Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Abstract

Candida türleri sistemik hastane enfeksiyonlarının dördüncü en yaygın nedenidir. Sistemik veya invaziv kandidiyazis sıklıkla implante edilen cihazlarda veya kateterlerde biyofilm oluşumunu içerir ve bu da artmış virülans ve mortalite ile ilişkilidir. Farklı Candida türleri tarafından üretilen biyofilmler, çeşitli antifungal ilaçlara karşı gelişmiş direnç gösterir. Bu nedenle, Candida biyofilmlerine karşı etkili immünoterapiler veya yardımcı tedaviler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Hücresel bağışıklığın rolü anti-Candida korumasında iyi kurulmuş olsa da, humoral bağışıklığın rolü daha az çalışılmıştır.

Biyofilm oluşumunun ve olgunlaşmasının inhibisyonunun koruyucu antikorların ana işlevlerinden biri olduğu ve Candida albicans germ tüpü antikorlarının (CAGTA) daha önce C. albicans'ın in vitro büyümesini ve biyofilm oluşumunu baskıladığı gösterilmiştir. Bu yazıda, antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki rolünü değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Bu protokolün metodolojisi, 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında C. tropicalis biyofilm oluşumunu içerir, bunlar daha sonra antijene özgü antikorların varlığında veya yokluğunda inkübe edilir, ardından biyofilmdeki mantar hücrelerinin metabolik aktivitesini ölçmek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanilid-2H-tetrazolyum (XTT) testi yapılır.

Özgüllük, Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serum da dahil olmak üzere uygun serum kontrolleri kullanılarak doğrulandı. Sonuçlar, bağışıklanmış hayvanların serumunda bulunan antikorların in vitro Candida biyofilm olgunlaşmasını inhibe edebileceğini göstermektedir. Özetle, bu yazıda invaziv kandidiyazis sırasında biyofilmlere karşı yeni immünoterapiler ve sinerjik veya yardımcı tedaviler geliştirmede antikorların potansiyeli hakkında önemli bilgiler verilmektedir. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Introduction

Sistemik kandidiyazis, tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkili olan hastane enfeksiyonlarının dördüncü majör nedenidir. Küresel olarak, sistemik kandidiyaz yaklaşık 700.000 kişiyi etkilemektedir1. Candida türleri, yani C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata ve C. auris, invaziv Candida enfeksiyonlarının en yaygın nedenidir2. Candida türleri, biyofilm üreten fırsatçı patojenlerdir3. Biyofilmler ağırlıklı olarak Candida virülansı ile ilişkilidir ve Candida, biyofilm oluşumunu indükleyerek oksidatif ve ozmotik stres koşullarına dayanabilir4. Biyofilmler ayrıca virülans faktörlerinin ve hücre duvarı bileşenlerinin ekspresyonunu modüle eder ve Candida'nın farklı konakçı nişlerine uyum sağlamasına yardımcı olan ekzopolimerik koruyucu bir matris oluşturur4. Biyofilmler konakçı dokularda ve tıbbi aletlerde maya yapışmasına katkıda bulunur5. Bu nedenle, biyofilm oluşumu mayalara bir avantaj ile ilişkilidir, çünkü biyofilmlerdeki maya hücreleri konakçı bağışıklık tepkisinden kaçabilir6. Biyofilm oluşumu ayrıca patojenik mayaları antifungal ilaçların etkisinden korur5. C. albicans biyofilmlerinin amfoterisin B'ye duyarlılığının azalması Pierce ve ark.7,8 tarafından gösterilmiştir. Ayrıca, biyofilmler flukonazole karşı antifungal ilaç direnci gösterir ve bu da sistemik kandidiyazisin etkin yönetimini bozar 9,10.

Mikroplar, çeşitli biyotik ve abiyotik yüzeylere yapışma konusunda içsel bir eğilime sahiptir ve bu da biyofilm oluşumuna neden olur. Dimorfik bir mantar olan Candida albicans, maya ve hifal formlarında bulunur ve biyofilm oluşumu çeşitli in vitro ve in vivo model sistemlerde karakterize edilmiştir11. Biyofilm oluşumunun aşamaları, Candida hücrelerinin substrata yapışmasını, filamentasyonu, proliferasyonu ve biyofilm olgunlaşmasını içerir11. Başlangıçta, C. albicans'ın maya formu, tıbbi cihazlar ve insan dokusu da dahil olmak üzere substratlara yapışır, bunu C. albicans'ın hifal ve psödohifal formlara filamentasyonu ve çoğalması ve son olarak hücre dışı matris11'e gömülü biyofilmlerin olgunlaşması izler. Biyofilm oluşumu C. albicans patogenez mekanizmalarına büyük ölçüde katkıda bulunur12. Candida türleri ilaca dirençli biyofilmler oluşturur ve bu da eradikasyonlarını zorlaştırır13. C. albicans biyofilm üreten popülasyonun küçük bir alt kümesi, antifungal ilaçlar amfoterisin B ve klorheksidin14'e karşı oldukça dirençli olarak tanımlanmıştır. Biyofilmlerdeki maya hücreleri, planktonik faz ve proliferasyon fazı14'teki maya hücrelerine kıyasla çoklu ilaç tedavisine karşı yüksek direnç gösterir. Biyofilmlerde bulunan maya hücrelerinin, biyofilmlerde C. albicans'ın hayatta kalmasına katkıda bulunan antifungal ilaçlara karşı oldukça toleranslı olduğu öne sürülmüştür14. Bu mevcut hücrelerin mutantlar değil C. albicans'ın fenotipik varyantları olduğu bildirilmiştir14. Ayrıca, "kalıcı hücreler" olarak bilinen Candida biyofilmlerinin hücreleri, yüksek dozlarda amfoterisin-B tedavisine toleranslıdır ve Candida'nın hayatta kalmasına katkıda bulunur, böylece yüksek riskli bireylerde tekrarlayan sistemik Candida enfeksiyonlarının büyük bir yükünü oluşturur15.

