Summary
Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.
Abstract
Die Treue der Eizellmeiose ist entscheidend für die Erzeugung entwicklungskompetenter euploider Eizellen. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle in der Prophase I der ersten meiotischen Teilung einen längeren Arrest. Nach der Pubertät und bei der meiotischen Wiederaufnahme zerlegt sich die Kernmembran (Kernhüllenzusammenbruch), und die Spindel wird hauptsächlich im Zentrum der Eizellen zusammengesetzt. Die anfängliche Positionierung der zentralen Spindel ist unerlässlich, um vor abnormalen Kinetochor-Mikrotubuli (MT)-Anhaftungen und Aneuploidie zu schützen. Die zentral positionierte Spindel wandert zeitkritisch in Richtung Kortex, und dies ist ein notwendiger Prozess, um einen winzigen Polkörper zu extrudieren. In mitotischen Zellen beruht die Spindelpositionierung auf der Interaktion zwischen zentrosomenvermittelten astralen MTs und dem Zellkortex. Im Gegenteil, Mauseizellen fehlen klassische Zentrosomen und enthalten stattdessen zahlreiche acentriolare MT-Organisationszentren (MTOCs). Im Metaphase-I-Stadium haben Maus-Eizellen zwei verschiedene Sätze von MTOCs: (1) MTOCs, die gruppiert und sortiert sind, um Spindelpole (polare MTOCs) zusammenzusetzen, und (2) metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs), die im Zytoplasma verbleiben und nicht direkt zur Spindelbildung beitragen, aber eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Spindelpositionierung und der rechtzeitigen Spindelmigration spielen. Hier wird eine Multiphotonen-Laserablationsmethode beschrieben, um endogen markierte mcMTOCs in Eizellen von Cep192-eGfp-Reportermäusen selektiv abzubauen. Diese Methode trägt zum Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die der Positionierung und Migration der Spindel in Säugetiereizellen zugrunde liegen.
Introduction
Haploide Gameten (Spermien und Eizellen) werden durch Meiose produziert, die eine Runde DNA-Replikation beinhaltet, gefolgt von zwei aufeinanderfolgenden Teilungen, die für die Verringerung der Chromosomenzahl vor der Befruchtung notwendig sind. Bei Säugetieren erfährt die Eizelle während des frühen fetalen Lebens einen längeren Arrest (bis zur Pubertät) im Diplotenstadium der Prophase I der ersten meiotischen Teilung, einem Stadium, das als Keimvesikel (GV) bezeichnet wird. Nach der meiotischen Wiederaufnahme erfährt die GV-Eizelle einen Kernhüllenabbau (NEBD), und die Spindel wird hauptsächlich im Eizellzentrum 1,2,3 aufgebaut. Später, angetrieben von F-Aktin, wandert die Spindel rechtzeitig vom Eizellzentrum zum Kortex, um eine stark asymmetrische Teilung zu gewährleisten, was zu einem Ei mit einem winzigen Polkörper (PB)4,5,6 führt.
In mitotischen Zellen bestehen die Zentrosomen aus einem Paar Zentriolen, die von perizentriolären Materialkomponenten (PMC) wie Pericentrin, γ-Tubulin, Cep152 und Cep1927 umgeben sind. Diese zentriolhaltigen Zentrosomen tragen zur Genauigkeit der bipolaren Spindelbildung bei8. Zentriolen gehen jedoch während der frühen Oogenese bei verschiedenen Arten verloren, einschließlich Nagetieren9. Daher nehmen Mauseizellen einen zentriolenunabhängigen Spindelanordnungsweg unter Verwendung zahlreicher acentriolarer Mikrotubuli (MT) Organisationszentren (MTOCs) an9,10. Nach der meiotischen Wiederaufnahme durchlaufen die perinukleären MTOCs drei verschiedene Schritte der Rekondensation, Dehnung und Fragmentierung in eine große Anzahl kleinerer MTOCs11,12. Die fragmentierten MTOCs werden dann gruppiert und sortiert, um eine bipolare Spindel10,13,14 zu organisieren. Ein weiterer Pool von MTOCs befindet sich während der NEBD im Zytoplasma. Einige dieser zytoplasmatischen MTOCs wandern und bilden Spindelpole (polare MTOCs, pMTOCs)10,11. Kürzlich wurde eine weitere Untergruppe zytoplasmatischer MTOCs entdeckt, die als metaphastische zytoplasmatische MTOCs (mcMTOCs) bezeichnet werden, die nicht zur Spindelpolbildung beitragen, sondern während der Metaphase I (Met I) im Zytoplasma der Eizellen verbleiben15. Die Depletion von mcMTOCs durch Multiphotonen-Laserablation oder abnorme Erhöhung ihrer Anzahl durch Autophagiehemmung stört die Positionierung und Migration der Spindel und erhöht die Inzidenz von Aneuploidie in Metaphase-II-Oozyten15.
