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Immunology and Infection

Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de Candida tropicalis

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

En el presente documento se describe un protocolo basado en placas de microtitulación de 96 pocillos que utiliza un ensayo de reducción de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT), para estudiar los efectos de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Abstract

Las especies de Candida son la cuarta causa más común de infecciones nosocomiales sistémicas. La candidiasis sistémica o invasiva con frecuencia implica la formación de biopelículas en dispositivos implantados o catéteres, lo que se asocia con un aumento de la virulencia y la mortalidad. Las biopelículas producidas por diferentes especies de Candida exhiben una mayor resistencia contra varios medicamentos antifúngicos. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar inmunoterapias efectivas o tratamientos adyuvantes contra las biopelículas de Candida . Si bien el papel de la inmunidad celular está bien establecido en la protección contra Candida , el papel de la inmunidad humoral se ha estudiado menos.

Se ha planteado la hipótesis de que la inhibición de la formación y maduración de biopelículas es una de las principales funciones de los anticuerpos protectores, y se ha demostrado que los anticuerpos del tubo germinal de Candida albicans (CAGTA) suprimen el crecimiento in vitro y la formación de biopelículas de C. albicans antes. Este documento describe un protocolo detallado para evaluar el papel de los anticuerpos en las biopelículas formadas por C. tropicalis. La metodología para este protocolo implica la formación de biopelículas de C. tropicalis en placas de microtitulación de 96 pocillos, que luego se incubaron en presencia o ausencia de anticuerpos específicos de antígeno, seguido de un ensayo de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilida-2H-tetrazolio (XTT) para medir la actividad metabólica de las células fúngicas en la biopelícula.

La especificidad se confirmó mediante el uso de controles séricos apropiados, incluido el suero con depleción de anticuerpos específicos de Sap2. Los resultados demuestran que los anticuerpos presentes en el suero de animales inmunizados pueden inhibir la maduración del biofilm de Candida in vitro. En resumen, este documento proporciona información importante sobre el potencial de los anticuerpos en el desarrollo de nuevas inmunoterapias y tratamientos sinérgicos o adyuvantes contra las biopelículas durante la candidiasis invasiva. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas.

Introduction

La candidiasis sistémica es la cuarta causa principal de infecciones nosocomiales, que se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. A nivel mundial, la candidiasis sistémica afecta a aproximadamente 700.000 individuos1. Las especies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata y C. auris, son la causa más común de infecciones invasivas por Candida 2. Las especies de Candida son patógenos oportunistas que producen biopelículas3. Las biopelículas se asocian predominantemente con la virulencia de Candida, y Candida puede soportar condiciones de estrés oxidativo y osmótico al inducir la formación de biopelículas4. Los biofilms modulan aún más la expresión de factores de virulencia y componentes de la pared celular y forman una matriz protectora exopolimérica, ayudando a Candida a adaptarse a diferentes nichos de huésped4. Las biopelículas contribuyen a la adherencia de la levadura en los tejidos del huésped y los instrumentos médicos5. Como tal, la formación de biopelículas se asocia con una ventaja para las levaduras, ya que las células de levadura dentro de las biopelículas pueden evadir la respuesta inmune del huésped6. La formación de biopelículas también protege a las levaduras patógenas de la acción de los fármacos antifúngicos5. La disminución de la susceptibilidad de los biofilms de C. albicans a la anfotericina B ha sido demostrada por Pierce et al.7,8. Además, los biofilms demuestran resistencia a los fármacos antifúngicos al fluconazol, lo que perjudica el manejo eficaz de la candidiasis sistémica 9,10.

Los microbios tienen una tendencia intrínseca a adherirse a diversas superficies bióticas y abióticas, lo que resulta en la formación de biopelículas. Candida albicans, que es un hongo dimórfico, existe en formas de levadura e hifales, y su formación de biofilm ha sido caracterizada en varios sistemas modelo in vitro e in vivo 11. Los pasos de la formación del biofilm incluyen la adhesión de las células de Candida al sustrato, la filamentación, la proliferación y la maduración del biofilm11. Inicialmente, la forma de levadura de C. albicans se adhiere a sustratos, incluidos dispositivos médicos y tejido humano, seguida de filamentación y proliferación de C. albicans en formas hifales y pseudohifales, y finalmente la maduración de biopelículas incrustadas en la matriz extracelular11. La formación de biopelículas contribuye en gran medida a los mecanismos de patogénesis de C. albicans 12. Las especies de Candida forman biopelículas resistentes a los medicamentos, lo que hace que su erradicación sea un desafío13. Un pequeño subconjunto de la población productora de biopelícula de C. albicans ha sido descrito como altamente resistente a los fármacos antifúngicos anfotericina B y clorhexidina14. Cabe destacar que las células de levadura en biopelículas exhiben una alta resistencia a la terapia multifármaco en comparación con las células de levadura en la fase planctónica y la fasede proliferación 14. Se ha sugerido que las células de levadura existentes en las biopelículas son altamente tolerantes a los fármacos antifúngicos, lo que contribuye a la supervivencia de C. albicans en biopelículas14. Estas células existentes fueron reportadas como variantes fenotípicas de C. albicans y no mutantes14. Además, las células de biofilms de Candida conocidas como "células persistentes" son tolerantes a altas dosis de tratamiento con anfotericina-B y contribuyen a la supervivencia de Candida, lo que representa una gran carga de infecciones sistémicas recurrentes por Candida en individuos de alto riesgo15.

