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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Abstract

As espécies de Candida são a quarta causa mais comum de infecções nosocomiais sistêmicas. A candidíase sistêmica ou invasiva frequentemente envolve a formação de biofilme em dispositivos implantados ou cateteres, o que está associado ao aumento da virulência e mortalidade. Biofilmes produzidos por diferentes espécies de Candida exibem maior resistência contra várias drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de desenvolver imunoterapias eficazes ou tratamentos adjuvantes contra biofilmes de Candida. Embora o papel da imunidade celular esteja bem estabelecido na proteção anti-Candida, o papel da imunidade humoral tem sido estudado menos.

Foi levantada a hipótese de que a inibição da formação e maturação de biofilme é uma das principais funções dos anticorpos protetores, e os anticorpos do tubo germinativo de Candida albicans (CAGTA) demonstraram suprimir o crescimento in vitro e a formação de biofilme de C. albicans mais cedo. Este artigo descreve um protocolo detalhado para avaliar o papel de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. A metodologia para este protocolo envolve a formação de biofilme de C. tropicalis em placas de microtitulação de 96 poços, que foram então incubadas na presença ou ausência de anticorpos antígeno-específicos, seguidas por um ensaio de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilide-2H-tetrazólio (XTT) para medir a atividade metabólica de células fúngicas no biofilme.

A especificidade foi confirmada pelo uso de controles séricos apropriados, incluindo soro depletado de anticorpos específicos de Sap2. Os resultados demonstram que os anticorpos presentes no soro de animais imunizados podem inibir a maturação in vitro do biofilme de Candida. Em resumo, este artigo fornece informações importantes sobre o potencial dos anticorpos no desenvolvimento de novas imunoterapias e tratamentos sinérgicos ou adjuvantes contra biofilmes durante a candidíase invasiva. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.

Introduction

A candidíase sistêmica é a quarta principal causa de infecções nosocomiais, que estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Globalmente, a candidíase sistêmica afeta aproximadamente 700.000 indivíduos1. Espécies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, são a causa mais comum de infecções invasivas por Candida 2. As espécies de Candida são patógenos oportunistas que produzem biofilmes3. Os biofilmes estão predominantemente associados à virulência de Candida, e a Candida pode suportar condições de estresse oxidativo e osmótico induzindo a formação de biofilme4. Os biofilmes modulam ainda mais a expressão de fatores de virulência e componentes da parede celular e formam uma matriz protetora exopolimérica, ajudando a Candida a se adaptar a diferentes nichos de hospedeiros4. Os biofilmes contribuem para a aderência da levedura nos tecidos do hospedeiro e instrumentos médicos5. Como tal, a formação de biofilme está associada a uma vantagem para as leveduras, uma vez que as células de levedura dentro dos biofilmes podem evadir a resposta imune do hospedeiro6. A formação de biofilme também protege as leveduras patogênicas da ação de drogas antifúngicas5. A diminuição da suscetibilidade dos biofilmes de C. albicans à anfotericina B foi demonstrada por Pierce et al.7,8. Além disso, os biofilmes demonstram resistência a medicamentos antifúngicos ao fluconazol, o que prejudica o manejo efetivo da candidíase sistêmica 9,10.

Os micróbios têm uma tendência intrínseca a aderir a várias superfícies bióticas e abióticas, o que resulta na formação de biofilme. Candida albicans, que é um fungo dimórfico, existe nas formas levedura e hifal, e sua formação de biofilme tem sido caracterizada em vários sistemas modelo in vitro e in vivo 11. As etapas da formação do biofilme incluem a adesão das células de Candida ao substrato, a filamentação, a proliferação e a maturação do biofilme11. Inicialmente, a forma de levedura de C. albicans adere a substratos, incluindo dispositivos médicos e tecido humano, seguida de filamentação e proliferação de C. albicans em formas hifais e pseudo-hifais e, finalmente, maturação de biofilmes embutidos na matriz extracelular11. A formação de biofilme contribui em grande parte para os mecanismos de patogênese de C. albicans 12. As espécies de Candida formam biofilmes resistentes a medicamentos, o que torna sua erradicação desafiadora13. Um pequeno subconjunto da população produtora de biofilme de C. albicans tem sido descrito como altamente resistente aos antifúngicos anfotericina B e clorexidina14. Vale ressaltar que as células de levedura em biofilmes apresentam alta resistência à poliquimioterapia em comparação com as células de levedura na fase planctônica e na fase de proliferação14. Tem sido sugerido que as células de levedura existentes em biofilmes são altamente tolerantes a drogas antifúngicas, o que contribui para a sobrevivência de C. albicans em biofilmes14. Essas células existentes foram relatadas como variantes fenotípicas de C. albicans e não mutantes14. Além disso, células de biofilmes de Candida conhecidas como "células persistentes" são tolerantes a altas doses de tratamento com anfotericina B e contribuem para a sobrevivência de Candida, representando assim uma grande carga de infecções sistêmicas recorrentes por Candida em indivíduos de alto risco15.

