Este protocolo descreve um método semi-automatizado para rastreios de drogas organoides de médio a alto rendimento e software de análise de imagem automatizado e agnóstico ao microscópio para quantificar e visualizar respostas multiparamétricas de drogas organoides únicas para capturar a heterogeneidade intratumoral.
Os organoides tumorais derivados do paciente (PDTOs) são uma grande promessa para pesquisas pré-clínicas e translacionais e para a previsão da resposta à terapia do paciente a partir de exames de drogas ex vivo. No entanto, os ensaios atuais de triagem de drogas à base de trifosfato de adenosina (ATP) não capturam a complexidade de uma resposta medicamentosa (citostática ou citotóxica) e a heterogeneidade intratumoral que demonstrou ser retida em PDTOs devido a uma leitura em massa. A imagem de células vivas é uma ferramenta poderosa para superar esse problema e visualizar as respostas aos medicamentos com mais profundidade. No entanto, o software de análise de imagem muitas vezes não é adaptado à tridimensionalidade dos PDTOs, requer corantes de viabilidade fluorescente ou não é compatível com um formato de microplaca de 384 poços. Este artigo descreve uma metodologia semi-automatizada para semear, tratar e visualizar PDTOs em um formato de 384 poços de alto rendimento usando sistemas de imagem convencionais, de campo amplo e de células vivas. Além disso, desenvolvemos um software de análise de imagem livre de marcadores de viabilidade para quantificar métricas de resposta a medicamentos baseadas em taxa de crescimento que melhoram a reprodutibilidade e corrigem as variações da taxa de crescimento entre diferentes linhas de PDTO. Usando a métrica normalizada de resposta medicamentosa, que pontua a resposta ao medicamento com base na taxa de crescimento normalizada para uma condição de controle positiva e negativa, e um corante de morte celular fluorescente, as respostas citotóxicas e citostáticas a drogas podem ser facilmente distinguidas, melhorando profundamente a classificação de respondedores e não respondedores. Além disso, a heterogeneidade da resposta medicamentosa pode ser quantificada a partir da análise da resposta a um único organoide a medicamentos para identificar clones potenciais e resistentes. Em última análise, este método visa melhorar a predição da resposta à terapia clínica, capturando uma assinatura multiparamétrica de resposta medicamentosa, que inclui a parada cinética do crescimento e a quantificação da morte celular.
Nos últimos anos, a descoberta de medicamentos contra o câncer in vitro , a triagem de medicamentos e a pesquisa fundamental têm transitado do uso de modelos tradicionais de câncer bidimensional (2D) com linhagens celulares imortalizadas para modelos de câncer tridimensionais (3D) mais fisiologicamente relevantes. Isso estimulou a adoção de esferoides tumorais com linhas celulares de câncer estabelecidas, que recriam interações e estruturas célula a célula mais complexas presentes em tumores sólidos. Atualmente, os organoides tumorais derivados do paciente (PDTOs) são o modelo de câncer 3D mais avançado e fisiologicamente relevante disponível para a pesquisa do câncer in vitro , pois proporcionam vantagens adicionais sobre os esferoides tumorais, ou seja, a heterogeneidade encontrada em pacientes com câncer1. Os PDTOs são estabelecidos a partir de tecido tumoral originário de pacientes com câncer e, portanto, retêm tanto o fenótipo quanto o genótipo do tumor. Como tal, os PDTOs estão se tornando inestimáveis para a pesquisa fundamental e translacional do câncer e têm o potencial de melhorar muito a oncologia de precisão2.
Apesar de seu potencial promissor, esses sofisticados modelos de câncer in vitro 3D são frequentemente subutilizados devido à falta de métodos avançados de análise. O ensaio mais comumente utilizado determina o número de células viáveis no PDTO através da quantificação de ATP3 intracelular. Esses ensaios são normalmente análises em massa de ponto de tempo único, negligenciando assim as respostas críticas dependentes do tempo e negligenciando as respostas clonais. Especificamente, a capacidade de monitorar o crescimento dos PDTOs (taxa de crescimento) e sua resposta a terapias específicas é de alto interesse 4,5. A resposta medicamentosa normalizada (NDR), que pontua a resposta ao medicamento com base na taxa de crescimento normalizada para uma condição de controle positivo (ctrl +) e negativo (ctrl-), também foi relatada recentemente como uma métrica crucial para avaliar a sensibilidade ao medicamento contra o câncer com triagem baseada em células, embora isso tenha sido feito predominantemente para linhagens celulares 2D6. Portanto, métodos de análise mais sofisticados são necessários para aproveitar plenamente esses modelos de câncer 3D mais representativos e complexos. A microscopia é considerada uma abordagem poderosa para estudar a complexidade desses modelos organoides7.
Este artigo descreve um método para monitorar respostas cinéticas a medicamentos em modelos de câncer 3D, usando microscópios convencionais de campo largo e sistemas de imagem de células vivas. Adaptações foram feitas no protocolo descrito por Driehuis et al.4 para ser compatível com a automação usando um robô pipetador, dispensador digital de medicamentos e sistema de imagem de células vivas para aumentar a reprodutibilidade e reduzir o número de horas de trabalho ‘hands-on’. Este método permite a triagem de drogas de médio a alto rendimento de ambos os esferoides tumorais com linhagens celulares de câncer estabelecidas (ver Tabela Suplementar S1 para linhas celulares testadas), bem como os PDTOs, em um formato de microplaca de 384 poços e multi-organóides. Usando um processo de aprendizado de máquina de rede convolucional, a identificação e o rastreamento automatizados de esferoides tumorais individuais ou PDTOs poderiam ser realizados exclusivamente a partir de imagens de campo brilhante e sem o uso de corantes fluorescentes de marcação de células vivas8. Isso é altamente vantajoso, pois a maior parte da identificação com imagens de campo brilhante requer anotação manual (que é trabalhosa e demorada) ou requer a adição de corantes fluorescentes, o que pode confundir as respostas dos medicamentos relacionadas ao estresse oxidativo induzido pela fotoxicidade9.
O software de análise de imagem resultante desenvolvido internamente amplia a funcionalidade dos sistemas convencionais de imagem de células vivas, já que os módulos de análise de imagem 3D não estão disponíveis, com restrição de plataforma ou não são compatíveis com microplacas de 384 poços e imagens de poços inteiros. Além disso, esses módulos geralmente têm um preço alto e oferecem leituras limitadas de organoides em massa. Portanto, esse método é altamente relevante para cientistas que têm acesso a sistemas de imagem de células vivas amplamente disponíveis e visam extrair mais informações sobre uma resposta a medicamentos em comparação com o ensaio baseado em ATP padrão-ouro, mas rudimentar. Com a adição de indicadores específicos de morte celular, as respostas citostáticas de drogas podem ser distinguidas das respostas citotóxicas, fornecendo assim mais informações sobre as ações mecanicistas de drogas atualmente inatingíveis a partir da análise de ponto de tempo único. Finalmente, a imagem de células vivas permite o rastreamento organoide individual para obter métricas de resposta a medicamentos organoides únicos para capturar a heterogeneidade da resposta e identificar potenciais subclones resistentes.
O objetivo deste método e do software de análise de imagem associado é implementar automação de baixo custo na triagem de medicamentos organoides para limitar a intervenção do usuário e reduzir a variabilidade no manuseio, análise de imagens e análise de dados. Para disponibilizar esse software aos pesquisadores, ele é independente de microscópio e plataforma, e um aplicativo baseado em nuvem é disponibilizado. Assim, ao suportar sistemas convencionais de imagem de células vivas, também pretendemos melhorar a sua funcionalidade para aplicações e análises de cultura 3D.
A triagem de medicamentos PDTO de médio a alto rendimento geralmente depende de leituras que extraem apenas uma fração da informação que os organoides poderiam potencialmente fornecer. Tornou-se cada vez mais claro que, para que a tecnologia organoide em rápida evolução realize um maior potencial científico e clínico, ensaios 3D mais avançados, leituras e métodos de análise são criticamente necessários. Aqui, um pipeline de triagem avançada é descrito, o que não apenas aumenta a reprodutibilidade, mas também aumenta consideravelmente a traduzibilidade clínica, incorporando uma leitura de imagem de células vivas orientada por IA. Além do software de análise desenvolvido internamente, é implementado o uso da métrica normalizada de resposta medicamentosa (NDR), o que demonstra claramente sua capacidade de definir diferenças específicas do paciente na resposta ao tratamento6.
A inclusão dessa métrica de normalização será, sem dúvida, de enorme valor, lembrando que inúmeros estudos visam delinear as respostas ao tratamento com base em pequenas diferenças na área sob a curva (AUC) ou na concentração inibitória semimáxima (IC50) (já que a maioria das curvas dose-resposta se sobrepõe/está localizada próxima uma da outra)11,12 . As métricas da taxa de crescimento já foram implementadas em protocolos de triagem de medicamentos organoides usando o ensaio baseado em ATP, mas dependem da normalização dos poços de referência lisados no ponto de tempo 04. Em contraste, esse método permite a normalização da taxa de crescimento intra-poço, o que não apenas explica as diferenças interpacientes na taxa de crescimento da PDTO, mas também as diferenças interwell resultantes de variações na densidade de semeadura e nos efeitos dependentes da localização da placa para aumentar a reprodutibilidade. Além disso, adaptamos a notificação de notificação de falha na entrega para aumentar ainda mais a separação da resposta da PDTO interpaciente, incluindo um controle positivo para a normalização 6,8.
Além disso, a análise, que é compatível com formatos de alto rendimento e automação, pode detectar com precisão respostas organoides individuais, permitindo a quantificação da resistência subclonal – a principal força motriz da recidiva e progressão tumoral13. Por exemplo, embora PDAC052 e PDAC060 tenham mostrado uma boa resposta ao tratamento in vitro (com base na NDR), a análise adicional de um único organoide foi capaz de detectar uma população pequena (maior com PDAC060) de subclones que não respondem ao tratamento. Curiosamente, isso correspondeu muito com a observação clínica, dado que PDAC052 e PDAC060 tiveram uma resposta durável (nenhuma atividade tumoral detectada), mas eventualmente ambos foram diagnosticados com progressão tumoral local (devido à presença de clones resistentes). Em comparação com as leituras 3D convencionais (ensaio baseado em ATP e tamanho / números), espera-se que esse pipeline de triagem avançada aumente o desempenho preditivo extraindo informações clinicamente mais relevantes desses “pacientes no laboratório”. Esta hipótese está agora a ser testada através da triagem de amostras clínicas de PDTO no laboratório dos autores com este método para correlacionar ex vivo com a resposta in vivo e o desfecho clínico.
Para obter mais insights sobre os mecanismos de resposta a uma droga, reagentes fluorescentes convencionais de imagem de células vivas, além de corantes de citotoxicidade, são compatíveis com este método para estudar mecanismos de morte celular. Mostramos anteriormente a compatibilidade desse método com o Sartorius Caspase 3/7 Green Reagent para estudar a indução de apoptose dependente de caspase após o tratamento comcisplatina 8. A compatibilidade com outros corantes para estudar o estresse oxidativo (reagentes CellROX) ou hipóxia (reagentes de hipóxia Image-iT) ainda precisa ser testada. No entanto, esses reagentes já foram utilizados com sucesso em modelos 3D in vitro 14,15.
O software de análise de imagens também é compatível com outros formatos de placas ou métodos de cultivo (por exemplo, placas de microcavidade, cúpulas de ECM) se imagens claras e em foco dos organoides puderem ser capturadas. Isso geralmente é um desafio para organoides cultivados em cúpulas, uma vez que crescem em diferentes planos z, o que requer a funcionalidade de empilhamento z do microscópio que nem sempre está disponível. Portanto, aconselhamos o uso de microplacas de fundo plano ULA 384-well para garantir imagens de qualidade suficiente.
Além disso, a análise é compatível com outros sistemas de imagem de células vivas, como mostrado anteriormente para imagens de contraste de fase capturadas com um sistema IncuCyte ZOOM8. Uma limitação do sistema de imagem de células vivas Spark Cyto que foi usado neste manuscrito é a capacidade de uma placa para medições cinéticas. No entanto, a expansão Spark Motion aumenta sua capacidade para até 40 microplacas que podem ser peneiradas a granel. A compatibilidade do software desenvolvido internamente será expandida para esses e outros sistemas para oferecer uma solução independente de plataforma, com o objetivo de padronizar e automatizar pipelines de imagem e análise de dados. O aplicativo baseado na Web também incluirá ferramentas gráficas interativas e cálculos automatizados de métricas de medicamentos, como mostrado neste artigo, para reduzir o tempo de análise manual.