El aumento de la resistencia a los medicamentos antifúngicos en las cepas de Candida requiere la investigación de nuevos agentes antifúngicos e inmunoterapias. Como se desprende de los estudios mencionados anteriormente, las biopelículas de Candida muestran una menor susceptibilidad a los medicamentos antimicóticos. Por lo tanto, existe la necesidad de inmunoterapias mejoradas para controlar la formación de biopelículas de Candida. Estudios anteriores han demostrado que CAGTA puede proporcionar una protección eficaz contra las infecciones sistémicas por Candida mediante la inhibición de la formación de biopelículas de C. albicans in vitro16. Otro estudio informó que la inmunización de ratones con la proteína C. albicans rAls3-N induce altos títulos de anticuerpos que interfieren con la formación de biopelículas de C. albicans in vitro17. Los anticuerpos anti-Als3-N también ejercieron un efecto inhibitorio sobre la dispersión de C. albicans de biofilms17. La vacuna NDV-3A basada en C. albicans se encuentra actualmente en ensayo clínico y también se encontró que los sueros anti-NDV-3A reducen la formación de biopelículas de C. auris 18. Un estudio reciente identificó la inhibición de la formación de biopelículas por anticuerpos Sap2 como un mecanismo de protección en un modelo murino de candidiasis sistémica19.

Este documento describe un protocolo in vitro detallado para evaluar el efecto de los anticuerpos antígeno-específicos presentes en el suero policlonal obtenido de diferentes grupos de ratones vacunados con Sap2 en biopelículas preformadas de Candida tropicalis . Para lograr esto, se optimizó y desarrolló en el laboratorio un método basado en un ensayo de reducción XTT, que puede medir la viabilidad del biofilm de manera rápida, sensible y de alto rendimiento, en presencia o ausencia de anticuerpos.

El ensayo XTT se utiliza para medir la actividad metabólica celular como un indicador de viabilidad celular, proliferación celular y citotoxicidad20. Este ensayo colorimétrico se basa en la reducción de una sal amarilla de tetrazolio, 3'-[1-(fenililaminocarbonil)-3,4-tetrazolio]-bis (4-metoxi-6-nitro) benceno sulfónico hidrato de ácido sulfónico (XTT) a un colorante formazán naranja por células metabólicamente activas. Dado que solo las células viables pueden reducir XTT, la cantidad de formazan XTT reducida es proporcional a la intensidad del color y la viabilidad celular. El colorante formazán formado es soluble en agua y se cuantifica directamente utilizando un lector de placas. Debido a su naturaleza soluble en agua, el ensayo XTT permite el estudio de biofilms intactos, así como el examen de la susceptibilidad a los medicamentos biofilm, sin interrupción de la estructura del biofilm21. Además, este método se implementa en las evaluaciones de viabilidad fúngica de Candida debido a su facilidad de uso, velocidad, precisión, alto rendimiento y alto grado de reproducibilidad 7,22.