O aumento da resistência a medicamentos antifúngicos em cepas de Candida requer pesquisa para novos agentes antifúngicos e imunoterapias. Como evidenciado a partir dos estudos acima mencionados, os biofilmes de Candida mostram diminuição da suscetibilidade a drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de imunoterapias melhoradas para controlar a formação de biofilme de Candida. Estudos anteriores mostraram que a CAGTA pode fornecer proteção eficaz contra infecções sistêmicas por Candida, inibindo a formação de biofilme de C. albicans in vitro16. Outro estudo relatou que a imunização de camundongos com a proteína rAls3-N de C. albicans induz altos títulos de anticorpos que interferem na formação de biofilme de C. albicans in vitro 17. Os anticorpos anti-Als3-N também exerceram efeito inibitório sobre a dispersão de C. albicans a partir de biofilmes17. A vacina NDV-3A à base de C. albicans está atualmente em fase de ensaio clínico e os soros anti-NDV-3A também reduziram a formação de biofilme de C. auris 18. Um estudo recente identificou a inibição da formação de biofilme por anticorpos Sap2 como mecanismo de proteção em um modelo murino de candidíase sistêmica19.

Este trabalho descreve um protocolo in vitro detalhado para avaliar o efeito de anticorpos antígeno-específicos presentes no soro policlonal obtidos de diferentes grupos de camundongos vacinados com Sap2 em biofilmes pré-formados de Candida tropicalis . Para isso, um método baseado em um ensaio de redução de XTT foi otimizado e desenvolvido em laboratório, que pode medir a viabilidade do biofilme de forma rápida, sensível e de alto rendimento, na presença ou ausência de anticorpos.

O ensaio XTT é utilizado para medir a atividade metabólica celular como indicador de viabilidade celular, proliferação celular e citotoxicidade20. Este ensaio colorimétrico baseia-se na redução de um sal de tetrazólio amarelo, sódio 3'-[1-(fenilaminocarbonil)-3,4-tetrazólio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benzeno sulfônico hidratado (XTT) para um corante formazan laranja por células metabolicamente ativas. Como apenas células viáveis podem reduzir o XTT, a quantidade de XTT formazan reduzido é proporcional à intensidade da cor e à viabilidade celular. O corante formazan formado é solúvel em água e é diretamente quantificado usando um leitor de placas. Devido à sua natureza solúvel em água, o ensaio XTT permite o estudo de biofilmes intactos, bem como o exame da suscetibilidade a fármacos bioplápticos, sem interrupção da estrutura do biofilme21. Além disso, esse método é implementado nas avaliações de viabilidade fúngica de Candida devido à sua facilidade de uso, velocidade, precisão, alto rendimento e alto grau de reprodutibilidade 7,22.

Além do ensaio de redução de XTT, inúmeras técnicas alternativas também foram identificadas para a medição da quantidade de biofilme. Alguns deles incluem o uso do ensaio de redução de MTT, coloração violeta cristalina, quantificação de DNA, PCR quantitativa, quantificação de proteínas, medição do peso das células secas e contagem viável de colônias. Esses procedimentos variam muito em termos de seus requisitos de tempo e custo. Taff et al. realizaram uma análise comparativa de sete diferentes ensaios de quantificação de biofilme de Candida e descobriram que o ensaio de XTT forneceu o método mais reprodutível, preciso e eficiente para a estimativa quantitativa de biofilmes de C. albicans 23. Técnicas de coloração como o violeta cristal têm certas limitações; o teste de violeta cristal determina indiretamente a quantidade de biofilme medindo a densidade óptica da matriz e das células de biofilme coradas com violeta cristal. Embora o ensaio de violeta cristal forneça uma boa medida de massa de biofilme, ele não fornece uma medida de viabilidade do biofilme, pois cora tanto as células microbianas quanto a matriz extracelular24. Dhale et al. relataram ainda que o ensaio de redução de XTT foi o método mais sensível, reprodutível, preciso, eficiente e específico para detectar a produção de biofilme em comparação com o ensaio violeta cristal25. Relatos da literatura têm mostrado que o ensaio de XTT se correlaciona bem com o parâmetro UFC/mL no método de contagem de UFC. No entanto, em comparação com o ensaio XTT, o método CFU é trabalhoso e lento26. Além disso, a fração de células vivas destacadas pode não ser representativa da população inicial de biofilme27. Embora o ensaio de redução de XTT pareça a melhor opção disponível para quantificar a viabilidade, existem algumas limitações dessa técnica. Embora o método XTT seja útil para comparações envolvendo uma cepa fúngica, seu uso pode ser limitado ao comparar diferentes cepas e espécies de fungos. Comparações entre cepas podem ser difíceis na ausência de padronização detalhada, uma vez que diferentes cepas metabolizam substratos com diferentes capacidades21.