O algoritmo de segmentação PDTO sem rótulo foi treinado e testado em vários modelos esferoides e PDTO cultivados internamente com diferenças morfológicas distintas (sólido, semissólido, cístico), podendo, consequentemente, detectá-los com alta precisão8. Uma limitação do modelo é que a inclusão de PDTOs císticos aumentou a detecção indesejada de bolhas presentes no poço seguinte à semeadura. No entanto, a incubação durante a noite foi suficiente para remover a maioria dessas bolhas, permitindo uma varredura qualitativa do ponto de tempo 0. A precisão da segmentação da imagem organoide e do método precisa ser validada por outros usuários e, com base em seu feedback, o software pode ser treinado ainda mais para obter um algoritmo de análise de imagem robusto e automatizado. Além disso, nosso objetivo é obter mais dados clínicos para correlacionar a resposta medicamentosa ex vivo quantificada por esse método com a resposta clínica no paciente, a fim de identificar os melhores parâmetros para predizer a resposta terapêutica e desenvolver ainda mais esse método para a medicina funcional de precisão do câncer16.
The authors have nothing to disclose.
Parte desta pesquisa foi financiada por doações de diferentes doadores, incluindo Dedert Schilde vzw e Sr. Willy Floren. Este trabalho é parcialmente financiado pela Fundação de Investigação Flamenga, 12S9221N (A.L.), G044420N (S.V., A.L., E.G.), 1S27021N (M.L.), e pelo Fundo de Investigação Industrial da Universidade de Antuérpia, PS ID 45151 (S.V., A.L., C.D.). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.
6-well plate | Greiner | 657160 | |
8-Channel p300 (GEN 2) pipette | Opentrons | ||
300 µL Tips | Opentrons | ||
384-well flat-bottom ULA microplate | Corning | 4588 | minimum volume 50 µL |
384-well flat-bottom ULA Phenoplate | Perkin Elmer | 6057802 | minimum volume 75 µL |
A8301 | Tocris Bioscience | 2939 | |
ADF+++ | Advanced DMEM/F12, 1% GlutaMAX, 1% HEPES, 1% penicillin/streptomycin | ||
Advanced DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12634 | |
B27 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Breathe easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059 | |
Caspase 3/7 Green | Sartorius | 4440 | |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 | Bio-Rad Laboratories | 1450017 | |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | ATP-assay |
Cooler for 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 490006-908 | |
Cooling element 12 x 8 x 3 cm | Bol.com | 9200000107744702 | For custom microplate holder OT-2 |
Cultrex Organoid Harvesting Solution | R&D systems | 3700-100-01 | |
Cultrex PathClear Reduced Growth Factor BME, Type 2 | R&D systems | 3533-010-02 | extracellular matrix (ECM) |
Cytotox Green | Sartorius | 4633 | |
Cytotox Red | Sartorius | 4632 | |
D300e | Tecan | Digital drug dispenser | |
D300e Control v3.3.5 | Tecan | Control software D300e | |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
Full Medium | ADF+++ supplemented with 0.5 nM WNT surrogate-Fc-Fusion protein, 4% Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium, 4% Rpso3-Fc Fusion Protein conditioned medium, 1x B27, 1 mM N-acetyl cysteine (NAC), 5 mM nicotinamide, 500 nM A83-01, 100 ng/mL FGF10, and 10 nM Gastrin | ||
Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
Gemcitabine | Selleck Chemicals | S1714 | |
GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 35050 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
Hoechst 33342 Solution (20 mM) | ThermoFisher Scientific | 62259 | |
Human pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) patient-derived organoids | Biobank@uza (Antwerp, Belgium; ID: BE71030031000; Belgian Virtual Tumorbank funded by the National Cancer Plan) | ||
N-acetyl-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-100G | |
Noggin-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N002 | |
Opentrons App v6.0.1 | Opentrons | OT-2 control software | |
Opentrons Protocol Designer Tool | Opentrons | https://designer.opentrons.com/ | |
Orbits data compression tool | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | ||
Orbits image analysis webapp | University of Antwerp | www.orbits-oncology.com or contact corresponding author | |
OT-2 | Opentrons | Pipetting robot | |
Paclitaxel | Selleck Chemicals | S1150 | |
Pasteur Pipette 230 mm | Novolab | A33696 | |
Peniciline-Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Rspo3-Fc Fusion Protein conditioned medium | Immunoprecise | N003 | |
Spark Cyto 600 | Tecan | Live-cell imaging and multi-mode platereader | |
SparkControl v3.1 | Tecan | Spark Cyto control software | |
Staurosporine | Tocris Bioscience | 1285 | |
Sterile 25 mL reservoir | VWR (Diversified Biotech) | 10141-922 | |
T8 plus cassette | Tecan | ||
TC20 | Bio-Rad Laboratories | automated cell counter | |
TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12604-021 | dissociation enzyme |
Tween-20 | Acros Organics | 233360010 | |
WNT Surrogate-Fc-Fusion protein | Immunoprecise | N001 | |
Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 |