Interessanterweise unterscheiden sich mcMTOCs in vielerlei Hinsicht von pMTOCs15. Im Gegensatz zu pMTOCs, die hauptsächlich aus perinukleären MTOCs stammen, stammen mcMTOCs beispielsweise aus dem Eizellkortex. Wenn sich die Spindel noch im Zentrum der Eizelle befindet, sind die mcMTOCs asymmetrisch gegenüber der Seite lokalisiert, zu der die Spindel für die PB-Extrusion15 wandert. Astralähnliche MTs können den Kortex in der relativ großen Eizelle nicht erreichen. Daher kernen diese mcMTOCs MTs, um die Spindel (über astralähnliche MTOCs) im Kortex zu verankern. Diese Ergebnisse deuten auf ein Modell hin, in dem die mcMTOC-kernhaltige MT-Kraft der F-Aktin-vermittelten Kraft entgegenwirkt, die die Spindelmigration in Richtung Kortex antreibt. Das Gleichgewicht zwischen diesen beiden entgegengesetzten Kräften ist wesentlich, um die zentrale Spindelpositionierung und die rechtzeitige Spindelmigration zu regulieren15.
Bisher lokalisieren alle untersuchten PMC-Proteine (Pericentrin, g-Tubulin, Cep192 und Aurora-Kinase A) in beiden MTOC-Pools: mcMTOCs und pMTOCs15. Daher gibt es keinen chemischen oder genetischen Ansatz, um mcMTOCs selektiv zu stören, ohne pMTOCs zu stören. Diese Einschränkungen können umgangen werden, indem die mcMTOCs selektiv mit Laserablation anvisiert werden. Unter den laserbasierten Technologien, die für die Mikroablation entwickelt wurden, zeigen gepulste Multiphotonen-Femtosekundenlaser ein großes Potenzial aufgrund ihrer auf die Fokusebene beschränkten Präzisionswirkung, der hohen Eindringtiefe des nahinfraroten Lichts und der reduzierten Phototoxizität und thermischen Schädigung der Zelle16,17,18. Diese Arbeit beschreibt einen selektiven Ansatz zur Ablation von mcMTOCs in Mauseizellen unter Verwendung eines Multiphotonenlasers, der an ein inverses Mikroskop gekoppelt ist.
Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der University of Missouri genehmigt (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP Reporter weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Um Cep192-eGFP-Reportermäuse zu erzeugen, wurde die CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur verwendet, um das EGFP-Reportergen in das CF-1-Mausgenom zu integrieren. Der EGFP-Reporter wurde an der C-Endstation von Cep192 (einem integralen Bestandteil der MTOCs)15 fusioniert. Um die Mauskolonie zu erhalten, wurden homozygote Cep192-eGfp-Reportermäuse verwendet. Alle Tiere wurden in Käfigen (bis zu vier Tiere/Käfig) bei 21 °C und 55% Luftfeuchtigkeit gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser.
1. Entnahme von Mauseizellen
- Das Kulturmedium (Chatot, Ziomek und Bavister, CZB19, siehe Materialtabelle) vorbereiten und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
HINWEIS: Das CZB-Medium kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden (siehe Zusatzdatei 1 für die Medienkomposition). - Ergänzen Sie das CZB-Medium mit Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in den Inkubator.
HINWEIS: Milrinon ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der die in der Prophase I blockierten Eizellen aufrechterhält und die meiotische Wiederaufnahme verhindert20. - Bereiten Sie das Sammelmedium (bikarbonatfreies minimales essentielles Medium, MEM) vor, das 3 mg/ml Polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Zusatzdossier 1) und Milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, siehe Materialtabelle) enthält.
- Bereiten Sie die Sammel- und Kulturschalen vor, stellen Sie vier Mikrotropfen (100 μL) Sammelmedium (MEM/PVP + M) und zwei Mikrotropfen (100 μL) Kulturmedium (CZB + M) in 60 mm bzw. 35 mm Petrischalen her und bedecken Sie sie mit Mineralöl (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Auffangschale wärmer auf dem Objektträger und stellen Sie die Kulturschale bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator.
- Injizieren Sie intraperitoneal 5 IE Serumgonadotropin (PMSG, siehe Materialtabelle) in geschlechtsreife (6-8 Wochen alte) Cep192-eGFP-Reporterinnen 44-48 h vor der Eizellentnahme.
- Opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, identifizieren und entfernen Sie die Eierstöcke21 und geben Sie sie in ein Uhrenglas mit vorgewärmtem Sammelmedium (MEM/PVP + M) bei 37 °C.
- Fixieren Sie den Eierstock, indem Sie eine 1-ml-Spritze am Boden des Uhrenglases berühren und mehrmals (~ 40 Mal pro Eierstock) mit zusammengebündelten Nähnadeln punktieren, um die Eizellen in das Medium freizusetzen.
- Mit einer Kunststoff-Transferpipette wird das gesamte Medium, das die Cumulus-Eizelle-Komplexe (KOK) enthält, aus Schritt 1.7 in eine leere 100-mm-Kunststoff-Petrischale überführt.
- Sammeln Sie die COCs unter einem Stereomikroskop mit einer Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Auffangschale, die MEM/PVP + M enthält.
- Mit einer schmalen Pasteur-Glaspipette (ca. 100 μm Durchmesser) werden die Eizellen mechanisch durch sanftes, wiederholtes Pipettieren entgiftet, anschließend in vier Mikrotropfen (100 μL) MEM/PVP + M (die Auffangschale) überführt und gewaschen, bevor sie in die Kulturschale CZB + M überführt werden.
- Die entblößten Eizellen für 1 h bei 37 °C mit 5% CO2 in der Luft bebrüten.
2. Mikroinjektion von Eizellen
- Geben Sie einen 250 μL Tropfen MEM/PVP + M in einen 100 mm Kunststoff-Petrischalendeckel und decken Sie ihn mit Mineralöl ab.
HINWEIS: Der Petrischalendeckel hat einen unteren Rand, der mehr Platz für die Einstellung des Mikromanipulators bietet. - Schalten Sie das Mikroinjektionssystem ein (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie die Mikroinjektionsschale auf den Wärmetisch (37 °C) des Mikroskops.
- Laden Sie die Injektionsnadel mit 0,5 μL mCh-Cep192cRNA unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie die Injektionsnadel am Mikromanipulator.
- Übertragen Sie die entblößten Eizellen (Schritt 1.11) in den 250 μL Mikrotropfen (Schritt 2.1).
- Stellen Sie unter einem 20- oder 40-fachen Objektiv die Position und den Fokus der Injektions- und Haltenadeln entsprechend der Eizellposition ein (Abbildung 1).
- Richten Sie die Mikroinjektionseinheit ein und stellen Sie den Injektionsdruck (pi), den Kompensationsdruck (pc) und die Injektionszeit (ti) ein, um 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA injizieren zu können (um die MTOCs exogen zu markieren).
- Injizieren Sie die Eizellen vorsichtig, ohne den Zellkern zu berühren.