Además del ensayo de reducción XTT, también se han identificado numerosas técnicas alternativas para la medición de la cantidad de biofilm. Algunos de estos incluyen el uso del ensayo de reducción de MTT, tinción de violeta cristalina, cuantificación de ADN, PCR cuantitativa, cuantificación de proteínas, medición del peso de células secas y conteo de colonias viables. Estos procedimientos varían ampliamente en términos de sus requisitos de tiempo y costo. Taff et al. realizaron un análisis comparativo de siete ensayos diferentes de cuantificación de biopelículas de Candida y encontraron que el ensayo XTT proporcionó el método más reproducible, preciso y eficiente para la estimación cuantitativa de biopelículas de C. albicans 23. Las técnicas de tinción como el cristal violeta tienen ciertas limitaciones; La prueba de violeta de cristal determina indirectamente la cantidad de biopelícula midiendo la densidad óptica de la matriz y las células de la biopelícula teñida de violeta de cristal. Aunque el ensayo de violeta cristalina proporciona una buena medida de la masa del biofilm, no da una medida de viabilidad del biofilm, ya que tiñe tanto las células microbianas como la matriz extracelular24. Dhale et al. informaron además que el ensayo de reducción XTT fue el método más sensible, reproducible, preciso, eficiente y específico para detectar la producción de biopelícula en comparación con el ensayo de violeta cristal25. Los informes de la literatura han demostrado que el ensayo XTT se correlaciona bien con el parámetro UFC/ml en el método de conteo de UFC. Sin embargo, en comparación con el ensayo XTT, el método CFU es laborioso y lento26. Además, la fracción de células vivas separadas puede no ser representativa de la población inicial de biofilm27. Aunque el ensayo de reducción XTT parece la mejor opción disponible para cuantificar la viabilidad, existen algunas limitaciones de esta técnica. Si bien el método XTT es útil para comparaciones que involucran una cepa de hongos, su uso puede ser limitado cuando se comparan diferentes cepas y especies de hongos. Las comparaciones entre cepas pueden ser difíciles en ausencia de una estandarización detallada, ya que diferentes cepas metabolizan sustratos con diferentes capacidades21.

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Protocol

Los ratones BALB/c fueron alojados en la Instalación de Pequeños Animales en IIT Roorkee. Todos los animales se mantuvieron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h:12 h a 25 °C y se les proporcionó una dieta de pellets y agua ad libitum. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) del IIT Roorkee.

1. Preparación de C. tropicalis

NOTA: El hongo Candida tropicalis pertenece a patógenos del Grupo de Riesgo 2 y está clasificado como un microorganismo BSL2. Siempre use gabinetes de seguridad biológica certificados de Clase II cuando trabaje con especies de Candida . Practique técnicas asépticas y estériles durante el trabajo con C. tropicalis y siga los procedimientos de bioseguridad recomendados para la eliminación adecuada de este patógeno.

  1. Raya C. tropicalis (cepa ATCC 750) en una placa de agar dextrosa Sabouraud (SAB).
  2. Prepare un cultivo de C. tropicalis cultivado durante la noche inoculando una sola colonia de la placa de agar SAB en un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 10 ml de medio de caldo SAB. Alternativamente, utilizar un caldo de glicerol congelado de C. tropicalis e inocular 100 μL del caldo de glicerol en un matraz cónico estéril de 250 ml que contenga 50 ml de medio de caldo SAB.
  3. Incubar el cultivo de C. tropicalis en un agitador orbital a 180 rpm a 30 °C durante 24-48 h.
  4. Centrifugar el cultivo fúngico (células en fase logarítmica) a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C.
  5. Deseche el sobrenadante y agregue 50 ml de PBS estéril 1x al pellet. Lave y resuspenda el pellet en 1x PBS estéril con un vórtice suave.
  6. Centrifugar de nuevo a 2.150 × g durante 15 min a 21 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet fúngico en 10 ml de PBS estéril 1x.
  7. Calcular la concentración de células contando con un hemocitómetro.
  8. Preparar cepos fúngicos a una densidad final de 1,0 × 106 células/ml en medio RPMI 1640 de ácido morfolinapropanosulfónico (MOPS). Utilice inmediatamente la suspensión celular del paso 1.6.
    NOTA: Para configurar una placa de 96 pocillos, el volumen total de material fúngico necesario es de 10 ml (100 μL/pocillo). Escale según sea necesario.

2. Formación de biofilm de C. tropicalis

  1. Preparar biofilms de Candida en una placa de microtitulación de poliestireno de fondo plano de 96 pocillos como se describió anteriormente (Figura 1)28,29.
  2. Añadir 100 μL de cultivo de C. tropicalis (a partir de 106 células /ml, preparado como el anterior) a una placa de microtitulación de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal (figura 2A). Mantenga las dos últimas columnas (11 y 12) como controles negativos 'sin hongos más suero' y 'sin hongos y sin suero' al no agregar células fúngicas. Llene las columnas 11 y 12 con 100 μL de medio RPMI 1640 MOPS solo.
  3. Cubra la placa de microtitulación con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C en condiciones estacionarias.
  4. Al día siguiente, aspirar el medio cuidadosamente con una pipeta multicanal (sin tocar ni interrumpir las biopelículas). Golpee suavemente la placa en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier medio residual.
  5. Lavar la placa con 200 μL de 1x PBS (por pocillo) con una pipeta multicanal. Agregue PBS muy suavemente a lo largo de las paredes laterales del pozo para evitar interrumpir las biopelículas. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal. Repita el lavado PBS 2 veces (un total de tres lavados).
  6. Para eliminar el exceso de PBS, seque al aire la placa (sin tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de un gabinete de seguridad biológica.

