Summary
В настоящем документе описан протокол на основе пластин на основе 96-луночных микротитров с использованием редукционного анализа 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилида-2H-тетразолия (XTT) для изучения влияния антител на биопленки, образованные C. tropicalis. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.
Abstract
Виды Candida являются четвертой наиболее распространенной причиной системных внутрибольничных инфекций. Системный или инвазивный кандидоз часто включает образование биопленки на имплантированных устройствах или катетерах, что связано с повышенной вирулентностью и смертностью. Биопленки, производимые различными видами Candida , проявляют повышенную устойчивость к различным противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в разработке эффективных иммунотерапий или дополнительных методов лечения против биопленок Candida . В то время как роль клеточного иммунитета хорошо известна в антикандидозной защите, роль гуморального иммунитета изучена меньше.
Было выдвинуто предположение, что ингибирование образования и созревания биопленки является одной из основных функций защитных антител, а антитела зародышевой трубки Candida albicans (CAGTA), как было показано, подавляют рост in vitro и образование биопленки C. albicans ранее. В этой статье излагается подробный протокол оценки роли антител на биопленках, образованных C. tropicalis. Методология для этого протокола включает образование биопленки C. tropicalis в 96-луночных микротитрных пластинах, которые затем инкубировали в присутствии или отсутствии антиген-специфических антител с последующим анализом 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-карбоксанилид-2H-тетразолий (XTT) для измерения метаболической активности грибковых клеток в биопленке.
Специфичность была подтверждена с использованием соответствующих сывороточных контролей, включая Sap2-специфическую сыворотку, обедненную антителами. Результаты показывают, что антитела, присутствующие в сыворотке иммунизированных животных, могут ингибировать созревание биопленки Candida in vitro. Таким образом, эта статья дает важную информацию о потенциале антител в разработке новых иммунотерапий и синергетических или дополнительных методов лечения против биопленок во время инвазивного кандидоза. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках.
Introduction
Системный кандидоз является четвертой основной причиной внутрибольничных инфекций, которые связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. В глобальном масштабе системный кандидоз поражает примерно 700 000 человек1. Виды Candida, а именно C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata и C. auris, являются наиболее распространенной причиной инвазивных инфекций Candida 2. Виды Candida являются условно-патогенными микроорганизмами, которые производят биопленки3. Биопленки преимущественно связаны с вирулентностью Candida, и Candida может противостоять окислительным и осмотическим стрессовым условиям, индуцируя образование биопленки4. Биопленки дополнительно модулируют экспрессию факторов вирулентности и компонентов клеточной стенки и образуют экзополимерную защитную матрицу, помогая Candida адаптироваться к различным нишам хозяина 4. Биопленки способствуют адгезии дрожжей на тканях хозяина и медицинских инструментах5. Таким образом, образование биопленки связано с преимуществом дрожжей, поскольку дрожжевые клетки в биопленках могут уклоняться от иммунного ответа хозяина6. Образование биопленки также защищает патогенные дрожжи от действия противогрибковых препаратов5. Снижение восприимчивости биопленок C. albicans к амфотерицину B было продемонстрировано Pierce et al.7,8. Кроме того, биопленки демонстрируют устойчивость к флуконазолу к противогрибковым препаратам, что ухудшает эффективное ведение системного кандидоза 9,10.
Микробы имеют внутреннюю тенденцию прилипать к различным биотическим и абиотическим поверхностям, что приводит к образованию биопленки. Candida albicans, которая является диморфным грибом, существует в дрожжевой и гифальной формах, и ее образование биопленки было охарактеризовано в различных модельных системах in vitro и in vivo 11. Этапы образования биопленки включают адгезию клеток Candida к субстрату, нить, пролиферацию и созревание биопленки11. Первоначально дрожжевая форма C. albicans прилипает к субстратам, включая медицинские устройства и ткани человека, за которыми следует нить и пролиферация C. albicans в гифальные и псевдогифальные формы и, наконец, созревание биопленок, встроенных во внеклеточный матрикс11. Образованию биопленки в значительной степени способствует механизмы патогенеза C. albicans 12. Виды Candida образуют устойчивые к лекарствам биопленки, что затрудняет их искоренение13. Небольшое подмножество популяции, продуцирующей биопленку C. albicans , было описано как обладающее высокой устойчивостью к противогрибковым препаратам амфотерицину B и хлоргексидину14. Следует отметить, что дрожжевые клетки в биопленках демонстрируют высокую устойчивость к мультилекарственной терапии по сравнению с дрожжевыми клетками в планктонной фазе и фазе пролиферации14. Было высказано предположение, что дрожжевые клетки, существующие в биопленках, обладают высокой толерантностью к противогрибковым препаратам, что способствует выживанию C. albicans в биопленках14. Сообщалось, что эти существующие клетки являются фенотипическими вариантами C. albicans , а не мутантами14. Кроме того, клетки биопленок Candida , известных как «персистентные клетки», устойчивы к высоким дозам лечения амфотерицином-B и способствуют выживанию Candida , тем самым создавая большое бремя повторяющихся системных инфекций Candida у лиц с высоким риском15.
Увеличение устойчивости к противогрибковым препаратам у штаммов Candida обусловливает необходимость проведения исследований новых противогрибковых средств и иммунотерапии. Как видно из вышеупомянутых исследований, биопленки Candida показывают снижение восприимчивости к противогрибковым препаратам. Поэтому существует необходимость в улучшенной иммунотерапии для контроля образования биопленки Candida . Более ранние исследования показали, что CAGTA может обеспечить эффективную защиту от системных инфекций Candida путем ингибирования образования биопленки C. albicans in vitro16. В другом исследовании сообщалось, что иммунизация мышей белком C. albicans rAls3-N индуцирует высокие титры антител, которые мешают образованию биопленки C. albicans in vitro17. Анти-Als3-N антитела также оказывали ингибирующее действие на рассеивание C. albicans из биопленок17. Вакцина NDV-3A на основе C. albicans в настоящее время находится в стадии клинических испытаний, и было также обнаружено, что сыворотки против NDV-3A уменьшают образование биопленки C. auris 18. Недавнее исследование выявило ингибирование образования биопленки Sap2-антителами в качестве защитного механизма в мышиной модели системного кандидоза19.
В данной работе изложен подробный протокол in vitro для оценки влияния антиген-специфических антител, присутствующих в поликлональной сыворотке, полученной от различных групп вакцинированных Мышей Sap2, на предварительно сформированные биопленки Candida tropicalis . Для достижения этой цели был оптимизирован и разработан в лаборатории метод, основанный на анализе восстановления XTT, который может измерять жизнеспособность биопленки быстрым, чувствительным и высокопроизводительным способом, в присутствии или отсутствии антител.
Анализ XTT используется для измерения клеточной метаболической активности в качестве индикатора жизнеспособности клеток, клеточной пролиферации и цитотоксичности20. Этот колориметрический анализ основан на восстановлении желтой тетразолиевой соли, натрия 3'-[1-(фениламинокарбонил)-3,4-тетразолий]-бис (4-метокси-6-нитро)гидрата бензолсульфоновой кислоты (XTT) до оранжевого формазанного красителя метаболически активными клетками. Поскольку только жизнеспособные клетки могут уменьшить XTT, количество восстановленного XTT формазана пропорционально интенсивности цвета и жизнеспособности клеток. Образующийся краситель формазана является водорастворимым и непосредственно количественно определяется с помощью пластинчатого считывателя. Благодаря своей водорастворимой природе, анализ XTT позволяет изучать интактные биопленки, а также исследовать восприимчивость биопленки к лекарственным средствам без нарушения структуры биопленки21. Кроме того, этот метод реализован в оценках грибковой жизнеспособности Candida из-за его простоты использования, скорости, точности, высокой пропускной способности и высокой степени воспроизводимости 7,22.
В дополнение к анализу восстановления XTT были также определены многочисленные альтернативные методы измерения количества биопленки. Некоторые из них включают использование анализа восстановления MTT, окрашивание кристаллической фиалкой, количественную оценку ДНК, количественную ПЦР, количественную оценку белка, измерение веса сухих клеток и подсчет жизнеспособных колоний. Эти процедуры сильно различаются с точки зрения их требований к времени и стоимости. Taff et al. провели сравнительный анализ семи различных количественных анализов биопленки Candida и обнаружили, что анализ XTT обеспечивает наиболее воспроизводимый, точный и эффективный метод количественной оценки биопленок C. albicans 23. Методы окрашивания, такие как кристаллический фиолетовый, имеют определенные ограничения; кристаллический фиолетовый тест косвенно определяет количество биопленки путем измерения оптической плотности кристаллической фиолетовой матрицы биопленки и клеток. Хотя анализ кристаллической фиалки обеспечивает хорошую меру массы биопленки, он не дает измерения жизнеспособности биопленки, поскольку он окрашивает как микробные клетки, так и внеклеточный матрикс24. Dhale et al. далее сообщили, что анализ восстановления XTT был наиболее чувствительным, воспроизводимым, точным, эффективным и специфическим методом обнаружения производства биопленки по сравнению с анализом кристаллической фиалки25. Литературные отчеты показали, что анализ XTT хорошо коррелирует с параметром CFU/mL в методе подсчета КОЕ. Однако, по сравнению с анализом XTT, метод КОЕ является трудоемким и медленным26. Кроме того, фракция отделившихся живых клеток может не быть репрезентативной для исходной популяции биопленки27. Хотя анализ восстановления XTT кажется лучшим доступным вариантом для количественной оценки жизнеспособности, есть несколько ограничений этого метода. Хотя метод XTT полезен для сравнения с участием одного грибкового штамма, его использование может быть ограничено при сравнении различных грибковых штаммов и видов. Промежуточные сравнения могут быть затруднены в отсутствие детальной стандартизации, поскольку различные штаммы метаболизируют субстраты с различными возможностями21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Мыши BALB/c были размещены в Центре мелких животных в IIT Roorkee. Все животные содержались в цикле 12 ч: 12 ч света: темноты при 25 ° C и были обеспечены гранулированной диетой и водой ad libitum. Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по этике животных (IAEC) IIT Roorkee.
1. Препарат C. tropicalis
ПРИМЕЧАНИЕ: ГрибОк Candida tropicalis относится к патогенам группы риска 2 и классифицируется как микроорганизм BSL2. Всегда используйте сертифицированные шкафы биологической безопасности класса II при работе с видами Candida . Практикуйте асептические и стерильные методы во время работы с C. tropicalis и следуйте рекомендуемым процедурам биобезопасности для правильной утилизации этого патогена.
- Полоса C. tropicalis (штамм ATCC 750) на агаровой пластине декстрозы Сабуро (SAB).
- Подготовьте выращенную на ночь культуру C. tropicalis , инокуя одну колонию из агаровой пластины SAB в стерильную коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 10 мл среды отвара SAB. В качестве альтернативы используют замороженный глицериновый бульон C. tropicalis и прививают 100 мкл глицеринового бульона в стерильную коническую колбу объемом 250 мл, содержащую 50 мл среды отвара SAB.
- Инкубировать культуру C. tropicalis в орбитальном шейкере при 180 об/мин при 30 °C в течение 24-48 ч.
- Центрифугируют грибковую культуру (клетки в логарифмической фазе) при 2,150 × г в течение 15 мин при 21 °C.
- Откажитесь от супернатанта и добавьте 50 мл стерильного 1x PBS в гранулу. Промыть и повторно суспендировать гранулу в стерильном 1x PBS с мягким вихрем.
- Центрифуга снова при 2,150 × г в течение 15 мин при 21 °C. Выбросьте супернатант и повторно суспендируйте грибковую гранулу в 10 мл стерильного 1x PBS.
- Рассчитайте концентрацию клеток, подсчитывая с помощью гемоцитометра.
- Готовят грибковые запасы при конечной плотности 1,0 × 106 клеток/мл в среде морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS) RPMI 1640. Немедленно используйте клеточную суспензию из шага 1.6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для установки одной плиты на 96 скважин общий объем накопленного грибка составляет 10 мл (100 мкл/скважина). Масштабирование по мере необходимости.
2. Образование биопленки C. tropicalis
- Приготовьте биопленки Candida в 96-луночной полистирольной микротитровой пластине с плоским дном, как описано ранее (Рисунок 1)28,29.
- Добавьте 100 мкл культуры C. tropicalis (из 106 клеток/мл, приготовленных, как указано выше) в 96-луночную микротитровую пластину с использованием многоканальной пипетки (рисунок 2А). Сохраните последние две колонки (11 и 12) как «без грибка плюс сыворотка» и «без грибка и без сыворотки» отрицательный контроль, не добавляя грибковые клетки. Заполните столбцы 11 и 12 только средой RPMI 1640 MOPS объемом 100 мкл.
- Накройте микротитровую пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 24 ч при 37 °C в стационарных условиях.
- На следующий день тщательно аспирируйте среду с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не разрушая биопленки). Осторожно постучите по пластине в перевернутом положении на пятнах, чтобы удалить остаточную среду.
- Вымойте пластину 200 мкл 1x PBS (на лунку) с помощью многоканальной пипетки. Добавляйте PBS очень осторожно вдоль боковых стенок колодца, чтобы избежать разрушения биопленок. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки. Повторите стирку PBS 2x (всего три стирки).
- Для удаления избытка ПБС высушите на воздухе пластину (без крышки) в течение 30 мин при комнатной температуре, внутри шкафа биологической безопасности.
3. Лечение биопленки антителами
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопленки теперь могут быть обработаны для оценки ингибирования созревания биопленки антителами. Мышная сыворотка использовалась в качестве источника поликлональных антител. Различные группы Sap2-иммунизированных (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis и Sap2-парапсилоз) вместе с фиктивно-иммунизированными мышами были обескровлены ретро-орбитально, а сыворотка была выделена, как описано ранее19. Наличие антител против Sap2 было подтверждено с помощью Sap2-специфического ИФА, как описано ранее19.
- Проводят теплоинактивацию сыворотки (источника поликлональных антител) при 56 °C в течение 30 мин перед применением, чтобы исключить роль комплемента в ингибирующей активности. Инактивируйте сыворотку перед тем, как сделать разведение сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку от фиктивно-иммунизированных мышей, преиммунных мышей и Sap2-специфической сыворотки, обедненной антителами, в качестве дополнительной контрольной группы19. Сыворотка, обедненная антителами, была получена в соответствии с предыдущим исследованием19. Среди серийных разведений (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 и 1:12,800) для сыворотки, протестированных по этому протоколу, ингибирование созревания биопленки наблюдалось при 1:25, 1:50 и 1:100; следовательно, 1:50 было выбрано для достижения баланса между ингибированием и потреблением сыворотки. - Подготовьте серийные разведения термоинактивированных образцов сыворотки в стерильной среде RPMI 1640 MOPS (1:50). Используйте общее сывороточное разведение (1:50) для всех образцов сыворотки, которые должны быть протестированы на ингибирование созревания биопленки30.
- Добавьте 100 мкл выбранного разведения сыворотки в каждую лунку 96-луночной микротитровой пластины. Для каждого образца добавьте разбавления сыворотки в двух экземплярах в соответствии с прилагаемой схемой (рисунок 2B).
- В колонку 10 не следует добавлять разведение сыворотки; добавьте только RPMI 1640 MOPS medium для положительного контроля только гриба .
ПРИМЕЧАНИЕ: Колонка 10, строки G1-G8 и H1-H8 первоначально содержали грибковые клетки в RPMI-MOPS. Однако, в то время как RPMI-MOPS был добавлен в столбец 10 даже через 24 ч, строки G1-G8 служили в качестве элемента управления PBS, а строки H1-H8 - в качестве контроля без сыворотки через 24 ч. - В колонке 11 добавьте разведение сыворотки 1:50 во все колодцы, чтобы служить в качестве отрицательного контроля без грибка плюс сыворотка.
- В колонке 12 не добавляйте разведение сыворотки в любой колодец; держите это как отсутствие грибка нет сыворотки отрицательный контроль.
- В колонку 10 не следует добавлять разведение сыворотки; добавьте только RPMI 1640 MOPS medium для положительного контроля только гриба .
- Накройте пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 24 ч при 37 °C.
4. Оценка метаболической активности биопленки
- На следующий день тщательно аспирируйте сыворотку с помощью многоканальной пипетки (не касаясь и не нарушая биопленки). Осторожно постучите по пластине в перевернутом положении по пятнам на листах, чтобы удалить остаточную сыворотку.
- Вымойте пластину 200 мкл 1x PBS (на скважину) с помощью многоканальной пипетки, добавив PBS вдоль боковых стенок скважины, чтобы избежать разрушения биопленок. Тщательно аспирируйте PBS с помощью многоканальной пипетки и повторите стирку PBS 2x (в общей сложности три стирки). Высушите пластину на воздухе (без крышки) в течение 30 мин при комнатной температуре, внутри шкафа биологической безопасности, чтобы высушить любые излишки PBS.
- Препарат ХТТ/менадиона:
- Готовят XTT в стерильном лактате Ringers в виде раствора 0,5 г/л. Растворить 25 мг XTT в 50 мл стерилизованного фильтром рингеров лактата. Aliquot 10 мл в отдельных тубах, покрытых алюминиевой фольгой и хранящихся при -80 °C.
- Готовят менадион в виде запаса 10 мМ. Растворите 8,6 мг менадиона в 5 мл ацетона и распределите 50 мкл в 100 отдельных микротрубках. Храните аликвоты при -80 °C.
- Приготовьте раствор XTT/менадиона непосредственно перед использованием, взяв 10 мл XTT и добавив 1 мкл менадиона для получения рабочего раствора 1 мкМ.
- Добавьте 100 мкл раствора XTT/менадиона на лунку 96-луночной микротитровой пластины. Накройте пластину крышкой и алюминиевой фольгой. Инкубировать пластину в течение 2 ч при 37 °C в темноте.
- Переложите 80 мкл цветного супернатанта из каждой скважины в свежую 96-луночную пластину. Считывайте пластину при 490 нм.
- Рассчитайте среднее значение значений поглощения скважин в колонке 10 (положительный контроль только для грибка), которое будет служить эталонным значением для расчета процентного ингибирования биопленки каждым образцом сыворотки с использованием уравнения (1).
% ингибирования биопленки = 100 -
× 100 (1)
× 100 (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Биопленки Candida tropicalis выращивали в 96-луночных микротитрных пластинах и визуализировали в 40 раз с помощью инвертированного микроскопа (рисунок 1А). Биопленку дополнительно окрашивали с использованием кристаллического фиолетового цвета и наблюдали в 40 раз с помощью инвертированного микроскопа (рисунок 1B). Сканирующая электронная микроскопия показывает репрезентативное изображение биопленки C. tropicalis (рисунок 1C). Для выполнения анализа ингибирования биопленки 105 клеток Candida были добавлены в лунки 96-луночной микротитровой пластины в момент времени 0, согласно макету (рисунок 2A). Через 24 ч пластину промывали, а к предварительно сформированным биопленкам добавляли образцы сыворотки. Общее сывороточное разведение 1:50 было выбрано для сравнения различных образцов сыворотки, полученных из разных групп Мышей, иммунизированных Sap2 и фиктивно-иммунизированных, в соответствии с пилотным исследованием и ранее опубликованным отчетом30.
Различные образцы сыворотки были добавлены к 96-луночной микротитровой пластине в соответствии с макетом (рисунок 2B) и оценены в двух экземплярах. Сыворотки, полученные на 30-й день после иммунизации от трех мышей в группе (Sap2-albicans immunized, Sap2-tropicalis immunized, Sap2-parapsilosis immunized, sham-immunized group, preimmune mice и Sap2-обедненный контрольный образец), были проанализированы в разведении 1:50. Пластину считывали на длине волны 490 нм с помощью ифа-считывателя для получения XTT-колориметрических показаний (значения OD490 ) для биопленок C. tropicalis , образованных в присутствии или отсутствии сыворотки (таблица 1). Отрицательное пустое было рассчитано с использованием среднего значения столбцов 11 и 12 (0,04). Положительный контроль был рассчитан путем расчета среднего значения скважин, содержащих только грибы (колонка 10; 0,8165). Перед расчетами из измерений поглощения экспериментальных скважин вычитали среднее значение поглощения контрольных скважин в колонках 11 и 12 (0,04). Таким образом, эталонное значение положительного контроля биопленки (колонка 10) было установлено равным 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).
Значения (среднее минус заготовка), полученные для экспериментальных скважин, затем делились на этот положительный контроль (0,7765), а процент получали путем умножения на 100. Процент ингибирования биопленки рассчитывали путем дальнейшего вычитания полученного значения из 100. Гистограмма показывает все построенные значения (рисунок 3). Обычная односторонняя ANOVA, за которой последовал пост-специальный тест Даннетта для множественных сравнений, использовалась для расчета значений p для оценки статистических различий между различными группами сыворотки. Статистически значимым было признано значение p в размере <0,05. Сыворотка от мышей, иммунизированных Sap2-парапсилезом, может предотвратить созревание предварительно сформированных биопленок C. tropicalis на 65%, по сравнению с сывороткой от Sap2-альбиканов (45%) и Sap2-tropicalis (55%) иммунизированных мышей. В целом, ингибирование биопленки Sap2-иммунной сывороткой было значительно выше, чем в фиктивно-иммунной сыворотке (16%) и преиммунной сыворотке (13%) соответственно. При истощении Sap2-специфических антител из сыворотки, как описано в другом месте19, способность ингибирования биопленки снижалась до 10%. Ингибирование биопленки было близко к незначительному при использовании PBS (5%) и контроля без сыворотки (5%).
Рисунок 1: Визуализация биопленки Candida tropicalis . (A) Визуализация биопленки Candida tropicalis , образующейся на дне 96-луночной микротитровой пластины после удаления среды RPMI с использованием инвертированного микроскопа. Изображение было получено с помощью ярко-полевой микроскопии (пятно не использовалось). (B) Визуализация биопленки C. tropicalis , образовавшейся на дне 96-луночной микротитровой пластины после окрашивания кристаллического фиолетового цвета. (C) Визуализация биопленки C. tropicalis , сформированной на стеклянных слайдах с помощью сканирующей электронной микроскопии. Шкала стержней = 100 мкм (A,B), 10 мкм (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Компоновка 96-луночного формата пластины. Добавление (А) грибковых клеток в колодцы и (В) сывороточных разведений из разных групп мышей (Sap2-альбиканы иммунизированные, Sap2-тропикалис иммунизированные, Sap2-парапсилезные иммунизированные и фиктивные иммунизированные; n = 3), оцениваемые в двух экземплярах при разведении 1:50. Дополнительные средства контроля включали sap2-истощенную сыворотку, преиммунную сыворотку, PBS и контроль без сыворотки. В колонку 10 не добавляли сыворотку (присутствовали грибковые клетки, положительный контроль). В колонке 11 не добавлялись грибковые клетки (присутствовала сыворотка). В колонке 12 не добавлялись грибковые клетки (сыворотка отсутствовала). Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; Sap2 = секретируемая аспартилпротеиназа 2. Термины m1, m2 и m3 относятся к разным мышам в каждой группе (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: График, показывающий эффективность Sap2-специфических поликлональных антител против предварительно сформированных биопленок C. tropicalis . Источник иммунной сыворотки показан на оси X, в то время как процент ингибирования созревания биопленки C. tropicalis показан на оси Y. Бары представляют среднее ± SEM (n = 3). Обычная односторонняя ANOVA, за которой последовал пост-специальный тест Даннетта для нескольких сравнений, использовалась для расчета значений p . Полосы и символы представляют различия между группами мышей, иммунизированных Sap2, с фиктивно-иммунизированными мышами. , p < 0.0001. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; Sap2 = секретируемая аспартилпротеиназа 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| <> | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 0.475 | 0.4141 | 0.0441 | 0.4637 | 0.485 | 0.0484 | 0.5179 | 0.4068 | 0.0442 | 0.8826 | 0.0452 | 0.0404 |
| B | 0.3848 | 0.3773 | 0.0428 | 0.369 | 0.3781 | 0.0465 | 0.4105 | 0.3773 | 0.0447 | 0.8428 | 0.0426 | 0.041 |
| C | 0.2754 | 0.2728 | 0.0427 | 0.305 | 0.3083 | 0.0415 | 0.3531 | 0.3213 | 0.0432 | 0.9661 | 0.0444 | 0.0453 |
| D | 0.6965 | 0.7185 | 0.043 | 0.6681 | 0.6711 | 0.0403 | 0.6346 | 0.728 | 0.0433 | 0.8643 | 0.0384 | 0.0358 |
| E | 0.7031 | 0.7117 | 0.0481 | 0.7806 | 0.688 | 0.0521 | 0.7095 | 0.6998 | 0.0525 | 0.7883 | 0.0491 | 0.0416 |
| F | 0.7588 | 0.7441 | 0.0456 | 0.7173 | 0.7233 | 0.0437 | 0.7733 | 0.6808 | 0.0462 | 0.7256 | 0.0468 | 0.0354 |
| G | 0.7681 | 0.7708 | 0.0435 | 0.7949 | 0.7496 | 0.0445 | 0.7695 | 0.7898 | 0.0451 | 0.7335 | 0.0429 | 0.0371 |
| H | 0.7652 | 0.7855 | 0.0469 | 0.7818 | 0.7766 | 0.0428 | 0.7592 | 0.7765 | 0.0445 | 0.7295 | 0.044 | 0.0341 |
Таблица 1: Показания поглощения при 490 нм для 96-луночной микротитровой пластины. Для получения показаний поглощения использовался стандартный считыватель пластин (Tecan), и показания были сопоставлены с макетом, описанным на рисунке 2. Последующие расчеты были выполнены с использованием этих данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Грибковые инфекции, вызванные видами Candida, связаны с высокими показателями заболеваемости и смертности во всем мире. Растущая угроза инвазивной грибковой инфекции требует раннего лечения таких опасных для жизни заболеваний. Большинство инфекций Candida включают образование биопленок, которые прилипают к различным медицинским устройствам и отвечают за персистенцию и рецидив грибковых инфекций в больничных условиях31. Биопленки состоят из дрожжевых или гифальных клеток, и они проявляют значительную устойчивость к большинству обычных противогрибковых препаратов32. Противогрибковая резистентность биопленок Candida была объяснена несколькими механизмами, включая снижение проникновения противогрибка, наличие внеклеточного матрикса, сверхэкспрессию насосов лекарственного потока, измененный состав стеринов клеточной мембраны, медленный рост и пространственную гетерогенность, активацию различных сигнальных путей и наличие лекарственно-толерантных персистерных клеток33,34. Ингибирование адгезии Candida и образование биопленки являются наиболее важными стратегиями предотвращения инфекции Candida.
Различные анализы in vitro, такие как анализы жизнеспособности клеток, анализы микротитровой пластины и анализы измерения сухой массы, были использованы для изучения образования биопленки Candida, которые основаны на оценке конкретных временных точек биопленок23. Были разработаны более совершенные анализы, такие как микрофлюидные анализы на основе устройств, которые могут быть использованы для оценки образования биопленки в реальном времени35. До сих пор образование биопленки изучалось с использованием анализов in vitro, но необходимо понять динамический процесс образования биопленки в условиях in vivo, а также36,37. В настоящее время большинство исследований ингибирования биопленки применяются к C. albicans, и для искоренения биопленок Candida, не относящихся к альбиканам, доступно несколько исследований. Спектр инфекций Candida постепенно менялся в течение последних нескольких десятилетий, и новые неальбиканские виды Candida представляют собой высокое бремя заболеваемости и смертности во всем мире. Поэтому возникает необходимость в разработке новых стратегий контроля образования биопленки и разработке анализов ингибирования биопленки, ориентированных на неальбиканские виды Candida. Иммунотерапия, особенно антитела, обладает большим потенциалом для ингибирования образования биопленки и может быть использована для лечения системной кандидозной инфекции38. Несколько отчетов продемонстрировали роль антител в ингибировании биопленки на более ранних стадиях формирования биопленки. Сообщалось, что поликлональные антитела, генерируемые в ответ на комплементарный рецептор 3-родственный белок (CR3-RP, имеющий потенциальную роль в грибковой приверженности) иммунизации у кроликов, уменьшали адгезию и образование биопленки C. albicans на эпителиальных клеткахбуккальной щели 39. Кроме того, штаммы Candida, включая изоляты катетера, были предварительно инкубированы поликлональным анти-CR3-RP антителом и моноклональным антителом, OKM1, что снижало адгезию и образование биопленки. Жизнеспособность клеток C. albicans оценивали с использованием анализа XTT во время фазы адгезии и фазы формирования биопленки40. В нескольких исследованиях оценивалась роль антител против образования биопленки вида Candida, не являющейся альбиканами. Chupacova et al. оценили эффективность поликлональных анти-CR3-RP антител против C. albicans вместе с C. dubliniensis с использованием анализа XTT. Поликлональные анти-CR3-RP антитела ингибировали адгезию и образование биопленки как C. albicans, так и C. dubliniensis41.
В этом исследовании описан простой, быстрый и удобный для пользователя протокол оценки влияния антител на созревание и развитие биопленки. Этот 96-луночный анализ восстановления XTT на основе микротитровой пластины измеряет метаболическую активность жизнеспособных клеток в биопленках и был адаптирован из более ранних исследований 7,8. Анализ XTT, описанный в настоящем описании, широко используется для оценки жизнеспособного роста биопленки. Он стал широко используемым тестом жизнеспособности клеток, потому что он быстрый, удобный и может использоваться в формате с высокой пропускной способностью, таком как пластина с 96 лунками. Кроме того, он может быть использован для количественной оценки как дрожжевых, так и гифальных форм биопленок Candida. Он также может быть использован для измерения биопленок Candida на различных субстратах, таких как медицинские устройства (например, катетеры) и контактные линзы.
Некоторые из критических шагов этого протокола включают энергичное вихрь клеточных суспензий перед пипеткой на всех этапах, чтобы избежать грибковой агрегации7. Плохие биопленки, вероятно, будут развиваться, когда плотность клеток либо слишком высока, либо слишком низка. Поэтому пользователи должны следовать идеальной плотности грибковых клеток в исходном инокуляте7. Этапы промывки очень важны, и следует избегать чрезмерного промывания клеток, чтобы предотвратить разрушение биопленки22. Нижний слой биопленки не должен нарушаться в процессе промывки. Анализ всегда должен выполняться в темных условиях, и необходимо включить несколько реплик22. Свежий раствор ХТТ следует готовить каждый раз непосредственно перед употреблением. Поскольку разница во времени между двумя реакциями может искажать результаты, пользователи должны работать быстро, чтобы обеспечить минимальную разницу во времени при добавлении раствора XTT в первую и последнюю скважину 96-луночной пластины42. Использование фольги или парапленки рекомендуется для предотвращения испарения. При необходимости можно выполнить несколько шагов по устранению неполадок. В случае, если рост биопленки отсутствует или неудовлетворительный, следует использовать соответствующее разбавление посева и расчеты. Для лучшего образования биопленки условия субкультуры могут быть изменены, и рост биопленки может быть опробован с использованием различных поверхностных материалов. Чтобы значительно улучшить чувствительность анализа XTT, можно уменьшить время, необходимое для образования биопленки, увеличить концентрацию противогрибкового агента или сократить инкубационный период анализа7. Чтобы избежать нарушения биопленки, следует избегать чрезмерного промывания клеток22. Можно либо избежать внешних скважин, чтобы предотвратить воздействие света на пробирные агенты, либо добавить жидкость во внешние скважины, чтобы агенты не испарялись из внутренних скважин. Следует давать мягкие стирки, если биопленка нарушается во время стирки22. В то время как этот протокол тестирует влияние сыворотки на 24-часовые предварительно сформированные биопленки для оценки ингибирования созревания биопленки, пользователи также могут модифицировать этот протокол, чтобы добавить сыворотку в момент времени 0 для оценки ингибирования образования биопленки, согласно более раннему отчету30.
По сравнению с другими альтернативными методами количественной оценки роста биопленки, метод XTT является наиболее чувствительным, воспроизводимым, точным, экономически эффективным и специфическим методом. Хотя анализ XTT является широко используемым быстрым и простым методом оценки биопленок, он имеет определенные ограничения. Хотя он полезен для определения дозировки или эффектов различных агентов в биопленке одного вида, его следует использовать с осторожностью для сравнения нескольких изолятов одновременно из-за метаболической изменчивости между изолятами21. Для сравнения биопленки между штаммами следует провести детальную стандартизацию методики21. Кроме того, в то время как продукт XTT formazan легко растворяется в растворе, некоторые штаммы могут сохранять некоторое количество в клетке21. Поскольку отсутствует ясность, связанная с переменными, такими как выбор среды, время развития биопленки и специфика сыворотки, целесообразно выполнять подтверждающие биоанализы в дополнение к анализу XTT, например, измерение толщины биопленки / биомассы (с использованием кристаллической фиалки) или жизнеспособности клеток (с использованием метода КОЕ)43. Следует отметить, что результаты этого анализа XTT хорошо коррелировали с анализом кристаллической фиалки и методом КОЕ (данные не показаны). Несмотря на ограничения, упомянутые выше, этот метод может быть экстраполирован для оценки различных групп образцов сыворотки (источник поликлональных антител), моноклональных антител или дополнительной иммунотерапии. Хотя представленный здесь протокол восстановления XTT показывает только влияние антител на биопленки C. tropicalis, он был использован исследователями для изучения влияния антител на биопленки C. auris, а также18. Кроме того, этот протокол вытекает из предыдущих исследований, проведенных с другими видами Candida, такими как C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis и C. auris, которые могут заслуживать расширения этого протокола на род Candida 16,41,44,45,46,47.
Оптимизация, стандартизация и регулярное улучшение количественных анализов биопленки могут повысить точность, пропускную способность и воспроизводимость. Анализ восстановления XTT, на котором основан этот протокол, широко используется для оценки метаболической активности и жизнеспособности биопленок. Поскольку биопленка Candida часто устойчива к противогрибковым препаратам, исследование новых лекарств и новых комбинаций является насущной необходимостью33. Для борьбы с проблемой инфекций, связанных с биопленкой, необходимо изучить больше соединений антибиопленки с использованием анализов скрининга биопленки48. Этот протокол in vitro может быть использован для проверки влияния потенциальных новых противогрибковых соединений на метаболическую активность клеток вида Candida в биопленках. Будущие исследования, основанные на стандартизации и улучшении анализа снижения XTT с участием иммунотерапии на основе антител, могут помочь в разработке улучшенных терапевтических средств для эффективного управления и контроля заболеваний.
Ингибирование биопленки Sap2-специфическими антителами было сообщено как опосредованный антителами защитный механизм в Sap2-вакцинной опосредованной защите во время мышиного системного кандидоза, вызванного C. tropicalis19. Более раннее исследование также показало, что CAGTA потенциально распознает антигены Sap, уменьшая рост и образование биопленки C. albicans in vitro16. В другом исследовании Удалённые Sap2 мутанты продемонстрировали дефект роста биопленки в присутствии пепстатина А49. Кроме того, во время образования биопленки антиген Sap2 играл роль в протеолитической обработке муцина Msb2, опосредованной через митоген-активированный протеинкиназный сигнальный путь50 Cek1. Таким образом, можно предположить, что обработка Msb2 ингибируется опосредованной антителами нейтрализацией Sap2, которая влияет на целостность биопленки. Таким образом, в данной статье представлен подробный протокол оценки роли сывороточных антител в созревании и развитии биопленки C. tropicalis , который может быть применен для определения метаболической активности биопленки в различных условиях, с использованием различных грибковых штаммов или источников антител.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Рамалингасвами DBT-843-BIO (Департамент биотехнологии, правительство Индии) и премией за ранние карьерные исследования SER-1058-BIO (Совет по научным и инженерным исследованиям, правительство Индии) для S.R. Авторы признают грант ICMR-JRF для P.C и грант DBT-JRF для P.S. Авторы благодарят д-ра Равиканта Ранджана за предложения по рукописи и техническую помощь г-на Прадипа Сингха Тхакура во время SEM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | - | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | - | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
References
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
- Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
- Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
- Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
- Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
- Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
- Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
- Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
- LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
- Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
- Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
- Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
- Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
- Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
- Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
- Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
- Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
- Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
- Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
- Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
- Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
- Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
- Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
- Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
- Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
- Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
- Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
- Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
- Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
- Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
- Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
- Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
- Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
- Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
- Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).