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Protocol

Camundongos BALB/c foram alojados no Small Animal Facility no IIT Roorkee. Todos os animais foram mantidos em um ciclo claro:escuro de 12 h:12 h a 25 °C e receberam dieta de pellets e água ad libitum. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC) do IIT Roorkee.

1. Preparação de C. tropicalis

NOTA: O fungo Candida tropicalis pertence aos patógenos do Grupo de Risco 2 e é classificado como um microrganismo BSL2. Sempre use armários de segurança biológica de classe II certificados ao trabalhar com espécies de Candida . Praticar técnicas assépticas e estéreis durante o trabalho com C. tropicalis e seguir os procedimentos de biossegurança recomendados para o descarte adequado deste patógeno.

  1. Streak C. tropicalis (cepa ATCC 750) em uma placa de ágar Sabouraud dextrose (SAB).
  2. Preparar uma cultura cultivada durante a noite de C. tropicalis inoculando uma única colônia da placa de ágar SAB em um tubo cônico estéril de 50 mL contendo 10 mL de caldo de shab. Alternativamente, use um estoque de glicerol congelado de C. tropicalis e inocular 100 μL do estoque de glicerol em um frasco cônico estéril de 250 mL contendo 50 mL de caldo de meio de caldo.
  3. Incubar cultura de C. tropicalis em agitador orbital a 180 rpm a 30 °C por 24-48 h.
  4. Centrifugar a cultura fúngica (células em fase logarítmica) a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C.
  5. Descarte o sobrenadante e adicione 50 mL de PBS 1x estéril ao pellet. Lave e ressuscite o pellet em PBS estéril 1x com vórtice suave.
  6. Centrifugar novamente a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet fúngico em 10 mL de PBS 1x estéril.
  7. Calcule a concentração de células contando com um hemocitômetro.
  8. Preparar estoques de fungos em uma densidade final de 1,0 × 106 células/mL em meio de ácido morfolinepropanosulfônico (MOPS) RPMI 1640. Use a suspensão celular da etapa 1.6 imediatamente.
    NOTA: Para configurar uma placa de 96 poços, o volume total de estoque fúngico necessário é de 10 mL (100 μL/poço). Dimensione conforme necessário.

2. Formação do biofilme de C. tropicalis

  1. Preparar biofilmes de Candida em uma placa de microtitulação de poliestireno de fundo plano de 96 poços, conforme descrito anteriormente (Figura 1)28,29.
  2. Adicionar 100 μL de cultura de C. tropicalis (de 10 a6 células/mL de estoque, preparada como acima) a uma placa de microtitulação de 96 poços usando uma pipeta multicanal (Figura 2A). Mantenha as duas últimas colunas (11 e 12) como controles negativos "sem fungo mais soro" e "sem fungo e sem soro", não adicionando células fúngicas. Encha as colunas 11 e 12 com 100 μL de RPMI 1640 MOPS apenas em média.
  3. Cubra a placa de microtitulação com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C em condições estacionárias.
  4. No dia seguinte, aspirar o meio cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou interromper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de blotting para remover qualquer meio residual.
  5. Lave a placa com 200 μL de 1x PBS (por poço) usando uma pipeta multicanal. Adicione PBS muito suavemente ao longo das paredes laterais do poço para evitar interromper os biofilmes. Aspirar o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal. Repita a lavagem PBS 2x (um total de três lavagens).
  6. Para remover o excesso de PBS, seque a placa ao ar (sem a tampa) por 30 minutos à temperatura ambiente, dentro de um armário de segurança biológica.