Candida suşlarında antifungal ilaç direncindeki artış, yeni antifungal ajanlar ve immünoterapiler için araştırma yapılmasını gerektirmektedir. Yukarıda belirtilen çalışmalardan da anlaşılacağı gibi, Candida biyofilmleri antifungal ilaçlara duyarlılığın azaldığını göstermektedir. Bu nedenle, Candida biyofilm oluşumunu kontrol etmek için geliştirilmiş immünoterapilere ihtiyaç vardır. Daha önceki çalışmalar, CAGTA'nın in vitro16 C. albicans biyofilm oluşumunu inhibe ederek sistemik Candida enfeksiyonlarına karşı etkili koruma sağlayabileceğini göstermiştir. Başka bir çalışma, farelerin C. albicans rAls3-N proteini ile bağışıklanmasının, in vitro17 C. albicans biyofilm oluşumuna müdahale eden yüksek antikor titrelerini indüklediğini bildirmiştir. Anti-Als3-N antikorları ayrıca biyofilmlerden C. albicans dispersiyonu üzerinde inhibitör bir etki göstermiştir17. C. albicans'a dayanan NDV-3A aşısı şu anda klinik deneme aşamasındadır ve anti-NDV-3A serumlarının da C. auris biyofilm oluşumunu azalttığı bulunmuştur18. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, sistemik kandidiyazis19'un murin modelinde bir koruma mekanizması olarak Sap2-antikorları tarafından biyofilm oluşumunun inhibisyonu tanımlanmıştır.

Bu yazıda, farklı Sap2 aşılı fare gruplarından elde edilen poliklonal serumda bulunan antijene özgü antikorların önceden oluşturulmuş Candida tropicalis biyofilmleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için ayrıntılı bir in vitro protokol özetlenmiştir. Bunu başarmak için, laboratuvarda, antikorların varlığında veya yokluğunda biyofilm canlılığını hızlı, hassas ve yüksek verimli bir şekilde ölçebilen bir XTT indirgeme testine dayanan bir yöntem optimize edilmiş ve geliştirilmiştir.

XTT testi, hücre canlılığının, hücresel proliferasyonun ve sitotoksisitenin bir göstergesi olarak hücresel metabolik aktiviteyi ölçmek için kullanılır20. Bu kolorimetrik tahlil, sarı bir tetrazolyum tuzunun, sodyum 3'-[1-(fenilaminokarbonil)-3,4-tetrazolium]-bis (4-metoksi-6-nitro) benzen sülfonik asit hidratının (XTT) metabolik olarak aktif hücreler tarafından turuncu bir formazan boyasına indirgenmesine dayanmaktadır. Sadece canlı hücreler XTT'yi azaltabildiğinden, indirgenmiş XTT formazan miktarı, rengin yoğunluğu ve hücre canlılığı ile orantılıdır. Oluşan formazan boya suda çözünür ve bir plaka okuyucu kullanılarak doğrudan ölçülür. Suda çözünür doğası nedeniyle, XTT testi, biyofilm yapısının bozulmasından bozulmamış biyofilmlerin incelenmesine ve biyofilm ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verir21. Ek olarak, bu yöntem kullanım kolaylığı, hızı, doğruluğu, yüksek verimi ve yüksek derecede tekrarlanabilirliği nedeniyle Candida mantar canlılığı değerlendirmelerinde uygulanır 7,22.

XTT indirgeme testine ek olarak, biyofilm miktarının ölçümü için çok sayıda alternatif teknik de tanımlanmıştır. Bunlardan bazıları MTT indirgeme testi, kristal menekşe boyama, DNA nicelleştirme, kantitatif PCR, protein miktarı, kuru hücre ağırlığı ölçümü ve canlı koloni sayımının kullanımını içerir. Bu prosedürler zaman ve maliyet gereksinimleri açısından büyük farklılıklar gösterir. Taff ve ark. yedi farklı Candida biyofilm kantitasyon testinin karşılaştırmalı bir analizini gerçekleştirdiler ve XTT testinin C. albicans biyofilmleri23'ün nicel tahmini için en tekrarlanabilir, doğru ve verimli yöntemi sağladığını buldular. Kristal menekşe gibi boyama tekniklerinin belirli sınırlamaları vardır; kristal menekşe testi, kristal menekşe boyalı biyofilm matrisinin ve hücrelerinin optik yoğunluğunu ölçerek dolaylı olarak biyofilm miktarını belirler. Kristal menekşe tahlili iyi bir biyofilm kütlesi ölçüsü sağlasa da, hem mikrobiyal hücreleri hem de hücre dışı matris24'ü boyadığı için biyofilm canlılığının bir ölçüsünü vermez. Dhale ve ark. ayrıca, XTT indirgeme testinin, kristal menekşe testi25'e kıyasla biyofilm üretimini tespit etmek için en hassas, tekrarlanabilir, doğru, verimli ve spesifik yöntem olduğunu bildirmiştir. Literatür raporları, XTT testinin CFU sayma yöntemindeki CFU / mL parametresi ile iyi ilişkili olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, XTT testi ile karşılaştırıldığında, CFU yöntemi emek yoğun ve yavaş26'dır. Ayrıca, ayrılmış canlı hücrelerin fraksiyonu, başlangıçtaki biyofilm popülasyonu27'yi temsil etmeyebilir. XTT indirgeme testi, uygulanabilirliği ölçmek için mevcut en iyi seçenek gibi görünse de, bu tekniğin birkaç sınırlaması vardır. XTT yöntemi, bir mantar suşunu içeren karşılaştırmalar için yararlı olsa da, farklı mantar suşlarını ve türlerini karşılaştırırken kullanımı sınırlı olabilir. Ayrıntılı standardizasyonun yokluğunda interstrain karşılaştırmaları zor olabilir, çünkü farklı suşlar farklı yeteneklere sahip substratları metabolize eder21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BALB / c fareleri, IIT Roorkee'deki Küçük Hayvan Tesisi'nde barındırıldı. Tüm hayvanlar 25 ° C'de 12 saat: 12 saat aydınlık: karanlık döngüde tutuldu ve bir pelet diyeti ve su ad libitum ile sağlandı. Tüm hayvan prosedürleri, IIT Roorkee'nin Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC) tarafından onaylanmıştır.

1. C. tropicalis'in hazırlanması

NOT: Candida tropicalis mantarı Risk Grubu 2 patojenlerine aittir ve BSL2 mikroorganizması olarak sınıflandırılır. Candida türleriyle çalışırken her zaman sertifikalı Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinleri kullanın. C. tropicalis ile çalışma sırasında aseptik ve steril teknikler uygulayın ve bu patojenin uygun şekilde bertaraf edilmesi için önerilen biyogüvenlik prosedürlerini izleyin.

  1. Streak C. tropicalis (ATCC 750 suşu) bir Sabouraud dekstroz (SAB) agar plakası üzerine.
  2. SAB agar plakasından tek bir koloniyi, 10 mL SAB et suyu ortamı içeren steril 50 mL konik bir tüpe aşılayarak bir gecede yetiştirilen C. tropicalis kültürünü hazırlayın. Alternatif olarak, dondurulmuş bir C. tropicalis gliserol stoğu kullanın ve gliserol stoğunun 100 μL'sini, 50 mL SAB et suyu ortamı içeren steril bir 250 mL konik şişeye aşılayın.
  3. C. tropicalis kültürünü 24-48 saat boyunca 30 ° C'de 180 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin.
  4. Mantar kültürünü (logaritmik fazdaki hücreler) 21 ° C'de 15 dakika boyunca 2.150 × g'de santrifüj yapın.
  5. Süpernatantı atın ve pelete 50 mL steril 1x PBS ekleyin. Peleti steril 1x PBS'de nazik girdapla yıkayın ve tekrar askıya alın.
  6. 21 ° C'de 15 dakika boyunca 2.150 × g'da tekrar santrifüj. Süpernatantı atın ve mantar peletini 10 mL steril 1x PBS içinde yeniden askıya alın.
  7. Bir hemositometre ile sayarak hücrelerin konsantrasyonunu hesaplayın.
  8. RPMI 1640 morfolinpropansülfonik asit (MOPS) ortamında 1.0 × 106 hücre/ mL son yoğunlukta mantar stokları hazırlayın. Adım 1.6'daki hücre süspansiyonunu hemen kullanın.
    NOT: 96 delikli bir plaka kurmak için, gereken toplam mantar stok hacmi 10 mL'dir (100 μL/kuyu). Gerektiği gibi ölçeklendirin.

2. C. tropicalis biyofilm oluşumu

  1. Candida biyofilmlerini daha önce açıklandığı gibi 96 kuyucuklu düz tabanlı polistiren mikrotitre plakasında hazırlayın (Şekil 1)28,29.
  2. Çok kanallı pipet kullanarak96 delikli bir mikrotitre plakasına 100 μL C. tropicalis kültürü (yukarıda olduğu gibi hazırlanmış 10 6 hücre/mL stoktan) ekleyin (Şekil 2A). Son iki sütunu (11 ve 12) mantar hücreleri eklemeyerek 'mantar artı serum' ve 'mantar yok ve serum yok' negatif kontrolleri olarak tutun. 11 ve 12 numaralı sütunları yalnızca 100 μL RPMI 1640 MOPS ortamıyla doldurun.
  3. Mikrotitre plakasını bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Sabit koşullar altında plakayı 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.
  4. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak ortamı dikkatlice aspire edin (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan). Artık ortamları çıkarmak için plakaya leke tabakaları üzerinde ters konumda hafifçe dokunun.
  5. Plakayı çok kanallı pipet kullanarak 200 μL 1x PBS (kuyucuk başına) ile yıkayın. Biyofilmleri bozmamak için kuyunun yan duvarları boyunca PBS'yi çok nazikçe ekleyin. PBS'yi çok kanallı pipet kullanarak dikkatlice aspire edin. PBS yıkamasını 2 kat tekrarlayın (toplam üç yıkama).
  6. Fazla PBS'yi çıkarmak için, plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında, biyolojik bir güvenlik dolabı içinde 30 dakika boyunca havayla kurulayın.

3. Biyofilmin antikorlarla tedavisi

NOT: Biyofilmler artık antikorlar tarafından biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonunu değerlendirmek için işlenebilir. Murin serumu poliklonal antikorların kaynağı olarak kullanıldı. Farklı Sap2-bağışıklanmış gruplar (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis ve Sap2-parapsilaz), sahte bağışıklanmış farelerle birlikte retro-orbital olarak kanadı ve serum daha önce tarif edildiği gibi izole edildi19. Anti-Sap2 antikorlarının varlığı, daha önce tarif edildiği gibi Sap2-spesifik ELISA kullanılarak doğrulandı19.

  1. İnhibitör aktivitede komplemanın rolünü dışlamak için kullanmadan önce 30 dakika boyunca 56 ° C'de serumun (poliklonal antikorların kaynağı) ısı inaktivasyonunu gerçekleştirin. Serum seyreltme yapmadan önce serumu ısıl olarak inaktive edin.
    NOT: Ek kontroller olarak sahte bağışıklanmış farelerden, preimmün farelerden ve Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serumdan serum kullanın19. Antikor tükenmiş serum önceki bir çalışmaya göre hazırlandı19. Bu protokolde test edilen serum için seri seyreltmeler arasında (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 ve 1:12,800) biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu 1:25, 1:50 ve 1:100'de gözlenmiştir; Bu nedenle, inhibisyon ve serum tüketimi arasında bir denge kurmak için 1:50 seçildi.
  2. Isı ile inaktive edilmiş serum örneklerinin seri seyreltilerini steril RPMI 1640 MOPS ortamında hazırlayın (1:50). Biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonu için test edilecek tüm serum örnekleri için ortak bir serum seyreltmesi (1:50) kullanın 30.
  3. Seçilen serum seyreltmesinin 100 μL'sini 96 delikli mikrotitre plakasının her bir oluğuna ekleyin. Her numune için, ekli düzene göre serum seyreltilerini çift olarak ekleyin (Şekil 2B).
    1. 10. sütunda, serum seyreltmesi eklemeyin; sadece mantar pozitif kontrolü için sadece RPMI 1640 MOPS ortamı ekleyin.
      NOT: Sütun 10, G1-G8 ve H1-H8 satırları başlangıçta RPMI-MOPS'ta mantar hücrelerine sahipti. Bununla birlikte, RPMI-MOPS, 24 saat sonra bile sütun 10'a eklenirken, G1-G8 sıraları PBS kontrolü ve H1-H8 sıraları 24 saat sonra serumsuz kontrol olarak görev yaptı.
    2. 11. sütunda, mantarsız artı serum negatif kontrolü olarak hizmet etmek için tüm kuyucuklara 1:50 serum seyreltmesi ekleyin.
    3. Sütun 12'de, herhangi bir kuyucuğa serum seyreltmesi eklemeyin; bunu mantar yok serum negatif kontrolü yok olarak tutun.
  4. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