3. Tratamiento del biofilm con anticuerpos

NOTA: Las biopelículas ahora se pueden procesar para evaluar la inhibición de la maduración de la biopelícula por anticuerpos. Se utilizó suero murino como fuente de anticuerpos policlonales. Diferentes grupos de ratones inmunizados con Sap2 (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis y Sap2-parapsilosis) junto con ratones inmunizados simuladamente fueron sangrados retroorbitalmente y el suero se aisló como se describió anteriormente19. La presencia de anticuerpos anti-Sap2 se confirmó utilizando ELISA específico de Sap2 como se describió anteriormente19.

  1. Realizar la inactivación térmica del suero (fuente de anticuerpos policlonales) a 56 °C durante 30 min antes de su uso para descartar el papel del complemento en la actividad inhibitoria. Inactive el suero con calor antes de hacer la dilución del suero.
    NOTA: Use suero de ratones inmunizados simulados, ratones preinmunes y suero con anticuerpos agotados específicos de Sap2 como controles adicionales19. El suero agotado de anticuerpos fue preparado según un estudio previo19. Entre las diluciones seriadas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 y 1:12.800) para el suero probado en este protocolo, se observó inhibición de la maduración del biofilm a las 1:25, 1:50 y 1:100; Por lo tanto, se seleccionó 1:50 para lograr un equilibrio entre la inhibición y el consumo de suero.
  2. Preparar diluciones seriadas de muestras de suero inactivado por calor en medio estéril RPMI 1640 MOPS (1:50). Utilice una dilución sérica común (1:50) para todas las muestras de suero que se van a analizar para la inhibición de la maduración del biofilm30.
  3. Agregue 100 μL de la dilución sérica seleccionada a cada pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Para cada muestra, agregue diluciones de suero por duplicado, según el diseño adjunto (Figura 2B).
    1. En la columna 10, no añadir dilución de suero; agregue solo RPMI 1640 MOPS medio para el control positivo solo de hongos .
      NOTA: La columna 10, filas G1-G8 y H1-H8 inicialmente tenían células fúngicas en RPMI-MOPS. Sin embargo, mientras que RPMI-MOPS se agregó a la columna 10 incluso después de 24 h, las filas G1-G8 sirvieron como control PBS y las filas H1-H8 como control sin suero después de 24 h.
    2. En la columna 11, agregue una dilución 1:50 de suero a todos los pocillos para que sirva como control negativo sin hongos más suero.
    3. En la columna 12, no agregue dilución de suero a ningún pocillo; Mantenga esto como el control negativo sin hongos sin suero.
  4. Cubra la placa con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 24 h a 37 °C.

4. Estimación de la actividad metabólica del biofilm

  1. Al día siguiente, aspire el suero cuidadosamente con una pipeta multicanal (sin tocar ni interrumpir las biopelículas). Golpee suavemente el plato en posición invertida sobre las hojas secantes para eliminar cualquier suero residual.
  2. Lave la placa con 200 μL de 1x PBS (por pocillo) usando una pipeta multicanal, agregando el PBS a lo largo de las paredes laterales del pozo para evitar interrumpir las biopelículas. Aspirar el PBS cuidadosamente con una pipeta multicanal y repetir el lavado PBS 2x (un total de tres lavados). Seque al aire la placa (sin la tapa) durante 30 minutos a temperatura ambiente, dentro de un gabinete de seguridad biológica para secar cualquier exceso de PBS.
  3. Preparación de XTT/menadiona:
    1. Preparar XTT en lactato de Ringers estéril como una solución de 0,5 g/L. Disuelva 25 mg de XTT en 50 ml de lactato Ringers esterilizado por filtro. Alícuota 10 ml en tubos separados cubiertos con papel de aluminio y conservar a -80 °C.
    2. Prepare la menadiona como un stock de 10 mM. Disolver 8,6 mg de menadiona en 5 ml de acetona y distribuir 50 μL en 100 microtubos separados. Conservar las alícuotas a -80 °C.
    3. Prepare la solución XTT/menadiona justo antes de usar tomando 10 ml de XTT y agregando 1 μL de menadiona para obtener una solución de trabajo de 1 μM.
  4. Añadir 100 μL de la solución XTT/menadiona por pocillo de la placa de microtitulación de 96 pocillos. Cubra la placa con una tapa y papel de aluminio. Incubar la placa durante 2 h a 37 °C en la oscuridad.
  5. Transfiera 80 μL del sobrenadante coloreado de cada pocillo a una placa fresca de 96 pocillos. Lea la placa a 490 nm.
  6. Calcular la media de los valores de absorbancia de los pocillos en la columna 10 (control positivo solo de hongos), que servirá como valor de referencia para calcular el porcentaje de inhibición de biopelícula por cada muestra de suero utilizando la ecuación (1).
    % de inhibición del biofilm = 100 - Equation 1× 100 (1)

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Representative Results

Las biopelículas de Candida tropicalis se cultivaron en placas de microtitulación de 96 pocillos y se obtuvieron imágenes a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1A). La biopelícula se tiñó aún más con cristal violeta y se observó a 40x utilizando un microscopio invertido (Figura 1B). La microscopía electrónica de barrido muestra una imagen representativa de la biopelícula de C. tropicalis (Figura 1C). Para realizar el ensayo de inhibición de biopelículas, se agregaron 105 células de Candida a los pocillos de la placa de microtitulación de 96 pocillos en el momento 0, según el diseño (Figura 2A). Después de 24 h, se lavó la placa y se agregaron muestras de suero a las biopelículas preformadas. Se seleccionó una dilución sérica común de 1:50 para comparar diferentes muestras de suero obtenidas de diferentes grupos de ratones inmunizados con Sap2 e inmunizados con simulacro según un estudio piloto y un informe publicado previamente30.

Se agregaron diferentes muestras de suero a la placa de microtitulación de 96 pocillos según el diseño (Figura 2B) y se evaluaron por duplicado. Los sueros obtenidos en el día 30 después de la inmunización de tres ratones por grupo (inmunizados con Sap2-albicans, inmunizados con Sap2-tropicalis, inmunizados con Sap2-parapsilosis, grupo inmunizado con simulacro, ratones preinmunes y muestra de control con agotamiento de Sap2) se analizaron con una dilución de 1:50. La placa se leyó a una longitud de onda de 490 nm utilizando un lector ELISA para obtener lecturas colorimétricas XTT (valores OD490 ) para biopelículas de C. tropicalis formadas en presencia o ausencia de suero (Tabla 1). El blanco negativo se calculó utilizando el promedio de las columnas 11 y 12 (0,04). El control positivo se calculó calculando un promedio de pozos solo de hongos (columna 10; 0.8165). Antes de los cálculos, el valor medio de absorbancia de los pozos de control en las columnas 11 y 12 (0,04) se restó de las mediciones de absorbancia de los pozos experimentales. Por lo tanto, el valor de referencia del control positivo de biofilm (columna 10) se estableció en 0,7765 (= 0,8165 − 0,04).

Los valores (promedio menos blanco) obtenidos para los pozos experimentales se dividieron por este control positivo (0,7765) y el porcentaje se obtuvo multiplicando por 100. El porcentaje de inhibición del biofilm se calculó restando aún más el valor obtenido de 100. Un gráfico de barras muestra todos los valores trazados (Figura 3). Se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples para calcular los valores de p para evaluar las diferencias estadísticas entre los diferentes grupos séricos. Un valor de p de <0,05 fue considerado estadísticamente significativo. El suero de ratones inmunizados con Sap2-parapsilosis podría prevenir la maduración de las biopelículas preformadas de C. tropicalis en un 65%, en comparación con el suero de ratones inmunizados con Sap2-albicans (45%) y Sap2-tropicalis (55%). En general, la inhibición de la biopelícula por el suero inmune a Sap2 fue significativamente mayor que la del suero inmune simulado (16%) y el suero preinmune (13%), respectivamente. Al agotar los anticuerpos específicos de Sap2 del suero como se describe en otra parte 19, la capacidad de inhibición de la biopelícula se redujo al10%. La inhibición del biofilm fue casi insignificante en el uso de PBS (5%) y control sin suero (5%).