3. Tratamento do biofilme com anticorpos

NOTA: Os biofilmes podem agora ser processados para avaliar a inibição da maturação do biofilme por anticorpos. O soro murino foi utilizado como fonte de anticorpos policlonais. Diferentes grupos de camundongos imunizados com Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis e Sap2-parapsilosis), juntamente com camundongos imunizados simuladamente, foram sangrados retro-orbitalmente e o soro foi isolado conforme descrito anteriormente19. A presença de anticorpos anti-Sap2 foi confirmada usando ELISA específico para Sap2, conforme descrito anteriormente19.

  1. Realizar inativação térmica do soro (fonte de anticorpos policlonais) a 56 °C durante 30 min antes de utilizar para descartar o papel do complemento na atividade inibitória. Inative o soro pelo calor antes de fazer a diluição do soro.
    NOTA: Use soro de camundongos imunizados simuladamente, camundongos pré-imunes e soro depletado de anticorpos específicos do Sap2 como controles adicionais19. O soro depletado de anticorpos foi preparado de acordo com um estudo anterior19. Dentre as diluições seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 e 1:12.800) para soro testado neste protocolo, observou-se inibição da maturação do biofilme em 1:25, 1:50 e 1:100; assim, 1:50 foi selecionado para encontrar um equilíbrio entre inibição e consumo de soro.
  2. Preparar diluições em série de amostras de soro inativadas pelo calor em meio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilizar uma diluição sérica comum (1:50) para todas as amostras de soro a serem testadas quanto à inibição da maturação do biofilme30.
  3. Adicionar 100 μL da diluição sérica seleccionada a cada alvéolo da placa de microtitulação de 96 alvéolos. Para cada amostra, adicionar diluições séricas em duplicata, de acordo com o esquema em anexo (Figura 2B).
    1. Na coluna 10, não adicione diluição sérica; adicionar apenas o meio RPMI 1640 MOPS para o controle positivo somente de fungos .
      NOTA: Coluna 10, linhas G1-G8 e H1-H8 inicialmente tinham células fúngicas em RPMI-MOPS. No entanto, enquanto o RPMI-MOPS foi adicionado à coluna 10 mesmo após 24 h, as linhas G1-G8 serviram como controle PBS e as linhas H1-H8 como controle sem soro após 24 h.
    2. Na coluna 11, adicionar uma diluição de soro de 1:50 a todos os poços para servir como o não fungo mais o controle sérico negativo.
    3. Na coluna 12, não adicione diluição sérica a nenhum alvéolo; manter isso como o não fungo sem controle negativo sérico.
  4. Cubra a placa com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 24 h a 37 °C.

4. Estimativa da atividade metabólica do biofilme

  1. No dia seguinte, aspirar o soro cuidadosamente usando uma pipeta multicanal (sem tocar ou interromper os biofilmes). Bata suavemente na placa em uma posição invertida em folhas de blotting para remover qualquer soro residual.
  2. Lave a placa com 200 μL de 1x PBS (por poço) usando uma pipeta multicanal, adicionando o PBS ao longo das paredes laterais do poço para evitar interromper os biofilmes. Aspirar o PBS cuidadosamente usando uma pipeta multicanal e repetir a lavagem PBS 2x (um total de três lavagens). Seque a placa ao ar (sem tampa) por 30 minutos à temperatura ambiente, dentro de um armário de segurança biológica para secar qualquer excesso de PBS.
  3. Preparação de XTT/menadiona:
    1. Preparar XTT em Ringers Lactate estéril como uma solução de 0,5 g/L. Dissolva 25 mg de XTT em 50 mL de Ringers Lactato esterilizado por filtro. Aliquot 10 mL em tubos separados cobertos com folha de alumínio e armazenar a -80 °C.
    2. Prepare a menadiona como um estoque de 10 mM. Dissolver 8,6 mg de menadiona em 5 mL de acetona e distribuir 50 μL em 100 microtubos separados. Conservar as alíquotas a -80 °C.
    3. Prepare a solução de XTT/menadiona imediatamente antes da utilização, tomando 10 ml de XTT e adicionando 1 μL de menadiona para obter uma solução de trabalho de 1 μM.
  4. Adicionar 100 μL da solução de XTT/menadiona por alvéolo da placa de microtitulação de 96 poços. Cubra a placa com uma tampa e papel alumínio. Incubar a placa durante 2 h a 37 °C no escuro.
  5. Transfira 80 μL do sobrenadante colorido de cada poço para uma placa fresca de 96 poços. Leia a placa a 490 nm.
  6. Calcular a média dos valores de absorbância dos poços na coluna 10 (controle positivo somente de fungos), que servirá como valor de referência para o cálculo da porcentagem de inibição do biofilme por cada amostra de soro usando a equação (1).
    % de inibição do biofilme = 100 - Equation 1× 100 (1)

