordt een eenvoudig, snel en gebruiksvriendelijk protocol beschreven voor het beoordelen van het effect van antilichamen op de rijping en ontwikkeling van biofilms. Deze 96-well microtiter plaatgebaseerde XTT-reductietest meet de metabole activiteit van levensvatbare cellen in biofilms en is aangepast van eerdere studies 7,8. De hierin beschreven XTT-test wordt op grote schaal gebruikt om de groei van levensvatbare biofilms te schatten. Het is een veelgebruikte levensvatbaarheidstest voor cellen geworden omdat het snel en handig is en kan worden gebruikt in een formaat met hoge doorvoer, zoals een plaat met 96 putten. Verder kan het worden gebruikt om zowel gist- als hyphale vormen van Candida-biofilms te kwantificeren. Het kan ook worden gebruikt voor het meten van Candida-biofilms op verschillende substraten, zoals medische hulpmiddelen (bijv. Katheters) en contactlenzen.

Enkele van de kritieke stappen van dit protocol omvatten het krachtig vortexen van de celsuspensies voordat ze in alle stappen pipetteren, om schimmelaggregatie te voorkomen7. Slechte biofilms zullen zich waarschijnlijk ontwikkelen wanneer de celdichtheden te hoog of te laag zijn. Daarom moeten gebruikers de ideale schimmelceldichtheid volgen in het initiële entmateriaal7. De wasstappen zijn zeer kritisch en overmatig celwassen moet worden vermeden om te voorkomen dat de biofilm wordt verstoord22. De onderste laag van de biofilm mag niet worden verstoord tijdens het wasproces. De test moet altijd worden uitgevoerd in donkere omstandigheden en het is noodzakelijk om meerdere replicaties op te nemen22. Een verse oplossing van XTT moet elke keer vlak voor gebruik worden bereid. Omdat het tijdsverschil tussen twee reacties de resultaten kan vertekenen, moeten gebruikers snel werken om een minimaal tijdsverschil te garanderen bij het toevoegen van de XTT-oplossing aan de eerste en laatste put van de 96-well plaat42. Het gebruik van folie of parafilm wordt aanbevolen om verdamping te voorkomen. Indien nodig kunnen verschillende stappen voor probleemoplossing worden uitgevoerd. Indien de biofilmgroei afwezig of onbevredigend is, moeten passende entverdunning en -berekeningen voor zaaien worden gebruikt. Voor een betere vorming van biofilms kunnen subculturatieomstandigheden worden gewijzigd en kan biofilmgroei worden geprobeerd met behulp van verschillende oppervlaktematerialen. Om de gevoeligheid van de XTT-test aanzienlijk te verbeteren, kan men de tijd die nodig is voor de vorming van biofilm verkorten, de concentratie van het antischimmelmiddel verhogen of de incubatietijd van de test verkorten7. Om te voorkomen dat de biofilm wordt verstoord, moet overmatig celwassen worden vermeden22. Men kan ofwel de buitenste putten vermijden om te voorkomen dat de testmiddelen worden blootgesteld aan licht of vloeistof toevoegen aan de buitenste putten om te voorkomen dat de middelen uit de binnenste putten verdampen. Zachte wasbeurten moeten worden gegeven als de biofilm tijdens het wassen wordt verstoord22. Terwijl dit protocol het effect van serum op 24 uur voorgevormde biofilms test voor het beoordelen van de remming van biofilmrijping, kunnen gebruikers dit protocol ook wijzigen om serum toe te voegen op tijdstip 0 voor het beoordelen van remming van biofilmvorming, volgens een eerder rapport30.

Vergeleken met andere alternatieve methoden voor het kwantificeren van biofilmgroei, is de XTT-methode de meest gevoelige, reproduceerbare, nauwkeurige, kosteneffectieve en specifieke methode. Hoewel de XTT-test een veelgebruikte snelle en eenvoudige techniek is voor het evalueren van biofilms, heeft deze bepaalde beperkingen. Hoewel het nuttig is voor het bepalen van de dosering of effecten van verschillende middelen in een biofilm van een enkele soort, moet het met voorzichtigheid worden gebruikt om meerdere isolaten tegelijkertijd te vergelijken vanwege metabole variabiliteit tussen isolaten21. Voor interstrain biofilmvergelijkingen moet gedetailleerde techniekstandaardisatie worden uitgevoerd21. Bovendien, terwijl het XTT-formazan-product gemakkelijk oplost in oplossing, kunnen sommige stammen een bepaalde hoeveelheid in de cel behouden21. Aangezien er onduidelijkheid bestaat over variabelen, zoals de keuze van de media, het tijdstip van de ontwikkeling van de biofilm en de specifieke kenmerken van het serum, is het raadzaam om naast de XTT-test bevestigende bioassays uit te voeren, bijvoorbeeld de meting van de dikte/biomassa van biofilm (met behulp van kristalviolet) of de levensvatbaarheid van cellen (met behulp van de CFU-methode)43. Van belang is dat de resultaten van deze XTT-test goed correleerden met de kristalviolettest en de CFU-methode (gegevens niet getoond). Ondanks de hierboven genoemde beperkingen kan deze methode worden geëxtrapoleerd om verschillende groepen serummonsters (bron van polyklonale antilichamen), monoklonale antilichamen of aanvullende immunotherapieën te evalueren. Hoewel het hier gepresenteerde XTT-reductieprotocol alleen het effect van antilichamen op C. tropicalis-biofilms laat zien, is het door onderzoekers gebruikt om het effect van antilichamen op C. auris-biofilms en18 te bestuderen. Bovendien is dit protocol afgeleid van eerdere studies uitgevoerd met andere Candida-soorten zoals C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis en C. auris, die de uitbreiding van dit protocol naar het geslacht Candida 16,41,44,45,46,47 kunnen verdienen.

Optimalisatie, standaardisatie en regelmatige verbetering van biofilmkwantificeringstests kunnen de nauwkeurigheid, doorvoer en reproduceerbaarheid verbeteren. De XTT-reductietest waarop dit protocol is gebaseerd, is op grote schaal gebruikt voor de beoordeling van metabole activiteit en levensvatbaarheid van biofilms. Aangezien Candida-biofilm vaak resistent is tegen antischimmelmedicijnen, is de verkenning van nieuwe geneesmiddelen en nieuwe combinaties een dringende noodzaak33. Om het probleem van biofilm-geassocieerde infecties te bestrijden, moeten meer antibiofilmverbindingen worden onderzocht met behulp van biofilmscreeningtests48. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren. Toekomstig onderzoek op basis van standaardisatie en verbetering van XTT-reductietest met op antilichamen gebaseerde immunotherapieën kan helpen bij de ontwikkeling van verbeterde therapieën voor effectief ziektebeheer en -controle.

Biofilmremming door Sap2-specifieke antilichamen is gemeld als een antilichaamgemedieerd beschermingsmechanisme in sap2-vaccin gemedieerde bescherming tijdens muizen systemische candidiasis veroorzaakt door C. tropicalis19. Een eerdere studie toonde ook aan dat CAGTA potentieel sapantigenen herkent, de groei en biofilmvorming van C. albicans in vitro vermindert16. In een andere studie vertoonden Sap2-verwijderde mutanten een biofilmgroeidefect in de aanwezigheid van pepstatine A49. Bovendien speelde het Sap2-antigeen tijdens de vorming van biofilms een rol bij de proteolytische verwerking van het mucine Msb2 gemedieerd via Cek1 mitogeen-geactiveerde eiwitkinase-signaleringsroute50. Daarom kan worden gespeculeerd dat msb2-verwerking wordt geremd door antilichaamgemedieerde Sap2-neutralisatie, die de integriteit van de biofilm beïnvloedt. Samenvattend biedt dit artikel een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de rol van serumantistoffen in C. tropicalis biofilm rijping en ontwikkeling, die kan worden toegepast voor de bepaling van biofilm metabole activiteit in verschillende omgevingen, met behulp van verschillende schimmelstammen of antilichaambronnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Ramalingaswami-subsidie DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) en Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) aan S.R. De auteurs erkennen een ICMR-JRF-subsidie aan P.C. en DBT-JRF-subsidie aan P.S. De auteurs bedanken Dr. Ravikant Ranjan voor suggesties over het manuscript en technische assistentie door de heer Pradeep Singh Thakur tijdens SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

Immunologie en infectie nummer 187
Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op <em>Candida tropicalis</em> biofilms te evalueren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter