Summary

Esterilização por radiação gama de baixa dose em enxertos traqueais descelularizados

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

A obtenção da esterilização é essencial para o transplante de tecido traqueal. Apresentamos um protocolo de esterilização utilizando irradiação gama em baixas doses que é totalmente tolerada pelos órgãos.

Abstract

Um dos principais aspectos fundamentais para garantir que um transplante evolua corretamente é a esterilidade do meio. O transplante traqueal descelularizado envolve a implantação de um órgão que originalmente estava em contato com o meio ambiente, não sendo estéril desde o início. Embora o protocolo de descelularização (por exposição a detergente [dodecil sulfato de sódio a 2%), agitação contínua e choques osmóticos) seja conduzido de acordo com medidas assépticas, ele não prevê esterilização. Portanto, um dos principais desafios é garantir a esterilidade antes da implantação in vivo . Embora existam protocolos estabelecidos de esterilização por radiação gama para materiais inorgânicos, não existem tais medidas para materiais orgânicos. Além disso, os protocolos em vigor para materiais inorgânicos não podem ser aplicados a materiais orgânicos, pois a dose de radiação estabelecida (25 kGy) destruiria completamente o implante. Este trabalho estuda o efeito de uma dose de radiação aumentada em uma traqueia de coelho decelularizada. Mantivemos a faixa de dose (kGy) e testamos doses escalonadas até encontrar a dose mínima na qual a esterilização é alcançada. Após a determinação da dose, estudaram-se os efeitos da mesma no órgão, tanto histologicamente quanto biomecanicamente. Determinamos que, enquanto 0,5 kGy não atingiu esterilidade, doses de 1 kGy e 2 kGy atingiram, sendo 1 kGy, portanto, a dose mínima necessária para atingir a esterilização. Estudos microscópicos não mostraram alterações relevantes em comparação com órgãos não esterilizados. As características biomecânicas axiais não foram alteradas, e apenas uma pequena redução na força por unidade de comprimento que o órgão pode tolerar radialmente foi observada. Podemos, portanto, concluir que 1 kGy alcança a esterilização completa da traqueia de coelhos descelularizados com um mínimo, se houver, efeito sobre o órgão.

Introduction

A esterilização de um implante é um requisito básico para sua viabilidade; Na verdade, as próteses que têm se mostrado bem-sucedidas são aquelas implantadas em áreas estéreis (vasos sanguíneos, coração, osso, etc.) 1. A traqueia possui duas superfícies: uma superfície em contato com o meio externo, portanto não estéril, e uma superfície em direção ao mediastino, que é estéril. Portanto, a partir do momento em que a traqueia é extraída, ela não é um órgão estéril. Apesar do processo de descelularização subsequente ser realizado em condições estéreis máximas, não se trata de uma etapa de esterilização2. A implantação de material estranho por si só acarreta risco de infecção devido ao microambiente pró-bacteriano queproduz3e risco de até 0,014% de transmissão de doença do doador para o receptor, mesmo que o material tenha sido esterilizado4. Para garantir a correta vascularização da traqueia, em quase todos os protocolos experimentais de transplante, ela é primeiramente submetida a implante heterotópico 5,6,7 em uma área estéril (músculo, fáscia, omento, subcutâneo, etc.); Isso porque a implantação de um elemento não estéril nesse meio levaria à infecção da área3.

Existe uma gama de estratégias possíveis para a obtenção de um implante estéril. O uso do CO2supercrítico tem alcançado esterilização terminal 8,9. Outros métodos, como radiação ultravioleta ou tratamento com substâncias como ácido peracético, etanol, peróxido de oxigênio e água eletrolisada, têm obtido diferentes taxas de sucesso na esterilização, quase sempre dependendo de suas dosagens, mas têm demonstrado afetar as características biomecânicas dos implantes. De fato, algumas substâncias, como o óxido de etileno, podem alterar substancialmente a estrutura da matriz implantada e até causar efeitos imunogênicos indesejáveis. Por essa razão, muitas dessas estratégias não podem ser aplicadas a modelos biológicos 2,10,11,12,13.

A estratégia de esterilização mais estudada e aceita é a estabelecida pela norma ISO 11737-1:2006 para esterilização de produtos médicos implantados em humanos, com dose de radiação gama de 25 kGy. No entanto, essa regulamentação enfoca apenas a esterilização de elementos inertes não biológicos14,15. Além disso, as doses de radioterapia no tratamento radical do carcinoma são três ordens de grandeza menores do que as utilizadas para esterilizar produtosmédicos1. Com isso em mente, podemos concluir que tal dose não apenas mataria a microbiota, mas também destruiria e alteraria radicalmente a estrutura biológica do implante. Existe também a possibilidade de gerar lipídios residuais no momento da degradação, que podem ser potencialmente citotóxicos e acelerar a degradação enzimática do arcabouço 13,14,15,16,17, mesmo quando se utilizam doses tão baixas quanto 1,9 kGy e com danos diretamente proporcionais à dose de radiação recebida 17.

Assim, o objetivo deste trabalho é tentar identificar a dose de radiação que permite a obtenção de um implante estéril com o mínimo de efeitos deletérios causados pela irradiação 2,18,19. A estratégia seguida envolveu a irradiação de traqueias decelularizadas e irradiadas em diferentes doses escalonadas dentro de uma faixa de quilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.), até a obtenção de uma cultura negativa. Testes adicionais foram realizados para as doses que obtiveram culturas negativas, a fim de confirmar a esterilização. Após a determinação da dose mínima para obtenção da esterilização, foi verificado o impacto estrutural e biomecânico da irradiação na traqueia. Todas as métricas foram comparadas com as traqueias de coelhos nativos controle. A esterilização do construto foi então testada in vivo, implantando-se as traqueias em coelhos brancos da Nova Zelândia.

Protocol

A diretiva europeia 20170/63/EU para o cuidado e uso de animais de laboratório foi cumprida e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Valência (Lei 86/609/CEE e 214/1997 e Código 2018/VSC/PEA/0122 Tipo 2 do Governo de Valência, Espanha). 1. Decelularização traqueal NOTA: O método de decelularização foi relatado em outra publicação20. Eutanásia de coelhos brancos (…

Representative Results

DescelularizaçãoA coloração DAPI mostra ausência de DNA, e nenhum valor de DNA superior a 50 ng foi detectado em nenhuma das traqueias por eletroforese, com todos os fragmentos sendo menores que 200 pb20. Cultura microbianaDuas das oito peças submetidas a 0,5 kGy apresentaram mudança de cor em menos de 1 semana. Nenhuma das peças irradiadas a 1 kGy e 2 kGy apresentou alteração de cor (Figura 1</str…

Discussion

Existem várias estratégias de esterilização. O CO2supercrítico penetra totalmente nos tecidos, acidificando o meio e desconstruindo a bicamada fosfolipídica celular com eliminação simples por meio da despressurização do implante 8,14,25. A radiação ultravioleta também tem sido utilizada, e sua eficácia na traqueia de roedores tem sido publicada, embora existam poucos relatos naliteratur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este artigo foi apoiado pela Bolsa da Sociedade Espanhola de Cirurgia Torácica de 2018 para Estudo Multicêntrico Nacional [Número 180101 concedido a Néstor J.Martínez-Hernández] e PI16-01315 [concedido a Manuel Mata-Roig] pelo Instituto de Salud Carlos III. O CIBERER é financiado pelo VI Plano Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Programa Consolidador, Ações CIBER e pelo Instituto de Salud Carlos III, com assistência do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional.

Materials

6-0 nylon monofilament suture  Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA SN-5698G
Amphotericin B 5% Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA 15290018
Bioanalyzer Agilent, Santa Clara, CA, USA G2939BA
Buprenorphine Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido N02AE01
Compression desktop UTM Microtest, Madrid, Spain EM1/10/FR
Cryostate Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania CM3059
DAPI (4',6-diamino-2-phenylindole)  DAPI. Sigma-Aldrich, Missouri, USA  D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich; MO, USA D2650
DMEM  Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA 11965084
DNA extraction kit DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany 4368814
Enrofloxacin, 2.5% Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany 0035-0002
Fetal bovine serum (FBS) GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain SH20898.03IR
Fluorescence microscope Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) DM2500??
Freezing Container  Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain  5100-0001
Isofluorane Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain  8.43603E+12
Ketamin Imalgene. Merial; Toulouse, Francia BOE127823
Linear accelerator  "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA H191001
Magnetic stirrer Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia BS-010144-AAN
Meloxicam 5 mg/ml Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany 6283-MV
OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) Fischer Scientific, Madrid, Spain 12678646
Penicillin-streptomycin 5% Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA 15140122
Pentobarbital sodium Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España 3.60587E+12
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich; MO, USA P2272
Propofol Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania G 151030
Proteinase K Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA S3020
PVC hollow tubes Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy hhdddyyZ
PVC stent  ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey 019 5305 1
R software, Version 3.5.3 R Core R Foundation for Statistical Computing R 3.5.3
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich; MO, USA 8,17,034
Spectrophotometer Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands ND-ONEC-W
Spreadsheet Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA 2864993241
Traction Universal Testing Machine  Testing Machines, Veenendaal, Netherlands 84-01
UTM Software TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA  100-093-627 F
VECTASHIELD Mounting Medium  Vector Labs, Burlingame; CA; USA H-1000-10
Xylacine Xilagesic. Calier; Barcelona, España 20102-003

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Cite This Article
Martínez-Hernández, N. J., Milián-Medina, L., Mas-Estellés, J., Monroy-Antón, J. L., López-Villalobos, J. L., Hervás-Marín, D., Roig-Bataller, A., Mata-Roig, M. Low-Dose Gamma Radiation Sterilization for Decellularized Tracheal Grafts. J. Vis. Exp. (194), e64432, doi:10.3791/64432 (2023).

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