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Representative Results

Os biofilmes de Candida tropicalis foram cultivados em placas de microtitulação de 96 poços e fotografados a 40x utilizando microscópio invertido (Figura 1A). O biofilme foi ainda corado com cristal violeta e observado a 40x com microscópio invertido (Figura 1B). A microscopia eletrônica de varredura mostra uma imagem representativa do biofilme de C. tropicalis (Figura 1C). Para a realização do ensaio de inibição do biofilme, 10a 5 células de Candida foram adicionadas aos poços da placa de microtitulação de 96 poços no momento 0, conforme o layout (Figura 2A). Após 24 h, a placa foi lavada e amostras de soro foram adicionadas aos biofilmes pré-formados. Uma diluição sérica comum de 1:50 foi selecionada para comparar diferentes amostras de soro obtidas de diferentes grupos de camundongos imunizados com Sap2 e imunizados simulados, de acordo com um estudo piloto e um relatório publicado anteriormente30.

Diferentes amostras de soro foram adicionadas à placa de microtitulação de 96 poços conforme layout (Figura 2B) e avaliadas em duplicata. Os soros obtidos no 30º dia pós-imunização de três camundongos por grupo (Sap2-albicans imunizados, Sap2-tropicalis imunizados, Sap2-parapsilosis imunizada, grupo simulado, camundongos pré-imunes e amostra controle empobrecida de Sap2) foram analisados em uma diluição de 1:50. A placa foi lida a 490 nm de comprimento de onda utilizando um leitor ELISA para obtenção de leituras colorimétricas de XTT (valores de OD490 ) para biofilmes de C. tropicalis formados na presença ou ausência de soro (Tabela 1). O branco negativo foi calculado utilizando-se a média das colunas 11 e 12 (0,04). O controle positivo foi calculado calculando-se uma média de poços somente para fungos (coluna 10; 0,8165). Antes dos cálculos, o valor médio de absorbância dos poços controle nas colunas 11 e 12 (0,04) foi subtraído das medidas de absorbância dos poços experimentais. Assim, o valor de referência do controle positivo do biofilme (coluna 10) foi ajustado para 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

Os valores (média menos branco) obtidos para os poços experimentais foram então divididos por esse controle positivo (0,7765) e a porcentagem foi obtida multiplicando-se por 100. A porcentagem de inibição do biofilme foi calculada subtraindo-se ainda mais o valor obtido de 100. Um gráfico de barras mostra todos os valores plotados (Figura 3). A ANOVA one-way ordinária seguida do teste post hoc de Dunnett para comparações múltiplas foi utilizada para calcular os valores de p para avaliar as diferenças estatísticas entre os diferentes grupos séricos. Um valor de p de <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. O soro de camundongos imunizados com Sap2-parapsilose poderia prevenir a maturação de biofilmes pré-formados de C. tropicalis em 65%, em comparação com o soro de camundongos imunizados com Sap2-albicans (45%) e Sap2-tropicalis (55%). Em geral, a inibição do biofilme pelo soro imune ao Sap2 foi significativamente maior do que a do soro imune simulado (16%) e pelo soro pré-imune (13%), respectivamente. Ao esgotar os anticorpos específicos de Sap2 do soro, conforme descrito em outro lugar19, a capacidade de inibição do biofilme foi reduzida para 10%. A inibição do biofilme foi quase insignificante no uso de PBS (5%) e controle sem soro (5%).