4. Biyofilm metabolik aktivite tahmini

  1. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak serumu dikkatlice aspire edin (biyofilmlere dokunmadan veya bozmadan). Artık serumu çıkarmak için plakaya leke tabakaları üzerinde ters yönde hafifçe dokunun.
  2. Çok kanallı pipet kullanarak plakayı 200 μL 1x PBS (kuyu başına) ile yıkayın ve biyofilmlerin bozulmasını önlemek için PBS'yi kuyunun yan duvarları boyunca ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak PBS'yi dikkatlice aspire edin ve PBS yıkamayı 2 kat tekrarlayın (toplam üç yıkama). Fazla PBS'yi kurutmak için plakayı (kapaksız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca, biyolojik bir güvenlik kabini içinde hava ile kurulayın.
  3. XTT/menadionun hazırlanması:
    1. XTT'yi steril Ringers Laktat'ta 0,5 g/L çözelti olarak hazırlayın. 25 mg XTT'yi 50 mL filtre sterilize edilmiş Ringers Laktat içinde çözün. Aliquot 10 mL, alüminyum folyo ile kaplı ayrı tüplerde ve -80 ° C'de saklayın.
    2. Menadion'u 10 mM'lik bir stok olarak hazırlayın. 8.6 mg menadionu 5 mL aseton içinde çözün ve 100 ayrı mikrotüp içinde 50 μL dağıtın. Alikotları -80 °C'de saklayın.
    3. 10 mL XTT alarak ve 1 μM çalışma çözeltisi elde etmek için 1 μL menadion ekleyerek kullanımdan hemen önce XTT/menadion çözeltisi hazırlayın.
  4. 96 delikli mikrotitre plakasının kuyucuğu başına 100 μL XTT/menadion çözeltisi ekleyin. Plakayı bir kapak ve alüminyum folyo ile örtün. Plakayı karanlıkta 37 ° C'de 2 saat boyunca inkübe edin.
  5. Her bir kuyucuktan 80 μL renkli süpernatantı taze bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Plakayı 490 nm'de okuyun.
  6. Sütun 10'daki kuyucukların absorbans değerlerinin ortalamasını hesaplayın (yalnızca mantar pozitif kontrolü), bu da denklem (1) kullanarak her serum numunesi tarafından biyofilm inhibisyon yüzdesini hesaplamak için bir referans değeri görevi görecektir.
    % Biyofilm inhibisyonu = 100 - Equation 1× 100 (1)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Candida tropicalis biyofilmleri 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda yetiştirildi ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te görüntülendi (Şekil 1A). Biyofilm kristal menekşe kullanılarak daha da boyandı ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te gözlendi (Şekil 1B). Taramalı elektron mikroskobu, C. tropicalis biyofilminin temsili bir görüntüsünü göstermektedir (Şekil 1C). Biyofilm inhibisyon testinin yapılması için, düzene göre 0 zamanında 96 delikli mikrotiter plakasının kuyularına 105 Candida hücresi eklenmiştir (Şekil 2A). 24 saat sonra, plaka yıkandı ve önceden oluşturulmuş biyofilmlere serum örnekleri eklendi. Bir pilot çalışmaya ve daha önce yayınlanmış bir rapor 30'a göre, farklı Sap2 bağışıklanmış ve sahte bağışıklanmış fare gruplarından elde edilen farklı serum örneklerini karşılaştırmak için 1:50'lik ortak bir serum seyreltmesi seçildi.

96 delikli mikrotiter plakasına düzene göre farklı serum örnekleri eklenmiş (Şekil 2B) ve çift olarak değerlendirilmiştir. Grup başına üç fareden (Sap2-albicans bağışıklanmış, Sap2-tropikalis bağışıklanmış, Sap2-parapsilosis bağışıklanmış, sahte bağışıklanmış grup, preimmün fareler ve Sap2-tükenmiş kontrol örneği) 30. günde immünizasyon sonrası elde edilen sera, 1:50 seyreltmede analiz edildi. Plaka, serum varlığında veya yokluğunda oluşan C. tropicalis biyofilmleri için XTT-kolorimetrik okumalar (OD 490 değerleri) elde etmek için bir ELISA okuyucu kullanılarak490 nm dalga boyunda okundu (Tablo 1). Negatif boşluk, 11 ve 12 numaralı sütunların ortalaması kullanılarak hesaplanmıştır (0,04). Pozitif kontrol, sadece mantar içeren kuyucukların ortalaması hesaplanarak hesaplandı (sütun 10; 0.8165). Hesaplamalardan önce, 11 ve 12 numaralı sütunlardaki (0.04) kontrol kuyularının ortalama absorbans değeri, deney kuyularının absorbans ölçümlerinden çıkarılmıştır. Böylece, biyofilm pozitif kontrolünün (sütun 10) referans değeri 0.7765 (= 0.8165 − 0.04) olarak ayarlandı.

Deney kuyuları için elde edilen değerler (ortalama eksi boş) daha sonra bu pozitif kontrole (0.7765) bölündü ve yüzde 100 ile çarpılarak elde edildi. Biyofilm inhibisyonu yüzdesi, 100'den elde edilen değerin daha da çıkarılmasıyla hesaplandı. Bir çubuk grafik, çizilen tüm değerleri gösterir (Şekil 3). Farklı serum grupları arasındaki istatistiksel farklılıkları değerlendirmek için p değerlerini hesaplamak için Dunnett'in çoklu karşılaştırmalar için post hoc testi takip eden sıradan tek yönlü ANOVA kullanıldı. <0.05 p değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Sap2-parapsilosis bağışıklanmış farelerden elde edilen serum, önceden oluşturulmuş C. tropicalis biyofilmlerinin olgunlaşmasını, Sap2-albicans (% 45) ve Sap2-tropicalis (% 55) bağışıklanmış farelerden elde edilen seruma kıyasla% 65 oranında önleyebilir. Genel olarak, Sap2-immün serum ile biyofilm inhibisyonu, sırasıyla sahte immün serum (% 16) ve preimmün serumdan (% 13) anlamlı derecede yüksekti. Başka bir yerde19'da açıklandığı gibi serumdan Sap2'ye özgü antikorların tükenmesi üzerine, biyofilm inhibisyon yeteneği% 10'a düşürüldü. Biyofilm inhibisyonu PBS (%5) ve no-serum kontrolü (%5) kullanıldığında ihmal edilebilir düzeydeydi.