- Sobald alle Eizellen injiziert sind, waschen Sie sie in drei Mikrotropfen CZB + M, geben Sie sie in die Kulturschale (CZB + M) und inkubieren Sie sie für 3 h bei 37 ° C, um die mCh-Cep192-Expression zu ermöglichen.
3. Eizellreifung
- Das Reifungsmedium wird durch Zugabe von Glutamin (1 mM) zu CZB-Medium vorbereitet, das in einem Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C für mindestens 3 h voräquilibriert wurde.
- Zwei Mikrotropfen (100 μL) des Reifungsmediums in einer 35 mm Petrischale herstellen und mit Mineralöl abdecken (Reifungsschale).
- Waschen Sie Prophase-I-blockierte Eizellen mindestens dreimal in 100 μL Milrinon-freien CZB-Mikrotropfen, um das Milrinon vollständig zu entfernen und eine meiotische Wiederaufnahme zu ermöglichen.
- Die Eizellen werden in die Reifungsschale überführt und für 5 h (Prometaphase-I-Stadium) in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C inkubiert.
4. Eizellpräparat für Ablation und Bildgebung
- Die Prometaphase-I-Eizellen (Schritt 3.4) werden in eine Glasboden-Kulturschale mit 100 μL Reifungsmedium (Schritt 3.1) überführt, die mit Mineralöl bedeckt ist.
5. Mikroskopische Vorbereitung für die Ablation
- Schalten Sie mindestens 30 min vor dem Abtragen den Temperaturregler für den Stufeninkubator ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie ihn auf 37 °C ein.
- Schalten Sie den CO 2 -Regler ein und stellen Sie ihn auf 5% CO2 ein.
- Wählen Sie ein apochromatisches 40-faches Ölimmersionsobjektiv und tragen Sie einen kleinen Tropfen des Immersionsöls auf.
- Montieren Sie die Glasboden-Kulturschale mit den Eizellen auf einen Inkubator und decken Sie den Inkubator mit einem Gasdeckel ab.
- Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) eine Option aus, mit der Sie mehrere Stufenpositionen speichern können (z. B. "Markierung definieren und Experiment finden"). Zentrieren Sie mit Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung die einzelnen Eizellen und speichern Sie deren Positionen.
- Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware den XYZ-Scanmodus , stellen Sie das Bildformat auf 256 x 256 Pixel ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 2,5x - 3,0x ein und wählen Sie eine Scanfrequenz von 600 Hz. Dies entspricht einer Pixelverweilzeit von ca. 1,6 μs.
- Stellen Sie eine 488-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 10% der Laserleistung ein (was 4,0 μW auf Probenebene entspricht) (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie eine spektrale Bandbreite von 500-550 nm, um das GFP-Signal der MTOCs zu beobachten. Für die gleichzeitige Beobachtung der Fluoreszenz aus dem mCherry-markierten Cep192 stellen Sie eine 585-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 8% der Laserleistung ein (was 10,7 μW auf Probenebene entspricht) und verwenden Sie einen anderen Detektor, der auf eine spektrale Bandbreite von 595-645 nm eingestellt ist.
HINWEIS: Es ist hilfreich, den Durchlichtdetektor (TLD) des konfokalen Mikroskops zu verwenden, um Eizellgrenzen gleichzeitig zu erkennen. - Verwenden Sie einen Live-Scan-Modus und die manuelle Steuerung des Z-Laufwerks, um die Eizelle auf MTOCs zu untersuchen.
- Sobald ein mcMTOC erkannt wurde, zeichnen Sie eine quadratische Region of Interest (ROI) um ihn herum.
6. Ablation von mcMTOCs
- Stellen Sie einen Femtosekundenlaser auf eine Wellenlänge von 740 nm ein.
HINWEIS: Die Laserwellenlänge kann je nach Mikroskop und Laserbedingungen geändert werden. - Verwenden Sie den elektrooptischen Modulator des Multiphotonenmikroskops (siehe Materialtabelle), um die Laserleistung auf 70%-80% einzustellen, was 60-70 mW Leistung auf der Probenebene entspricht.
HINWEIS: Wenn der Laser mit einem Femtosekunden-Pulskompensator ausgestattet ist, verwenden Sie diesen, um die Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) zu korrigieren. Die GDD-Korrektur reduziert die Menge an Laserleistung, die für eine effiziente mcMTOC-Ablation erforderlich ist, und minimiert Lichtschäden an der Eizelle. Die GDD-Steuerung ist in der Regel in die Bildaufnahmesoftware kommerzieller Multiphotonenmikroskope integriert. - Verwenden Sie dasselbe Bildformat, denselben Zoomfaktor und dieselbe Scanfrequenz wie in Schritt 5.6. Legen Sie die Parameter für die Mittelung von Linie und Rahmen auf 1 fest.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan in der Software, um die Ablation des mcMTOC durchzuführen, indem Sie einen einzigen Laserscan des ausgewählten ROI durchführen.
- Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ergebnisse der Ablation zu überprüfen, indem Sie die Bilder der GFP-markierten Strukturen vergleichen, die vor und nach der Multiphotonen-Laserbelichtung aufgenommen wurden. Wenn die Ablation erfolgreich ist, sinkt die Intensität der GFP-Fluoreszenz im angestrebten mcMTOC auf die im Hintergrund beobachteten Werte.
- Wenn einige Fragmente einer GFP-Markierungsstruktur verbleiben, wiederholen Sie Schritt 6.4 ein- oder mehrmals, indem Sie sich auf verschiedene z-Ebenen des mcMTOC konzentrieren.
- Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ablationseffizienz durch den vollständigen Verlust von mcMTOC-assoziierten mCherry-Signalen zu überprüfen (mCh-Cep192).
- Wiederholen Sie Schritt 5.8 bis Schritt 6.7, bis alle MTOCs einer Eizelle (auf verschiedenen Fokusebenen) abgetragen sind.
HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die mCh-Cep192-Mikroinjektion als Strategie, um die mcMTOC-Depletion nach Multiphotonen-Laserbelichtung zu bestätigen und die Möglichkeit auszuschließen, dass der Verlust der GFP-Fluoreszenz durch GFP-Photobleiche verursacht wird. Die Mikroinjektion dieser Sonde ist jedoch optional und für den Ablationsvorgang nicht erforderlich.
Representative Results
Die Multiphotonen-Laserablation bietet eine effiziente Methode, um intrazelluläre Strukturen selektiv abzutragen. Die aktuelle Studie verwendete Multi-Photonen-Laserablation, um mcMTOCs in Maus-Eizellen selektiv abzubauen. Die Laserablation dezimierte die mcMTOCs effizient, wie die Reduktion der endogenen GFP-Fluoreszenz in den angestrebten mcMTOCs auf ein mit dem Hintergrund vergleichbares Niveau zeigt. Exogenes mCh-Cep192 in den anvisierten mcMTOCs wurde ebenfalls nach Laserablation abgeschafft. Die Laserablation von mcMTOCs sollte auf verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizelle durchgeführt werden (wo sich mcMTOCs befinden, Abbildung 2), um sicherzustellen, dass alle mcMTOCs innerhalb der Eizelle erschöpft sind (Abbildung 3).
Abbildung 1: Mikroinjektion von Eizellen. Mikroinjektion einer Prophase-I-blockierten Mauseizelle mit mCh-Cep192 cRNA. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Depletion von mcMTOCs in Maus-Eizellen. Repräsentative Bilder einzelner Fokusebenen. Die weißen Quadrate zeigen eine mcMTOC vor und nach der Multiphotonen-Laserablation an. Maßstabsleiste: 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Depletion von mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen in einer Mauseizelle. Repräsentative Maximalprojektionsbilder einer mcMTOC-ablatierten Mauseizelle. Maßstabsleiste: 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsdatei 1: Kompositionen von Chatot, Ziomek und Bavister (CZB) und bikarbonatfreiem minimal essential medium (MEM/PVP). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Discussion
Es gibt verschiedene Methoden, um die zytoskelettbezogenen Strukturen in den Zellen22,23,24,25 zu stören. Es ist jedoch eine Herausforderung, effiziente Techniken zu finden, um die Zielstruktur selektiv zu stören, ohne die Zelllebensfähigkeit zu beeinträchtigen. Die hier vorgestellte Multiphotonen-Laserablationsmethode ist eine effiziente Strategie, um eine selektive mechanische Störung von mcMTOCs innerhalb der Eizelle zu induzieren, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu verändern.