Figure 1
Figura 1: Imagen del biofilm de Candida tropicalis . (A) Visualización de la biopelícula de Candida tropicalis formada en la parte inferior de una placa de microtitulación de 96 pocillos después de la eliminación del medio RPMI, utilizando un microscopio invertido. La imagen fue capturada usando microscopía de campo claro (no se utilizó tinción). (B) Visualización de la biopelícula de C. tropicalis formada en el fondo de una placa de microtitulación de 96 pocillos después de la tinción de violeta cristalina. (C) Visualización de biopelícula de C. tropicalis formada en portaobjetos de vidrio utilizando microscopía electrónica de barrido. Barras de escala = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Diseño del formato de placa de 96 pocillos. Adición de (A) células fúngicas a los pocillos y (B) diluciones séricas de diferentes grupos de ratones (Sap2-albicans inmunizado, Sap2-tropicalis inmunizado, Sap2-parapsilosis inmunizado e inmunizado simulado; n = 3) evaluado por duplicado en una dilución 1:50. Los controles adicionales incluyeron suero sin apreviento, suero preinmune, PBS y control sin suero. A la columna 10 no se le añadió suero (presencia de células fúngicas, control positivo). La columna 11 no tenía células fúngicas añadidas (suero presente). La columna 12 no tenía células fúngicas añadidas (suero ausente). Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; Sap2 = proteinasa aspartil secretada 2. Los términos m1, m2 y m3 se refieren a diferentes ratones en cada grupo (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Gráfico que muestra la efectividad de los anticuerpos policlonales específicos de Sap2 contra biopelículas preformadas de C. tropicalis. La fuente de suero inmune se muestra en el eje x, mientras que el porcentaje de inhibición de la maduración de la biopelícula de C. tropicalis se muestra en el eje y. Las barras representan la media ± SEM (n = 3). Para calcular los valores de p se utilizó un ANOVA unidireccional ordinario seguido de la prueba post hoc de Dunnett para comparaciones múltiples. Las barras y los símbolos representan las diferencias entre los grupos de ratones inmunizados con Sap2 con ratones inmunizados simulados. , p < 0,0001. Abreviaturas: PBS = solución salina tamponada con fosfato; Sap2 = proteinasa aspartil secretada 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Un 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabla 1: Lecturas de absorbancia a 490 nm para la placa de microtitulación de 96 pocillos. Se utilizó un lector de placas estándar (Tecan) para obtener las lecturas de absorbancia y las lecturas se ajustaron al diseño descrito en la Figura 2. Los cálculos posteriores se realizaron utilizando estos datos.

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Discussion

Las infecciones fúngicas causadas por especies de Candida se asocian con altas tasas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. La creciente amenaza de infección fúngica invasiva requiere el manejo temprano de tales enfermedades potencialmente mortales. La mayoría de las infecciones por Candida involucran la formación de biofilms, que se adhieren a una variedad de dispositivos médicos y son responsables de la persistencia y recurrencia de infecciones fúngicas en entornos hospitalarios31. Los biofilms están compuestos de levadura o células hifales, y exhiben una resistencia considerable a la mayoría de los fármacos antifúngicos convencionales32. La resistencia antifúngica por biofilms de Candida ha sido atribuida a varios mecanismos, incluyendo disminución de la penetración antifúngica, presencia de matriz extracelular, sobreexpresión de bombas de eflujo de fármacos, composición alterada del esterol de la membrana celular, crecimiento lento y heterogeneidad espacial, activación de varias vías de señalización y presencia de células persistentes tolerantes a fármacos33,34. La inhibición de la adhesión de Candida y la formación de biopelículas son las estrategias más importantes para prevenir la infección por Candida.

Varios ensayos in vitro, como ensayos de viabilidad celular, ensayos de placa de microtitulación y ensayos de medición de peso seco, se han utilizado para estudiar la formación de biopelículas de Candida, que se basan en la evaluación específica del punto de tiempo de las biopelículas23. Se han desarrollado ensayos más avanzados, como ensayos basados en dispositivos microfluídicos, que pueden utilizarse para evaluar la formación de biopelículas en tiempo real35. Hasta ahora, la formación de biopelículas se ha estudiado utilizando ensayos in vitro, pero también es necesario comprender el proceso dinámico de formación de biopelículas en condiciones in vivo 36,37. Actualmente, la mayoría de los estudios de inhibición de biopelículas se aplican a C. albicans y hay pocos estudios disponibles para la erradicación de biopelículas de Candida no albicans. El espectro de infecciones por Candida ha cambiado gradualmente en las últimas décadas y las especies emergentes de Candida no albicans representan una alta carga de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Por lo tanto, existe una necesidad emergente para el desarrollo de nuevas estrategias para controlar la formación de biopelículas y el desarrollo de ensayos de inhibición de biopelículas centrados en especies de Candida no albicans. La inmunoterapia, particularmente los anticuerpos, tiene un gran potencial para inhibir la formación de biopelículas y puede ser utilizada para tratar la infección sistémica por Candida 38. Varios informes han demostrado el papel de los anticuerpos en la inhibición del biofilm en etapas más tempranas de la formación del biofilm. Se informó que los anticuerpos policlonales generados en respuesta a la proteína relacionada con el receptor 3 del complemento (CR3-RP, que tiene un papel potencial en la adhesión a hongos) inmunización en conejos redujeron la adhesión y la formación de biopelículas de C. albicans en células epiteliales bucales39. Además, las cepas de Candida, incluidos los aislados de catéteres, se preincubaron con el anticuerpo policlonal anti-CR3-RP y el anticuerpo monoclonal, OKM1, lo que redujo la adherencia y la formación de biopelículas. La viabilidad celular de C. albicans se evaluó mediante el ensayo XTT durante la fase de adherencia y la fase de formación de biofilm40. Pocos estudios han evaluado el papel de los anticuerpos contra la formación de biopelículas de especies de Candida no albicans. Chupacova et al. evaluaron la efectividad de anticuerpos policlonales anti-CR3-RP contra C. albicans junto con C. dubliniensis utilizando el ensayo XTT. Los anticuerpos policlonales anti-CR3-RP inhibieron la adherencia y la formación de biopelículas tanto de C. albicans como de C. dubliniensis41.

En este estudio, se describe un protocolo simple, rápido y fácil de usar para evaluar el efecto de los anticuerpos en la maduración y el desarrollo de la biopelícula. Este ensayo de reducción de XTT basado en placas de microtitulación de 96 pocillos mide la actividad metabólica de células viables en biopelículas y ha sido adaptado de estudios anteriores 7,8. El ensayo XTT descrito en este documento se utiliza ampliamente para estimar el crecimiento viable de biopelículas. Se ha convertido en una prueba de viabilidad celular de uso común porque es rápida, conveniente y se puede usar en formato de alto rendimiento, como una placa de 96 pocillos. Además, se puede utilizar para cuantificar tanto la levadura como las formas hifales de las biopelículas de Candida. También se puede utilizar para la medición de biopelículas de Candida en una variedad de sustratos, como dispositivos médicos (por ejemplo, catéteres) y lentes de contacto.

Algunos de los pasos críticos de este protocolo incluyen el vórtice vigoroso de las suspensiones celulares antes del pipeteo en todos los pasos, para evitar la agregación fúngica7. Es probable que se desarrollen biopelículas deficientes cuando las densidades celulares son demasiado altas o demasiado bajas. Por lo tanto, los usuarios deben seguir la densidad celular fúngica ideal en el inóculo inicial7. Los pasos de lavado son muy críticos y se debe evitar el lavado excesivo de las células para evitar la interrupción de la biopelícula22. La capa inferior de la biopelícula no debe alterarse durante el proceso de lavado. El ensayo siempre debe realizarse en condiciones de oscuridad, y es necesario incluir múltiples réplicas22. Se debe preparar una solución fresca de XTT cada vez justo antes de su uso. Como la diferencia de tiempo entre dos reacciones puede sesgar los resultados, los usuarios deben trabajar rápido para garantizar una diferencia de tiempo mínima al agregar la solución XTT al primer y último pocillo de la placa de96 pocillos 42. Se recomienda el uso de lámina o parafilm para evitar la evaporación. Se pueden llevar a cabo varios pasos de solución de problemas si es necesario. En caso de que el crecimiento del biofilm esté ausente o sea insatisfactorio, se debe utilizar una dilución y cálculos apropiados del inóculo de siembra. Para una mejor formación de biopelículas, se pueden cambiar las condiciones de subcultivo y se puede probar el crecimiento de la biopelícula utilizando diferentes materiales de superficie. Para mejorar significativamente la sensibilidad del ensayo XTT, se podría disminuir el tiempo necesario para que se forme la biopelícula, aumentar la concentración del agente antifúngico o acortar el período de incubación del ensayo7. Para evitar la interrupción del biofilm, se debe evitar el lavado celular excesivo22. Uno puede evitar los pozos externos para evitar que los agentes de ensayo se expongan a la luz o agregar líquido a los pozos externos para evitar que los agentes se evaporen de los pozos internos. Se deben administrar lavados suaves si la biopelícula se interrumpe durante el lavado22. Si bien este protocolo prueba el efecto del suero en biopelículas preformadas de 24 h para evaluar la inhibición de la maduración de la biopelícula, los usuarios también pueden modificar este protocolo para agregar suero en el momento 0 para evaluar la inhibición de la formación de biopelículas, según un informe anterior30.

En comparación con otros métodos alternativos para cuantificar el crecimiento de biopelículas, el método XTT es el método más sensible, reproducible, preciso, rentable y específico. Aunque el ensayo XTT es una técnica rápida y fácil de usar comúnmente para evaluar biopelículas, tiene ciertas limitaciones. Si bien es útil para determinar la dosis o los efectos de varios agentes en una biopelícula de una sola especie, debe usarse con precaución para comparar múltiples aislados simultáneamente debido a la variabilidad metabólica entre los aislados21. Para las comparaciones de biofilm entre cepas, se debe realizar una estandarización detallada de la técnica21. Además, mientras que el producto XTT formazan se disuelve fácilmente en solución, algunas cepas pueden retener cierta cantidad dentro de la célula21. Dado que existe una falta de claridad que involucra variables, como la elección del medio, el tiempo de desarrollo del biofilm y los detalles del suero, es aconsejable realizar bioensayos confirmatorios además del ensayo XTT, por ejemplo, la medición del espesor / biomasa del biofilm (utilizando cristal violeta) o la viabilidad celular (utilizando el método CFU)43. Cabe destacar que los resultados de este ensayo XTT se correlacionaron bien con el ensayo de violeta cristalina y el método CFU (datos no mostrados). A pesar de las limitaciones mencionadas anteriormente, este método puede extrapolarse para evaluar diferentes grupos de muestras de suero (fuente de anticuerpos policlonales), anticuerpos monoclonales o inmunoterapias adyuvantes. Aunque el protocolo de reducción de XTT presentado aquí solo muestra el efecto de los anticuerpos sobre las biopelículas de C. tropicalis, también ha sido utilizado por los investigadores para estudiar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas de C. auris 18. Además, este protocolo deriva de estudios previos realizados con otras especies de Candida como C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis y C. auris, que pueden merecer la extensión de este protocolo al género Candida16,41,44,45,46,47.

La optimización, estandarización y mejora regular en los ensayos de cuantificación de biopelículas pueden mejorar la precisión, el rendimiento y la reproducibilidad. El ensayo de reducción XTT en el que se basa este protocolo ha sido ampliamente utilizado para la evaluación de la actividad metabólica y la viabilidad de las biopelículas. Dado que el biofilm de Candida es a menudo resistente a los medicamentos antifúngicos, la exploración de nuevos fármacos y nuevas combinaciones es una necesidad urgente33. Para combatir el problema de las infecciones asociadas al biofilm, se deben explorar más compuestos antibiofilm utilizando ensayos de cribado de biofilm48. Este protocolo in vitro se puede utilizar para comprobar el efecto de posibles nuevos compuestos antifúngicos sobre la actividad metabólica de las células de especies de Candida en biopelículas. La investigación futura basada en la estandarización y la mejora del ensayo de reducción de XTT que involucra inmunoterapias basadas en anticuerpos puede ayudar en el desarrollo de terapias mejoradas para el manejo y control efectivos de la enfermedad.

La inhibición de la biopelícula por anticuerpos específicos de Sap2 se ha reportado como un mecanismo de protección mediado por anticuerpos en la protección mediada por la vacuna Sap2 durante la candidiasis sistémica murina causada por C. tropicalis19. Un estudio anterior también mostró que CAGTA potencialmente reconociendo antígenos de savia reduce el crecimiento y la formación de biopelículas de C. albicans in vitro16. En otro estudio, los mutantes eliminados de Sap2 exhibieron un defecto de crecimiento de biopelícula en presencia de pepstatina A49. Además, durante la formación del biofilm, el antígeno Sap2 desempeñó un papel en el procesamiento proteolítico de la mucina Msb2 mediada a través de la vía de señalización50 de la proteína quinasa activada por mitógenos Cek1. Por lo tanto, se puede especular que el procesamiento de Msb2 es inhibido por la neutralización de Sap2 mediada por anticuerpos, lo que afecta la integridad de la biopelícula. En resumen, este artículo proporciona un protocolo detallado para evaluar el papel de los anticuerpos séricos en la maduración y el desarrollo del biofilm de C. tropicalis , que se puede aplicar para la determinación de la actividad metabólica del biofilm en diferentes entornos, utilizando diferentes cepas fúngicas o fuentes de anticuerpos.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la subvención Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departamento de Biotecnología, Gobierno de la India) y el Premio de Investigación de Carrera Temprana SER-1058-BIO (Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería, Gobierno de la India) a S.R. Los autores reconocen una subvención ICMR-JRF a P.C y una subvención DBT-JRF a P.S. Los autores agradecen al Dr. Ravikant Ranjan por las sugerencias sobre el manuscrito y la asistencia técnica del Sr. Pradeep Singh Thakur durante SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

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Inmunología e infección Número 187
Un ensayo de reducción soluble a base de tetrazolio para evaluar el efecto de los anticuerpos en las biopelículas <em>de Candida tropicalis</em>
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Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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