Figure 1
Resim 1: Candida tropicalis biyofilminin görüntülenmesi. (A) RPMI ortamının çıkarılmasından sonra 96 delikli bir mikrotitre plakasının dibinde oluşan Candida tropicalis biyofilminin ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak görselleştirilmesi. Görüntü parlak alan mikroskobu kullanılarak yakalandı (leke kullanılmadı). (B) Kristal mor boyama işleminden sonra 96 delikli bir mikrotitre plakasının dibinde oluşan C. tropicalis biyofilminin görselleştirilmesi. (C) Cam slaytlarda oluşturulan C. tropicalis biyofilminin taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesi. Ölçek çubukları = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: 96 delikli plaka formatının düzeni. Kuyucuklara (A) mantar hücrelerinin eklenmesi ve (B) farklı fare gruplarından serum seyreltmeleri (Sap2-albicans bağışıklanmış, Sap2-tropikalis bağışıklanmış, Sap2-parapsilosis bağışıklanmış ve sahte bağışıklanmış; n = 3) 1:50 seyreltmede çift olarak değerlendirilmiştir. Ek kontroller arasında Sap2 tükenmiş serum, preimmün serum, PBS ve no-serum kontrolü vardı. Sütun 10'a serum eklenmedi (mantar hücreleri mevcut, pozitif kontrol). Sütun 11'e mantar hücresi eklenmedi (serum mevcut). Sütun 12'ye mantar hücresi eklenmedi (serum yok). Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; Sap2 = salgılanan aspartil proteinaz 2. M1, m2 ve m3 terimleri, her gruptaki farklı fareleri ifade eder (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Sap2-spesifik poliklonal antikorların önceden oluşturulmuş C. tropicalis biyofilmlerine karşı etkinliğini gösteren grafik. İmmün serum kaynağı x ekseninde gösterilirken, C. tropicalis biyofilm olgunlaşmasının inhibisyon yüzdesi y ekseninde gösterilir. Çubuklar ortalama ± SEM'i temsil eder (n = 3). P değerlerini hesaplamak için sıradan tek yönlü ANOVA ve ardından Dunnett'in çoklu karşılaştırmalar için post hoc testi kullanıldı. Çubuklar ve semboller, sahte bağışıklanmış farelere sahip Sap2 bağışıklanmış fare grupları arasındaki farkları temsil eder. , p 0.0001 <. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; Sap2 = salgılanan aspartil proteinaz 2. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tablo 1: 96 kuyucuklu mikrotitre plakası için 490 nm'de absorbans okumaları. Absorbans okumalarını elde etmek için standart bir plaka okuyucu (Tecan) kullanılmış ve okumalar Şekil 2'de açıklanan düzene eşleştirilmiştir. Bu veriler kullanılarak sonraki hesaplamalar yapıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Candida türlerinin neden olduğu mantar enfeksiyonları tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkilidir. İnvaziv mantar enfeksiyonunun artan tehdidi, hayatı tehdit eden bu tür hastalıkların erken yönetimini gerektirir. Çoğu Candida enfeksiyonu, çeşitli tıbbi cihazlara yapışan ve hastane ortamlarında mantar enfeksiyonlarının kalıcılığından ve nüksünden sorumlu olan biyofilmlerin oluşumunu içerir31. Biyofilmler maya veya hifal hücrelerinden oluşur ve geleneksel antifungal ilaçların çoğuna karşı önemli direnç gösterirler32. Candida biyofilmleri tarafından antifungal direnç, azalmış antifungal penetrasyon, hücre dışı matriks varlığı, ilaç-efflux pompalarının aşırı ekspresyonu, değiştirilmiş hücre zarı sterol bileşimi, yavaş büyüme ve mekansal heterojenlik, çeşitli sinyal yollarının aktivasyonu ve ilaca toleranslı persister hücrelerin varlığı gibi çeşitli mekanizmalara atfedilmiştir33,34. Candida adezyonu ve biyofilm oluşumunun inhibisyonu Candida enfeksiyonunu önlemek için en önemli stratejilerdir.