Die Laserablation wurde umfassend eingesetzt, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Chromosomentrennung während der Mitose und Meiose steuern22,23,26,27. Aufgrund der relativ großen Größe (>80 mm Durchmesser) von Säugetiereizellen im Vergleich zu Körperzellen28 stellt die Ablation ihrer intrazellulären Strukturen eine Herausforderung dar. Darüber hinaus beträgt das durchschnittliche mcMTOC-Volumen in Metaphase-I-Eizellen ~20 μm15, was eine zusätzliche Herausforderung darstellt. Um diese Herausforderungen zu meistern, muss eine effiziente Methode eingesetzt werden, die eine tiefere Gewebepenetration ermöglicht. Der Hauptvorteil der Verwendung des Multiphotonenlasers für die Ablation ist seine Fähigkeit, tiefer in die Zelle einzudringen und gleichzeitig Off-Target-Effekte zu minimieren29.
Um die Wirksamkeit und Effizienz der Laserablationsmethode zum Abbau der Zielstruktur zu überprüfen, wird empfohlen, ein fluoreszenzmarkiertes Protein zu verwenden, um die Zielstruktur im Laufe der Zeit (vor und nach der Ablation) zu identifizieren23. Es ist wichtig zu beachten, dass die Laserablation das gesamte mcMTOC als Struktur erschöpft, und obwohl kleinere mcMTOCs nur eine einzige Laserbelichtung benötigen, um erschöpft zu sein, können größere mcMTOCs mehr als eine Laserbelichtung auf verschiedenen Fokusebenen erfordern. Es wird auch empfohlen, eine Untergruppe von Kontroll- und mcMTOC-ablatierten Eizellen mit einem MTOC-Marker (wie γ-Tubulin, Pericentrin oder Cep192) zu fixieren und zu immunisieren, um die Effizienz der mcMTOC-Ablation weiter zu bestätigen. In Kontrolloozyten werden Bereiche des Zytoplasmas, die direkt an mcMTOCs angrenzen, sich aber nicht mit mcMTOCs überlappen, dem Laser ausgesetzt.
Dieses Experiment erfordert mehrere mcMTOC-Ablationen während der Bewegung zwischen verschiedenen Fokusebenen innerhalb der Eizellen. Daher wird dringend empfohlen, diese Technik vor der Durchführung des Experiments mehrmals zu üben, um die Experimentzeit zu minimieren und dadurch die Lebensfähigkeit der Eizellen zu erhöhen. Darüber hinaus ist es wichtig, die minimale Laserleistung zu verwenden, die ausreicht, um die mcMTOCs zu erschöpfen, ohne die Lebensfähigkeit der Eizellen zu beeinträchtigen.