Figure 1
Figura 1: Imagem do biofilme de Candida tropicalis . (A) Visualização do biofilme de Candida tropicalis formado no fundo de uma placa de microtitulação de 96 poços após remoção do meio RPMI, utilizando microscópio invertido. A imagem foi capturada por microscopia de campo brilhante (nenhuma mancha foi usada). (B) Visualização do biofilme de C. tropicalis formado no fundo de uma placa de microtitulação de 96 poços após coloração violeta cristalina. (C) Visualização do biofilme de C. tropicalis formado em lâminas de vidro utilizando microscopia eletrônica de varredura. Barras de escala = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Layout do formato de placa de 96 poços. Adição de (A) células fúngicas aos poços e (B) diluições séricas de diferentes grupos de camundongos (Sap2-albicans imunizados, Sap2-tropicalis imunizados, Sap2-parapsilose imunizada e sham-immunized; n = 3) avaliadas em duplicata em uma diluição de 1:50. Controles adicionais incluíram soro depletado de Sap2, soro pré-imune, PBS e controle sem soro. A coluna 10 não teve soro adicionado (células fúngicas presentes, controle positivo). A coluna 11 não teve células fúngicas adicionadas (soro presente). A coluna 12 não teve células fúngicas adicionadas (soro ausente). Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; Sap2 = aspartyl proteinase 2 secretada. Os termos m1, m2 e m3 referem-se a diferentes camundongos em cada grupo (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Gráfico mostrando a eficácia de anticorpos policlonais específicos de Sap2 contra biofilmes pré-formados de C. tropicalis. A fonte de soro imunológico é mostrada no eixo x, enquanto a porcentagem de inibição da maturação do biofilme de C. tropicalis é mostrada no eixo y. As barras representam a média ± MEV (n = 3). A ANOVA one-way ordinária seguida do teste post hoc de Dunnett para comparações múltiplas foi utilizada para calcular os valores de p. Barras e símbolos representam as diferenças entre os grupos de camundongos imunizados com Sap2 com camundongos imunizados simuladamente. , p < 0,0001. Abreviaturas: PBS = solução salina tamponada com fosfato; Sap2 = aspartyl proteinase 2 secretada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Um 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabela 1: Leituras de absorbância a 490 nm para a placa de microtitulação de 96 poços. Um leitor de placas padrão (Tecan) foi utilizado para obter as leituras de absorbância e as leituras foram pareadas com o layout descrito na Figura 2. Cálculos subsequentes foram realizados utilizando esses dados.

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Discussion

As infecções fúngicas causadas por espécies de Candida estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A crescente ameaça de infecção fúngica invasiva requer o manejo precoce de tais doenças com risco de vida. A maioria das infecções por Candida envolve a formação de biofilmes, que aderem a uma variedade de dispositivos médicos e são responsáveis pela persistência e recorrência de infecções fúngicas em ambientes hospitalares31. Os biofilmes são compostos por células de levedura ou hifa, e apresentam considerável resistência à maioria dos antifúngicos convencionais32. A resistência antifúngica pelos biofilmes de Candida tem sido atribuída a vários mecanismos, incluindo diminuição da penetração antifúngica, presença de matriz extracelular, superexpressão de bombas de efluxo de drogas, composição alterada de esteróis da membrana celular, crescimento lento e heterogeneidade espacial, ativação de várias vias de sinalização e presença de células persistentes tolerantes a drogas33,34. A inibição da adesão de Candida e a formação de biofilme são as estratégias mais importantes para prevenir a infecção por Candida.

Vários ensaios in vitro, como ensaios de viabilidade celular, ensaios de placa de microtitulação e ensaios de medição de peso seco, têm sido utilizados para estudar a formação de biofilme de Candida, que são baseados na avaliação de ponto de tempo específico de biofilmes23. Ensaios mais avançados, como ensaios baseados em dispositivos microfluídicos, têm sido desenvolvidos, que podem ser utilizados para avaliar a formação de biofilme em tempo real35. Até o momento, a formação de biofilme tem sido estudada por meio de ensaios in vitro, mas há necessidade de compreender o processo dinâmico de formação de biofilme em condições in vivo também 36,37. Atualmente, a maioria dos estudos de inibição de biofilme se aplica a C. albicans e poucos estudos estão disponíveis para a erradicação de biofilmes de Candida não-albicanos. O espectro de infecções por Candida mudou gradualmente nas últimas décadas e as espécies emergentes de Candida não-albicans representam uma alta carga de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Portanto, há uma necessidade emergente para o desenvolvimento de novas estratégias para controlar a formação de biofilme e o desenvolvimento de ensaios de inibição de biofilme com foco em espécies de Candida não-albicans. A imunoterapia, particularmente os anticorpos, tem um grande potencial para inibir a formação de biofilme e pode ser usada para tratar a infecção sistêmica por Candida 38. Vários relatórios demonstraram o papel dos anticorpos na inibição do biofilme em estágios iniciais da formação do biofilme. Foi relatado que anticorpos policlonais gerados em resposta à imunização da proteína relacionada ao receptor 3 do complemento (CR3-RP, tendo um papel potencial na adesão fúngica) em coelhos reduziram a aderência e a formação de biofilme de C. albicans em células epiteliais bucais39. Além disso, cepas de Candida, incluindo isolados de cateter, foram pré-incubadas com anticorpo policlonal anti-CR3-RP e anticorpo monoclonal, OKM1, o que reduziu a aderência e a formação de biofilme. A viabilidade celular de C. albicans foi avaliada utilizando-se o ensaio XTT durante a fase de aderência e a fase de formação de biofilme40. Poucos estudos avaliaram o papel de anticorpos contra a formação de biofilme de espécies de Candida não-albicans. Chupacova e col. avaliaram a eficácia de anticorpos policlonais anti-CR3-RP contra C. albicans juntamente com C. dubliniensis usando o ensaio XTT. Os anticorpos policlonais anti-CR3-RP inibiram a adesão e a formação de biofilme de C. albicans e C. dubliniensis41.

Neste estudo, um protocolo simples, rápido e de fácil utilização é descrito para avaliar o efeito dos anticorpos na maturação e desenvolvimento do biofilme. Este ensaio de redução de XTT baseado em placa de microtitulação de 96 poços mede a atividade metabólica de células viáveis em biofilmes e foi adaptado de estudos anteriores 7,8. O ensaio XTT aqui descrito é amplamente utilizado para estimar o crescimento viável do biofilme. Tornou-se um teste de viabilidade celular comumente usado porque é rápido, conveniente e pode ser usado em formato de alto rendimento, como uma placa de 96 poços. Além disso, pode ser usado para quantificar as formas de levedura e hifa de biofilmes de Candida. Também pode ser usado para a medição de biofilmes de Candida em uma variedade de substratos, como dispositivos médicos (por exemplo, cateteres) e lentes de contato.

Algumas das etapas críticas deste protocolo incluem o vórtice vigoroso das suspensões celulares antes da pipetagem em todas as etapas, para evitar a agregação fúngica7. Biofilmes pobres provavelmente se desenvolverão quando as densidades celulares são muito altas ou muito baixas. Portanto, os usuários devem seguir a densidade ideal de células fúngicas no inóculo inicial7. As etapas de lavagem são muito críticas e a lavagem excessiva das células deve ser evitada para evitar a interrupção do biofilme22. A camada inferior do biofilme não deve ser perturbada durante o processo de lavagem. O ensaio deve ser sempre realizado em condições escuras, sendo necessário incluir múltiplas replicações22. Uma nova solução de XTT deve ser preparada todas as vezes imediatamente antes do uso. Como a diferença de tempo entre duas reações pode distorcer os resultados, os usuários devem trabalhar rapidamente para garantir uma diferença de tempo mínima ao adicionar a solução XTT ao primeiro e último poço da placa de 96 poços42. O uso de folha ou parafilme é recomendado para evitar a evaporação. Várias etapas de solução de problemas podem ser executadas, se necessário. Caso o crescimento do biofilme esteja ausente ou seja insatisfatório, devem ser utilizados cálculos e diluição de inóculo de semeadura adequados. Para uma melhor formação de biofilme, as condições de subcultura podem ser alteradas e o crescimento do biofilme pode ser tentado usando diferentes materiais de superfície. Para melhorar significativamente a sensibilidade do ensaio de XTT, pode-se diminuir o tempo necessário para a formação do biofilme, aumentar a concentração do agente antifúngico ou encurtar o período de incubação do ensaio7. Para evitar a interrupção do biofilme, deve-se evitar a lavagem celular excessiva22. Pode-se evitar os poços externos para evitar que os agentes de ensaio sejam expostos à luz ou adicionar líquido aos poços externos para evitar que os agentes evaporem dos poços internos. Devem ser efectuadas lavagens suaves se o biofilme estiver a ser interrompido durante a lavagem22. Enquanto este protocolo testa o efeito do soro em biofilmes pré-formados de 24 h para avaliar a inibição da maturação do biofilme, os usuários também podem modificar este protocolo para adicionar soro no tempo 0 para avaliar a inibição da formação de biofilme, de acordo com um relatório anterior30.