Hücre canlılığı testleri, mikrotitre plaka testleri ve kuru ağırlık ölçüm testleri gibi çeşitli in vitro testler, biyofilmlerin spesifik zaman noktası değerlendirmesine dayanan Candida biyofilm oluşumunu incelemek için kullanılmıştır23. Gerçek zamanlı biyofilm oluşumunu değerlendirmek için kullanılabilecek mikroakışkan cihaz tabanlı testler gibi daha gelişmiş testler geliştirilmiştir35. Şimdiye kadar, biyofilm oluşumu in vitro testler kullanılarak incelenmiştir, ancak in vivo koşullar altında da biyofilm oluşumunun dinamik sürecini anlamaya ihtiyaç vardır36,37. Şu anda, biyofilm inhibisyon çalışmalarının çoğu C. albicans için geçerlidir ve albicans olmayan Candida biyofilmlerinin eradikasyonu için az sayıda çalışma mevcuttur. Candida enfeksiyonlarının spektrumu son birkaç on yılda kademeli olarak değişmiştir ve ortaya çıkan albicans olmayan Candida türleri dünya çapında yüksek bir morbidite ve mortalite yükü oluşturmaktadır. Bu nedenle, biyofilm oluşumunu kontrol etmek için yeni stratejilerin geliştirilmesine ve albicans olmayan Candida türlerine odaklanan biyofilm inhibisyon testlerinin geliştirilmesine ihtiyaç vardır. İmmünoterapi, özellikle antikorlar, biyofilm oluşumunu inhibe etmek için büyük bir potansiyele sahiptir ve sistemik Candida enfeksiyonunu tedavi etmek için kullanılabilir38. Birkaç rapor, biyofilm oluşumunun erken aşamalarında biyofilm inhibisyonunda antikorların rolünü göstermiştir. Tavşanlarda kompleman reseptörü 3 ile ilişkili protein (CR3-RP, mantar aderansında potansiyel bir role sahiptir) immünizasyonuna yanıt olarak üretilen poliklonal antikorların, bukkal epitel hücrelerinde C. albicans'ın aderansını ve biyofilm oluşumunu azalttığı bildirilmiştir39. Ayrıca, kateter izolatları da dahil olmak üzere Candida suşları, aderansı ve biyofilm oluşumunu azaltan poliklonal anti-CR3-RP antikoru ve monoklonal antikor OKM1 ile önceden inkübe edildi. C. albicans'ın hücre canlılığı, aderans fazı ve biyofilm oluşum fazı40 sırasında XTT testi kullanılarak değerlendirildi. Çok az sayıda çalışma, albicans olmayan Candida türlerinin biyofilm oluşumuna karşı antikorların rolünü değerlendirmiştir. Chupacova ve ark., XTT testini kullanarak C. albicans ile birlikte C. albicans'a karşı poliklonal anti-CR3-RP antikorlarının etkinliğini değerlendirmiştir. Poliklonal anti-CR3-RP antikorları hem C. albicans hem de C. dubliniensis41'in aderansını ve biyofilm oluşumunu inhibe etti.

Bu çalışmada, antikorların biyofilm olgunlaşması ve gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için basit, hızlı ve kullanıcı dostu bir protokol tanımlanmıştır. Bu 96 kuyucuklu mikrotitre plakası bazlı XTT indirgeme testi, biyofilmlerdeki canlı hücrelerin metabolik aktivitesini ölçer ve daha önceki çalışmalardan uyarlanmıştır 7,8. Burada açıklanan XTT testi, uygulanabilir biyofilm büyümesini tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan bir hücre canlılığı testi haline gelmiştir, çünkü hızlı, kullanışlıdır ve 96 kuyucuklu bir plaka gibi yüksek verimli formatta kullanılabilir. Ayrıca, Candida biyofilmlerinin hem maya hem de hifal formlarını ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, Candida biyofilmlerinin tıbbi cihazlar (örneğin kateterler) ve kontakt lensler gibi çeşitli substratlarda ölçülmesi için de kullanılabilir.

Bu protokolün kritik adımlarından bazıları, mantar agregasyonunu önlemek için tüm adımlarda pipetlemeden önce hücre süspansiyonlarını kuvvetli bir şekilde vortekslemeyi içerir7. Zayıf biyofilmlerin, hücre yoğunlukları çok yüksek veya çok düşük olduğunda gelişmesi muhtemeldir. Bu nedenle, kullanıcılar başlangıçtaki inokulum7'de ideal mantar hücre yoğunluğunu takip etmelidir. Yıkama adımları çok kritiktir ve biyofilm22'nin bozulmasını önlemek için aşırı hücre yıkamasından kaçınılmalıdır. Biyofilmin alt tabakası yıkama işlemi sırasında rahatsız edilmemelidir. Tahlil her zaman karanlık koşullarda yapılmalı ve birden fazla kopya22 dahil edilmelidir. Kullanımdan hemen önce her seferinde taze bir XTT çözeltisi hazırlanmalıdır. İki reaksiyon arasındaki zaman farkı sonuçları çarpıtabileceğinden, kullanıcılar XTT çözümünü 96 delikli plaka42'nin ilk ve son kuyusuna eklerken minimum zaman farkını sağlamak için hızlı çalışmalıdır. Buharlaşmayı önlemek için folyo veya parafilm kullanılması önerilir. Gerekirse birkaç sorun giderme adımı gerçekleştirilebilir. Biyofilm büyümesinin olmaması veya yetersiz olması durumunda, uygun tohumlama inokülum seyreltmesi ve hesaplamaları yapılmalıdır. Daha iyi biyofilm oluşumu için, alt kültürleme koşulları değiştirilebilir ve biyofilm büyümesi farklı yüzey malzemeleri kullanılarak denenebilir. XTT testinin hassasiyetini önemli ölçüde artırmak için, biyofilmin oluşması için gereken süreyi azaltabilir, antifungal ajanın konsantrasyonunu artırabilir veya tahlilin kuluçka süresini kısaltabilir7. Biyofilmin bozulmasını önlemek için, aşırı hücre yıkamasından kaçınılmalıdır22. Tahlil ajanlarının ışığa maruz kalmasını önlemek için dış kuyucuklardan kaçınılabilir veya ajanların iç kuyucuklardan buharlaşmasını önlemek için dış kuyucuklara sıvı eklenebilir. Yıkama sırasında biyofilm bozuluyorsa nazik yıkamalar yapılmalıdır22. Bu protokol, biyofilm olgunlaşmasının inhibisyonunu değerlendirmek için serumun 24 saatlik önceden oluşturulmuş biyofilmler üzerindeki etkisini test ederken, kullanıcılar daha önceki bir rapor30'a göre, biyofilm oluşumunun inhibisyonunu değerlendirmek için 0 zamanında serum eklemek için bu protokolü de değiştirebilirler.