Diese Technik hat einige Einschränkungen. Erstens sind konfokale Multiphotonenmikroskope relativ teurer als normale konfokale Mikroskope. Zweitens ist die Störung aller mcMTOCs auf verschiedenen Fokusebenen zeitaufwendiger als chemische oder genetische Störungen. Drittens erfordert dieses Protokoll technische Fähigkeiten, um alle mcMTOCs in kürzester Zeit abzutragen. Einmal beherrscht, bietet die Verwendung des Multiphotonenlasers jedoch eine hervorragende Strategie, um mehrere intrazelluläre Strukturen in Mauseizellen, einschließlich mcMTOCs, zu stören, was zum Verständnis der molekularen Mechanismen beiträgt, die die Positionierung der Spindel und ihre rechtzeitige Migration in Säugetiereizellen regulieren.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken allen Mitgliedern des Balboula-Labors für ihre wertvolle Hilfe und Diskussionen. Die Autoren danken Melina Schuh für das freundliche Teilen des mCherry-Cep192-Konstrukts. Diese Studie wurde von R35GM142537 (NIGMS, NIH) an AZB unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID | World precision instrument | TW100F-4 | Injection needles |
| Borosilicate glass | Fisherbrand | Cat# 13-678-20D | |
| Borosilicate glass capillarities | World Precision Instrument | Cat# TW100-6 | Holding needles |
| Bovine serum albumine | MilliporeSigma | Cat# A4503 | |
| Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope | Life Imaging Services GmbH | ||
| Calcium chlrode dihydrate | MilliporeSigma | Cat# C7902 | |
| CO2 controller | Pecon | # 0506.000 | |
| CO2 Cover HP | Pecon | # 0506.020 | |
| DL-Lactic acid | MilliporeSigma | Cat# L7900 | |
| DMi8 | Leica | N/A | Microscope |
| EDTA | MilliporeSigma | Cat# E5134 | |
| Femtojet 4i | Eppendorf | N/A | Microinjector |
| Femtotips Microloader | Fisher scientific | E5242956003 | |
| Gentamicin | MilliporeSigma | Cat# G1272 | |
| Gentamycin | MilliporeSigma | Cat# 1272 | |
| Glass bottom dish | Mat Tek Corporation | Cat# P35G-1.0-20-C | |
| Hepes | MilliporeSigma | Cat# H3784 | |
| Hepes Sodium Salt | MilliporeSigma | Cat # H3784 | |
| Hera Cell vios 160i | Thermo | N/A | CO2 incubator |
| Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B | Leica Microsystems, Inc | N/A | |
| L-Glutamine | MilliporeSigma | Cat#G8540 | |
| Magnesium sulfate dihydrate | MilliporeSigma | Cat# M7774 | |
| MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser | Spectra-Physics | N/A | |
| mCH-Cep192 cRNA | N/A | ||
| Medium Essential Medium Eagle - MEM | MilliporeSigma | Cat #M0258 | |
| Milrinone | MilliporeSigma | Cat# M4659 | |
| Mineral oil | MilliporeSigma | Cat# M5310 | |
| Minimum essential medium eagle (MEM) | MilliporeSigma | Cat# M0268 - 1L | |
| Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 | N/A | ||
| Petri dish (100 mm) | Fisherbrand | Cat# FB0875712 | |
| Petri dish (35 mm) | Corning | Cat# 430165 | |
| Petri dish (60 mm) | Falcon | Cat# 351007 | |
| Phenol Red | MilliporeSigma | Cat# P5530 | |
| Polyvinylpyrolidone | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Polyvinylpyrolidone (PVP) | MilliporeSigma | Cat# P2307 | |
| Potassium chloride | MilliporeSigma | Cat# P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | MilliporeSigma | Cat# P5655 | |
| Pregnant mare´s serum gonadotropin | Lee BioSolutions | Cat# 493-10-10 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Pyruvic acid | MilliporeSigma | Cat# P4562 | |
| Sewing needles | D.M.C | N/A | N° 5 * 16 Needles |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | Cat# S5761 | |
| Sodium chloride | MilliporeSigma | Cat# S5886 | |
| Stage-top heating insert P | Pecon | # 0426.300 | |
| Sterezoom S9i | Leica | N/A | Stereomicroscope |
| Syringe 1 mL | BD company | Cat# 309597 | |
| Taurine | MilliporeSigma | Cat# T0625 | |
| Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital | Pecon | # 0503.000 | |
| The Cube temperature controller for the cage incubator | Life Imaging Services GmbH |
References
- Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
- Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
- Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
- Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
- Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
- Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
- Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
- Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
- Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
- Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
- Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
- Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
- Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
- Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
- Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
- Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
- Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
- Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
- Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
- Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
- Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
- Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
- Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
- Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
- Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