Em comparação com outros métodos alternativos para quantificar o crescimento do biofilme, o método XTT é o método mais sensível, reprodutível, preciso, econômico e específico. Embora o ensaio XTT seja uma técnica rápida e fácil comumente usada para avaliar biofilmes, ele tem certas limitações. Embora seja útil para determinar a dosagem ou os efeitos de vários agentes em um biofilme de uma única espécie, deve ser usado com cautela para comparar vários isolados simultaneamente devido à variabilidade metabólica entre isolados21. Para comparações de biofilmes entre cepas, deve-se realizar uma padronização técnica detalhada21. Além disso, enquanto o produto formazan XTT se dissolve prontamente em solução, algumas cepas podem reter alguma quantidade dentro da célula21. Como há falta de clareza envolvendo variáveis, como a escolha do meio, o tempo de desenvolvimento do biofilme e as especificidades do soro, é aconselhável a realização de bioensaios confirmatórios além do ensaio de XTT, por exemplo, a medição da espessura/biomassa do biofilme (utilizando violeta cristal) ou a viabilidade celular (utilizando o método CFU)43. Digno de nota, os resultados deste ensaio XTT correlacionaram-se bem com o ensaio violeta cristal e o método CFU (dados não mostrados). Não obstante as limitações mencionadas acima, esse método pode ser extrapolado para avaliar diferentes grupos de amostras de soro (fonte de anticorpos policlonais), anticorpos monoclonais ou imunoterapias adjuvantes. Embora o protocolo de redução de XTT aqui apresentado mostre apenas o efeito de anticorpos sobre biofilmes de C. tropicalis, ele tem sido utilizado por pesquisadores para estudar o efeito de anticorpos em biofilmes de C. auris também18. Além disso, esse protocolo deriva de estudos prévios realizados com outras espécies de Candida, como C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis e C. auris, o que pode merecer a extensão desse protocolo ao gênero Candida 16,41,44,45,46,47.

Otimização, padronização e melhoria regular nos ensaios de quantificação de biofilme podem aumentar a precisão, o rendimento e a reprodutibilidade. O ensaio de redução de XTT no qual este protocolo se baseia tem sido amplamente utilizado para a avaliação da atividade metabólica e viabilidade de biofilmes. Como o biofilme de Candida é frequentemente resistente a medicamentos antifúngicos, a exploração de novos medicamentos e novas combinações é uma necessidade urgente33. Para combater a questão das infecções associadas ao biofilme, mais compostos antibiofilme devem ser explorados usando ensaios de triagem de biofilme48. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes. Pesquisas futuras baseadas na padronização e melhoria do ensaio de redução de XTT envolvendo imunoterapias baseadas em anticorpos podem ajudar no desenvolvimento de terapias aprimoradas para o manejo e controle efetivos da doença.

A inibição do biofilme por anticorpos específicos de Sap2 tem sido relatada como um mecanismo de proteção mediado por anticorpos na proteção mediada pela vacina Sap2 durante candidíase sistêmica murina causada por C. tropicalis19. Um estudo anterior também mostrou que o CAGTA potencialmente reconhecendo antígenos de seiva reduz o crescimento e a formação de biofilme de C. albicans in vitro16. Em outro estudo, mutantes excluídos por Sap2 exibiram um defeito de crescimento de biofilme na presença de pepstatina A49. Além disso, durante a formação do biofilme, o antígeno Sap2 desempenhou um papel no processamento proteolítico da mucina Msb2 mediada pela via de sinalização da proteína quinase ativada por mitógenos Cek150. Portanto, pode-se especular que o processamento de Msb2 é inibido pela neutralização de Sap2 mediada por anticorpos, o que afeta a integridade do biofilme. Em resumo, este artigo fornece um protocolo detalhado para avaliar o papel dos anticorpos séricos na maturação e desenvolvimento do biofilme de C. tropicalis , que pode ser aplicado para a determinação da atividade metabólica do biofilme em diferentes contextos, utilizando diferentes cepas fúngicas ou fontes de anticorpos.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela bolsa Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia) e pelo Prêmio de Pesquisa em Início de Carreira SER-1058-BIO (Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Governo da Índia) para a SR. Os autores reconhecem uma subvenção ICMR-JRF para P.C e DBT-JRF para P.S. Os autores agradecem ao Dr. Ravikant Ranjan pelas sugestões sobre o manuscrito e assistência técnica do Sr. Pradeep Singh Thakur durante o MEV.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

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Imunologia e Infecção Edição 187
Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes <em>de Candida tropicalis</em>
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Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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