Biyofilm büyümesini ölçmek için diğer alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında, XTT yöntemi en hassas, tekrarlanabilir, doğru, uygun maliyetli ve spesifik yöntemdir. XTT testi, biyofilmleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan hızlı ve kolay bir teknik olmasına rağmen, bazı sınırlamaları vardır. Tek bir türden bir biyofilmdeki çeşitli ajanların dozajını veya etkilerini belirlemek için yararlı olsa da, izolatlar arasındaki metabolik değişkenlik nedeniyle birden fazla izolatı aynı anda karşılaştırmak için dikkatli kullanılmalıdır21. Suşlar arası biyofilm karşılaştırmaları için detaylı teknik standardizasyonu yapılmalıdır21. Ayrıca, XTT formazan ürünü çözelti içinde kolayca çözünürken, bazı suşlar hücre21 içinde bir miktar tutabilir. Ortam seçimi, biyofilm gelişim zamanı ve serum özellikleri gibi değişkenleri içeren netlik eksikliği olduğundan, XTT testine ek olarak, örneğin biyofilm kalınlığı / biyokütle ölçümü (kristal menekşe kullanılarak) veya hücre canlılığı (CFU yöntemi kullanılarak) gibi doğrulayıcı biyotahlillerin yapılması önerilir43. Not olarak, bu XTT testinin sonuçları kristal menekşe testi ve CFU yöntemi ile iyi korelasyon göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Yukarıda belirtilen sınırlamalara rağmen, bu yöntem farklı serum numune gruplarını (poliklonal antikorların kaynağı), monoklonal antikorları veya yardımcı immünoterapileri değerlendirmek için ekstrapolasyon yapılabilir. Burada sunulan XTT indirgeme protokolü sadece antikorların C. tropicalis biyofilmleri üzerindeki etkisini göstermesine rağmen, araştırmacılar tarafından antikorların C. auris biyofilmleri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılmıştır18. Ek olarak, bu protokol, bu protokolün Candida 16,41,44,45,46,47 cinsine genişletilmesini hak edebilen C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis ve C. auris gibi diğer Candida türleriyle yapılan önceki çalışmalardan kaynaklanmaktadır.

Optimizasyon, standardizasyon ve biyofilm niceleme testlerinde düzenli iyileştirme, doğruluğu, verimi ve tekrarlanabilirliği artırabilir. Bu protokolün dayandığı XTT indirgeme testi, metabolik aktivitenin ve biyofilmlerin yaşayabilirliğinin değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Candida biyofilmi genellikle antifungal ilaçlara dirençli olduğundan, yeni ilaçların ve yeni kombinasyonların araştırılması acil bir gerekliliktir33. Biyofilmle ilişkili enfeksiyonlar sorunuyla mücadele etmek için, biyofilm tarama testleri48 kullanılarak daha fazla antibiyofilm bileşiği araştırılmalıdır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir. Antikor bazlı immünoterapileri içeren XTT redüksiyon testinin standardizasyonuna ve iyileştirilmesine dayanan gelecekteki araştırmalar, etkili hastalık yönetimi ve kontrolü için geliştirilmiş terapötiklerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

Sap2'ye özgü antikorlar tarafından biyofilm inhibisyonu, C. tropicalis19'un neden olduğu murin sistemik kandidiyazı sırasında Sap2 aşısı aracılı korumada antikor aracılı bir koruma mekanizması olarak bildirilmiştir. Daha önceki bir çalışma ayrıca, CAGTA'nın potansiyel olarak Sap antijenlerini tanıdığını, C. albicans'ın in vitro16'nın büyümesini ve biyofilm oluşumunu azalttığını göstermiştir. Başka bir çalışmada, Sap2 tarafından silinen mutantlar, pepstatin A49 varlığında bir biyofilm büyüme kusuru sergiledi. Ek olarak, biyofilm oluşumu sırasında, Sap2 antijeni, Cek1 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz sinyal yolu50 aracılığıyla aracılık edilen müsin Msb2'nin proteolitik işlenmesinde rol oynamıştır. Bu nedenle, Msb2 işlemenin, biyofilm bütünlüğünü etkileyen antikor aracılı Sap2 nötralizasyonu ile inhibe edildiği tahmin edilebilir. Özetle, bu makalede, farklı mantar suşları veya antikor kaynakları kullanılarak, farklı ortamlarda biyofilm metabolik aktivitesinin belirlenmesi için uygulanabilecek C. tropicalis biyofilm olgunlaşması ve gelişiminde serum antikorlarının rolünü değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma, Ramalingaswami hibesi DBT-843-BIO (Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü) ve Erken Kariyer Araştırma Ödülü SER-1058-BIO (Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti) tarafından S.R.'ye desteklenmiştir. Yazarlar, PS'ye ICMR-JRF hibesini ve PS'ye DBT-JRF hibesini kabul etmektedir. Yazarlar, Dr. Ravikant Ranjan'a, SEM sırasında Pradeep Singh Thakur'un el yazması ve teknik yardımı hakkındaki önerileri için teşekkür eder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  2. Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  4. Pemmaraju, S. C., Padmapriya, K., Pruthi, P. A., Prasad, R., Pruthi, V. Impact of oxidative and osmotic stresses on Candida albicans biofilm formation. Biofouling. 32 (8), 897-909 (2016).
  5. Cavalheiro, M., Teixeira, M. C. Candida biofilms: threats, challenges, and promising strategies. Frontiers in Medicine. 5, 28 (2018).
  6. Roilides, E., Simitsopoulou, M., Katragkou, A., Walsh, T. J. How biofilms evade host defenses. Microbiology Spectrum. 3 (3), 3 (2015).
  7. Pierce, C. G., et al. A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature Protocols. 3 (9), 1494-1500 (2008).
  8. Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tummala, S., Lopez-Ribot, J. L. A 96 well microtiter plate-based method for monitoring formation and antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Journal of Visualized Experiments. (44), e2287 (2010).
  9. Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 49 (6), 973-980 (2002).
  10. Quindós, G. Epidemiology of candidaemia and invasive candidiasis. A changing face. Revista Iberoamericana de Micología. 31 (1), 42-48 (2014).
  11. Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International Journal of Microbiology. 2012, 845352 (2012).
  12. Wall, G., Montelongo-Jauregui, D., Vidal Bonifacio, B., Lopez-Ribot, J., Uppuluri, P. Candida albicans biofilm growth and dispersal: contributions to pathogenesis. Current Opinion in Microbiology. 52, 1-6 (2019).
  13. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, M. J. S. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62, 10-24 (2013).
  14. LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).
  15. Galdiero, E., et al. Eradication of Candida albicans persister cell biofilm by the membranotropic peptide gH625. Scientific Reports. 10 (1), 5780 (2020).
  16. Carrano, G., et al. Anti-Candida albicans germ tube antibodies reduce in vitro growth and biofilm formation of C. albicans. Revista Iberoamericana de Micología. 36 (1), 9-16 (2019).
  17. Alqarihi, A., Singh, S., Edwards, J. E., Ibrahim, A. S., Uppuluri, P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein catheters in mice. Scientific Reports. 9 (1), 6194 (2019).
  18. Singh, S., et al. The NDV-3A vaccine protects mice from multidrug resistant Candida auris infection. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007460 (2019).
  19. Shukla, M., Rohatgi, S. Vaccination with secreted aspartyl proteinase 2 protein from Candida parapsilosis can enhance survival of mice during C. tropicalis-mediated systemic candidiasis. Infection and Immunity. 88 (10), 00312-00320 (2020).
  20. Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT. Journal of Immunological Methods. 142 (2), 257-265 (1991).
  21. Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of Clinical Microbiology. 41 (1), 506-508 (2003).
  22. Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. Journal of Clinical Microbiology. 49 (4), 1426-1433 (2011).
  23. Taff, H. T., Nett, J. E., Andes, D. R. Comparative analysis of Candida biofilm quantitation assays. Medical Mycology. 50 (2), 214-218 (2012).
  24. Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
  25. Dhale, R. P., Ghorpade, M. V., Dharmadhikari, C. A. Comparison of various methods used to detect biofilm production of Candida species. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 8 (11), 18-20 (2014).
  26. Moffa, E. B., et al. Interaction between XTT assay and candida albicans or streptococcus mutans viability. Journal of International Oral Health. 8 (1), 12 (2016).
  27. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  28. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Ability of Candida albicans mutants to induce Staphylococcus aureus vancomycin resistance during polymicrobial biofilm formation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 54 (9), 3746-3755 (2010).
  29. Pierce, C. G., et al. A novel small molecule inhibitor of Candida albicans biofilm formation, filamentation and virulence with low potential for the development of resistance. NPJ Biofilms and Microbiomes. 1, 15012 (2015).
  30. Dekkerová, J., Lopez-Ribot, J. L., Bujdáková, H. Activity of anti-CR3-RP polyclonal antibody against biofilms formed by Candida auris, a multidrug-resistant emerging fungal pathogen. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 101-108 (2019).
  31. Muzny, C. A., Schwebke, J. R. Biofilms: an underappreciated mechanism of treatment failure and recurrence in vaginal infections. Clinical Infectious Diseases. 61 (4), 601-606 (2015).
  32. Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. Fungal biofilms and drug resistance. Emerging Infectious Diseases. 10 (1), 14-19 (2004).
  33. Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiology. 8 (10), 1325-1337 (2013).
  34. Singh, R., Kumari, A., Kaur, K., Sethi, P., Chakrabarti, A. Relevance of antifungal penetration in biofilm-associated resistance of Candida albicans and non-albicans Candida species. Journal of Medical Microbiology. 67 (7), 922-926 (2018).
  35. Gulati, M., Ennis, C. L., Rodriguez, D. L., Nobile, C. J. Visualization of biofilm formation in Candida albicans using an automated microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (130), e56743 (2017).
  36. Krom, B. P., Willems, H. M. In vitro models for Candida biofilm development. Candida Species. , Humana Press. New York, NY. 95-105 (2016).
  37. Gu, W., Xu, D., Guo, D., Zhang, L., Sun, S. In vivo models for Candida albicans biofilms study, research & reviews. Journal of Microbiology and Biotechnology. 5 (1), 26-31 (2016).
  38. Shukla, M., Chandley, P., Rohatgi, S. The role of B-cells and antibodies against Candida vaccine antigens in invasive candidiasis. Vaccines. 9 (10), 1159 (2021).
  39. Bujdáková, H., et al. Antibody response to the 45 kDa Candida albicans antigen in an animal model and potential role of the antigen in adherence. Journal of Medical Microbiology. 57 (12), 1466-1472 (2008).
  40. Bujdáková, H., Paulovicová, E., Paulovicová, L., Simová, Z. Participation of the Candida albicans surface antigen in adhesion, the first phase of biofilm development. FEMS Immunology & Medical Microbiology. 59 (3), 485-492 (2010).
  41. Chupácová, J., Borghi, E., Morace, G., Los, A., Bujdáková, H. Anti-biofilm activity of antibody directed against surface antigen complement receptor 3-related protein-comparison of Candida albicans and Candida dubliniensis. Pathogens and Disease. 76 (1), 127 (2018).
  42. Gulati, M., et al. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), 60 (2018).
  43. Ramage, G. Comparing apples and oranges: considerations for quantifying candidal biofilms with XTT [2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide] and the need for standardized testing. Journal of Medical Microbiology. 65 (4), 259-260 (2016).
  44. Kovács, R., et al. Synergistic effect of nikkomycin Z with caspofungin and micafungin against Candida albicans and Candida parapsilosis biofilms. Letters in Applied Microbiology. 69 (4), 271-278 (2019).
  45. Fernández-Calderón, M. C., et al. Antifungal and anti-biofilm activity of a new Spanish extract of propolis against Candida glabrata. BMC Complementary Medicine and Therapies. 21 (1), 1-10 (2021).
  46. Li, Z., et al. Synergistic effect of pseudolaric acid B with fluconazole against resistant isolates and biofilm of Candida tropicalis. Infection and Drug Resistance. 13, 2733-2743 (2020).
  47. Chatzimoschou, A., Giampani, A., Meis, J. F., Roilides, E. Activities of nine antifungal agents against Candida auris biofilms. Mycoses. 64 (4), 381-384 (2021).
  48. Haney, E. F., Trimble, M. J., Cheng, J. T., Vallé, Q., Hancock, R. Critical assessment of methods to quantify biofilm growth and evaluate antibiofilm activity of host defence peptides. Biomolecules. 8 (2), 29 (2018).
  49. Puri, S., et al. Secreted aspartic protease cleavage of Candida albicans Msb2 activates Cek1 MAPK signaling affecting biofilm formation and oropharyngeal candidiasis. PLoS One. 7, 46020 (2012).
  50. Staib, P., et al. Tetracycline-inducible expression of individual secreted aspartic proteases in Candida albicans allows isoenzyme-specific inhibitor screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (1), 146-156 (2008).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 187
Antikorların <em>Candida tropicalis</em> Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter