Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

माउस अंडाणुओं में साइटोप्लाज्मिक माइक्रोट्यूबुल्स आयोजन केंद्रों का मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64439
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Animal Sciences Research Center, University of Missouri, 2Universidad Nacional de Colombia, 3Advanced Light Microscopy Core, University of Missouri

Summary

एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो निकट-अवरक्त फेम्टोसेकंड लेजर का उपयोग करके मेटाफ़ेज़ I के दौरान माउस अंडाणुओं में साइटोप्लाज्मिक सूक्ष्मनलिका आयोजन केंद्रों की कमी को सक्षम बनाता है।

Abstract

विकासात्मक रूप से सक्षम यूप्लोइड अंडे उत्पन्न करने के लिए अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन की निष्ठा महत्वपूर्ण है। स्तनधारियों में, अंडाणु पहले मियोटिक विभाजन के प्रोफ़ेज़ I पर एक लंबी गिरफ्तारी से गुजरता है। युवावस्था के बाद और मियोटिक बहाली पर, परमाणु झिल्ली अलग हो जाती है (परमाणु लिफाफा टूटना), और धुरी मुख्य रूप से अंडाणु केंद्र में इकट्ठा होती है। असामान्य किनेटोकोर-माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) संलग्नक और एन्यूप्लोइडी से बचाने के लिए प्रारंभिक केंद्रीय स्पिंडल पोजिशनिंग आवश्यक है। केंद्रीय रूप से तैनात स्पिंडल कॉर्टेक्स की ओर समय-संवेदनशील तरीके से स्थानांतरित होता है, और यह एक छोटे ध्रुवीय शरीर को बाहर निकालने के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया है। माइटोटिक कोशिकाओं में, स्पिंडल पोजिशनिंग सेंट्रोसोम-मध्यस्थता वाले सूक्ष्म एमटी और सेल कॉर्टेक्स के बीच बातचीत पर निर्भर करती है। इसके विपरीत, माउस अंडाणुओं में क्लासिक सेंट्रोसोम की कमी होती है और इसके बजाय, इसमें कई एसेंट्रिओलर एमटी आयोजन केंद्र (एमटीओसी) होते हैं। मेटाफ़ेज़ I चरण में, माउस ओसाइट्स में एमटीओसी के दो अलग-अलग सेट होते हैं: (1) एमटीओसी जो स्पिंडल पोल (ध्रुवीय एमटीओसी) को इकट्ठा करने के लिए क्लस्टर और क्रमबद्ध होते हैं, और (2) मेटाफ़ेज़ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी (एमसीएमटीओसी) जो साइटोप्लाज्म में रहते हैं और सीधे स्पिंडल गठन में योगदान नहीं करते हैं लेकिन स्पिंडल पोजिशनिंग और समय पर स्पिंडल माइग्रेशन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यहां, एक मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन विधि को सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर चूहों से एकत्र किए गए अंडाणुओं में चुनिंदा अंतर्जात रूप से लेबल किए गए एमसीएमटीओसी को कम करने के लिए वर्णित किया गया है। यह विधि स्तनधारी अंडाणुओं में स्पिंडल पोजिशनिंग और माइग्रेशन को अंतर्निहित आणविक तंत्र की समझ में योगदान देती है।

Introduction

अगुणित युग्मक (शुक्राणु और अंडाणु) अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से उत्पन्न होते हैं, जिसमें डीएनए प्रतिकृति का एक दौर होता है, जिसके बाद दो लगातार विभाजन होते हैं जो निषेचन से पहले गुणसूत्र संख्या में कमी के लिए आवश्यक होते हैं। स्तनधारियों में, प्रारंभिक भ्रूण के जीवन के दौरान, अंडाणु पहले मियोटिक विभाजन के प्रोफ़ेज़ I के डिप्लोटेन चरण में एक लंबी गिरफ्तारी (यौवन तक) से गुजरता है, एक चरण जिसे जर्मिनल पुटिका (जीवी) चरण कहा जाता है। मियोटिक बहाली के बाद, जीवी अंडाणु परमाणु लिफाफा टूटने (एनईबीडी) से गुजरता है, और स्पिंडल को मुख्य रूप से अंडाणु केंद्र 1,2,3 पर इकट्ठा किया जाता है। बाद में, एफ-एक्टिन द्वारा संचालित, स्पिंडल अत्यधिक विषम विभाजन सुनिश्चित करने के लिए अंडाणु केंद्र से कॉर्टेक्स में समय-समय पर स्थानांतरित हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटे ध्रुवीय शरीर (पीबी) 4,5,6 के साथ एक अंडा होता है।

माइटोटिक कोशिकाओं में, सेंट्रोसोम में पेरी-सेंट्रीओलर सामग्री घटकों (पीएमसी) से घिरे सेंट्रीओल्स की एक जोड़ी होती है, जैसे कि पेरिसेंट्रिन, γ-ट्यूबुलिन, सीईपी 152, और सीईपी 1927। ये सेंट्रीओल युक्त सेंट्रोसोम द्विध्रुवी स्पिंडल गठन की निष्ठा में योगदान करतेहैं। हालांकि, कृंतकों सहित विभिन्न प्रजातियों में प्रारंभिक ओजेनेसिस के दौरान सेंट्रीओल्सखो जाते हैं। इसलिए, माउस ओसाइट्स कई एसेंट्रिओलर माइक्रोट्यूबुल्स (एमटी) आयोजन केंद्रों (एमटीओसी) 9,10 का उपयोग करके एक सेंट्रीओल-स्वतंत्र स्पिंडल असेंबली मार्ग को अपनाते हैं। मायोटिक बहाली पर, पेरिन्यूक्लियर एमटीओसी बड़ी संख्या में छोटे एमटीओसी11,12 में पुन: संघनन, खिंचाव और विखंडन के तीन अलग-अलग चरणों से गुजरते हैं। खंडित एमटीओसी को तब द्विध्रुवीय स्पिंडल10,13,14 को व्यवस्थित करने के लिए समूहित और क्रमबद्ध किया जाता है। एमटीओसी का एक और पूल एनईबीडी के दौरान साइटोप्लाज्म में स्थित है। इनमें से कुछ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी प्रवास करते हैं और स्पिंडल पोल (ध्रुवीय एमटीओसी, पीएमटीओसी) 10,11 बनाते हैं। हाल ही में, साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी के एक और उप-समूह की खोज की गई थी, जिसे मेटाफ़ेज़ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी (एमसीएमटीओसी) कहा जाता है, जो स्पिंडल पोल गठन में योगदान नहीं करते हैं लेकिन मेटाफ़ेज़ आई (मेट आई) 15 के दौरान अंडाणु साइटोप्लाज्म में रहते हैं। मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन द्वारा एमसीएमटीओसी को कम करना या ऑटोफैगी अवरोध द्वारा असामान्य रूप से उनकी संख्या में वृद्धि स्पिंडल पोजिशनिंग और माइग्रेशन कोपरेशान करती है और मेटाफेज II अंडाणुओं में एन्यूप्लोइडी की घटनाओं को बढ़ाती है।

दिलचस्प बात यह है कि एमसीएमटीओसी कई पहलुओं में पीएमटीओसी से भिन्न होतेहैं। उदाहरण के लिए, पीएमटीओसी के विपरीत, जो मुख्य रूप से पेरिन्यूक्लियर एमटीओसी से उत्पन्न होते हैं, एमसीएमटीओसी अंडाणु कॉर्टेक्स से उत्पन्न होते हैं। जब स्पिंडल अभी भी अंडाणु केंद्र में होता है, तो एमसीएमटीओसी उस पक्ष के विपरीत स्थानीयकृत होते हैं जिस पर स्पिंडल पीबी एक्सट्रूज़न15 के लिए स्थानांतरित होता है। सूक्ष्म जैसे एमटी अपेक्षाकृत बड़े अंडाणु कोशिका में कॉर्टेक्स तक नहीं पहुंच सकते हैं। इसलिए, ये एमसीएमटीओसी स्पिंडल (सूक्ष्म जैसे एमटीओसी के माध्यम से ) को कॉर्टेक्स में लंगर डालने के लिए एमटी को न्यूक्लियेट करते हैं। ये निष्कर्ष एक मॉडल का सुझाव देते हैं जिसमें एमसीएमटीओसी-न्यूक्लियेटेड एमटी बल एफ-एक्टिन-मध्यस्थता बल का मुकाबला करता है जो कॉर्टेक्स की ओर स्पिंडल माइग्रेशन को चलाता है। इन दो विरोधी बलों के बीच संतुलन केंद्रीय स्पिंडल पोजिशनिंग और समय पर स्पिंडल माइग्रेशनको विनियमित करने के लिए आवश्यक है।

आज तक, सभी जांच किए गए पीएमसी प्रोटीन (पेरिसेंट्रिन, जी-ट्यूबुलिन, सीईपी 192, और ऑरोरा काइनेज ए) एमटीओसी पूल दोनों के लिए स्थानीयकृत हैं: एमसीएमटीओसी और पीएमटीओसी15। इसलिए, पीएमटीओसी को परेशान किए बिना चुनिंदा रूप से एमसीटीओसी को परेशान करने के लिए कोई रासायनिक या आनुवंशिक दृष्टिकोण नहीं है। लेजर एब्लेशन के साथ चुनिंदा रूप से एमसीएमटीओसी को लक्षित करके इन सीमाओं को दरकिनार किया जा सकता है। माइक्रोएबलेशन के लिए विकसित लेजर-आधारित प्रौद्योगिकियों में, स्पंदित मल्टी-फोटॉन फेम्टोसेकंड लेजर फोकल प्लेन तक सीमित उनके सटीक प्रभाव, निकट-अवरक्त प्रकाश की उच्च प्रवेश गहराई और सेल को कम फोटोटॉक्सिसिटी और थर्मल क्षतिके कारण बड़ी क्षमता दिखाते हैं। यह काम एक उल्टे माइक्रोस्कोप के साथ युग्मित मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग करके माउस ओसाइट्स में एमसीएमटीओसी को हटाने के लिए एक चयनात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है।

Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को मिसौरी विश्वविद्यालय (पशु देखभाल गुणवत्ता आश्वासन रेफरी संख्या 9695) द्वारा अनुमोदित किया गया था। वर्तमान अध्ययन में 6-8 सप्ताह की आयु के सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर महिला चूहों का उपयोग किया गया था। सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर चूहों को उत्पन्न करने के लिए, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-मध्यस्थता होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत का उपयोग सीएफ -1 माउस जीनोम में ईजीएफपी रिपोर्टर जीन को एकीकृत करने के लिए किया गया था। ईजीएफपी रिपोर्टर को सीईपी 192 (एमटीओसी का एक अभिन्न घटक) 15 के सी-टर्मिनस पर जोड़ा गया था। माउस कॉलोनी को बनाए रखने के लिए, होमोजीगोस सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर चूहों का उपयोग किया गया था। सभी जानवरों को पिंजरों (चार जानवरों / पिंजरे तक) में 21 डिग्री सेल्सियस और 55% आर्द्रता पर रखा गया था, जिसमें 12 घंटे का प्रकाश / अंधेरा चक्र और भोजन और पानी तक सीमित पहुंच थी ।

1. माउस अंडाणु संग्रह

  1. संस्कृति माध्यम तैयार करें (चैटोट, ज़िओमेक, और बाविस्टर, सीजेडबी19, सामग्री की तालिका देखें), और इसे रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: CZB माध्यम को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (मीडिया संरचना के लिए पूरक फ़ाइल 1 देखें)।
  2. ग्लूटामाइन (1 एमएम) और मिल्रिनोन (2.5 एमएम) (सीजेडबी + एम) के साथ सीजेडबी माध्यम को पूरक करें ( सामग्री की तालिका देखें), और इसे इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: मिल्रिनोन एक फॉस्फोडिएस्टरेज़ अवरोधक है जो प्रोफ़ेज़ 1 पर गिरफ्तार अंडाणुओं को बनाए रखता है और मियोटिक बहाली20 को रोकता है।
  3. संग्रह माध्यम (बाइकार्बोनेट-मुक्त न्यूनतम आवश्यक माध्यम, एमईएम) तैयार करें जिसमें 3 मिलीग्राम / एमएल पॉलीविनाइलपाइरॉलिडोन (पीवीपी), 25 एमएम एचईपीईएस (पीएच 7.3) (पूरक फ़ाइल 1), और मिल्रिनोन (2.5 एमएम) (एमईएम / पीवीपी + एम, सामग्री की तालिका देखें)।
  4. संग्रह और संस्कृति व्यंजन तैयार करें, संग्रह माध्यम (एमईएम / पीवीपी + एम) के चार माइक्रोड्रॉप (100 μL) और संस्कृति (CZB + M) माध्यम के दो माइक्रोड्रॉप (100 μL) क्रमशः 60 मिमी और 35 मिमी पेट्री व्यंजनों में बनाएं, और उन्हें खनिज तेल के साथ कवर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। संग्रह डिश को स्लाइड पर गर्म रखें, और संस्कृति डिश को इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रखें।
  5. गर्भवती घोड़ी के सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी, सामग्री की तालिका देखें) के इंट्रापरिटोनियल 5 आईयू को यौन रूप से परिपक्व (6-8 सप्ताह के) सीईपी 192-ईजीएफपी रिपोर्टर महिला चूहों में अंडाणु संग्रह से 44-48 घंटे पहले इंजेक्ट करें।
  6. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों का त्याग करें, अंडाशय21 की पहचान करें और हटा दें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्ड कलेक्शन माध्यम (एमईएम / पीवीपी + एम) युक्त घड़ी ग्लास में स्थानांतरित करें।
  7. घड़ी के ग्लास के निचले भाग में 1 एमएल सिरिंज को छूकर अंडाशय को ठीक करें और इसे कई बार (~ 40 बार प्रति अंडाशय) सिलाई सुइयों का उपयोग करके छिद्रित करें ताकि अंडाणुओं को माध्यम में छोड़ा जा सके।
  8. प्लास्टिक ट्रांसफर पाइपेट का उपयोग करके, चरण 1.7 से क्यूमुलस-ओसाइट कॉम्प्लेक्स (सीओसी) वाले सभी माध्यमों को एक खाली 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  9. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, पाश्चर ग्लास पाइप का उपयोग करके सीओसी एकत्र करें, और उन्हें संग्रह डिश में स्थानांतरित करें जिसमें एमईएम / पीवीपी + एम शामिल है।
  10. एक संकीर्ण पाश्चर ग्लास पाइपेट (लगभग 100 μm व्यास) का उपयोग करके, अंडाणुओं को यांत्रिक रूप से कोमल दोहराव वाले पिपेटिंग द्वारा अलग किया जाता है, इसके बाद उन्हें CZB + M संस्कृति डिश में स्थानांतरित करने से पहले (100 μL) MEM / PVP + M (संग्रह डिश) के चार माइक्रोड्रॉप में स्थानांतरित और धोया जाता है।
  11. हवा में सीओ2 के 5% के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए निर्जलित अंडाणुओं को इनक्यूबेट करें।

2. अंडाणु माइक्रोइंजेक्शन

  1. पीवीपी + एम की 250 μL बूंद को 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश ढक्कन में रखें, और इसे खनिज तेल के साथ कवर करें।
    नोट: पेट्री डिश ढक्कन में एक कम रिम है जो माइक्रोमैनिपुलेटर को समायोजित करने के लिए अधिक जगह प्रदान करता है।
  2. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. माइक्रोस्कोप के वार्मिंग स्टेज (37 डिग्री सेल्सियस) पर माइक्रोइंजेक्शन डिश रखें।
  4. माइक्रोलोडर पिपेट टिप्स (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके इंजेक्शन सुई को 0.5 μL mCh-Cep192cRNA के साथ लोड करें, और इंजेक्शन सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर में सुरक्षित करें।
  5. डिन्यूडेड अंडाणुओं (चरण 1.11) को 250 μL माइक्रोड्रॉप (चरण 2.1) में स्थानांतरित करें।
  6. 20x या 40x उद्देश्य लेंस के तहत, इंजेक्शन की स्थिति और फोकस को समायोजित करें और अंडाणु की स्थिति के अनुसार सुइयों को पकड़ें (चित्रा 1)।
  7. माइक्रोइंजेक्शन यूनिट सेट करें, और इंजेक्शन दबाव (पीआई), मुआवजा दबाव (पीसी), और इंजेक्शन समय (टीआई) सेट करें ताकि 5-10 पीएल एमसी-सीईपी 192 सीआरएनए (एक्सोजेनस लेबल करने के लिए) इंजेक्ट किया जा सके।
  8. नाभिक को स्पर्श किए बिना अंडाणुओं को सावधानीपूर्वक इंजेक्ट करें।
  9. एक बार जब सभी अंडाणुओं को इंजेक्ट किया जाता है, तो उन्हें सीजेडबी + एम के तीन माइक्रोड्रॉप में धो लें, उन्हें कल्चर डिश (सीजेडबी + एम) में स्थानांतरित करें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ताकि एमसीएच-सीईपी 192 अभिव्यक्ति की अनुमति मिल सके।

3. अंडाणु परिपक्वता

  1. कम से कम 3 घंटे के लिए हवा में 5% सीओ2 के साथ एक इनक्यूबेटर में सीजेडबी माध्यम में ग्लूटामाइन (1 एमएम) जोड़कर परिपक्वता माध्यम तैयार करें।
  2. 35 मिमी पेट्री डिश में परिपक्वता माध्यम की दो माइक्रोड्रॉप (100 μL) बनाएं, और उन्हें खनिज तेल (परिपक्वता पकवान) के साथ कवर करें।
  3. 100 μL मिल्रिनोन-मुक्त CZB माइक्रोड्रॉप में प्रोफ़ेज़ I-अरेस्टेड अंडाणुओं को कम से कम तीन बार धोएं ताकि मिल्रिनोन को पूरी तरह से हटा दिया जा सके और मियोटिक को फिर से शुरू करने की अनुमति मिल सके।
  4. अंडाणुओं को परिपक्वता डिश में स्थानांतरित करें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर हवा में 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 5 घंटे (प्रोमेटाफेज 1 चरण) के लिए इनक्यूबेट करें।

4. एब्लेशन और इमेजिंग के लिए अंडाणु की तैयारी

  1. प्रोमेटाफ़ेज़ I अंडाणुओं (चरण 3.4) को एक ग्लास-बॉटम कल्चर डिश में स्थानांतरित करें जिसमें खनिज तेल से ढका 100 μL परिपक्वता माध्यम (चरण 3.1) होता है।

5. एब्लेशन के लिए माइक्रोस्कोप की तैयारी

  1. एब्लेशन से कम से कम 30 मिनट पहले, स्टेज इनक्यूबेटर के लिए तापमान नियंत्रक चालू करें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. सीओ2 नियंत्रक चालू करें और इसे 5% सीओ2 पर सेट करें।
  3. एक 40x तेल विसर्जन एपोक्रोमैटिक उद्देश्य का चयन करें, और विसर्जन तेल की एक छोटी बूंद लागू करें।
  4. ग्लास-बॉटम कल्चर डिश को स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर पर अंडाणुओं के साथ माउंट करें, और इनक्यूबेटर को गैस के ढक्कन से कवर करें।
  5. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में ( सामग्री की तालिका देखें), कई चरण स्थितियों की बचत को सक्षम करने वाले विकल्प का चयन करें (उदाहरण के लिए, "चिह्न परिभाषित करें और प्रयोग ढूंढें")। संचारित प्रकाश उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग करके, व्यक्तिगत अंडाणुओं पर ध्यान केंद्रित करें और उनकी स्थिति को बचाएं।
  6. छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में, XYZ स्कैनिंग मोड का चयन करें, छवि प्रारूप को 256 x 256 पिक्सेल पर सेट करें, ज़ूम फैक्टर को 2.5x - 3.0x पर सेट करें, और 600 Hz की स्कैनिंग आवृत्ति का चयन करें। यह लगभग 1.6 μs के पिक्सेल निवास समय से मेल खाती है।
  7. लेजर शक्ति के लगभग 10% पर 488 एनएम उत्तेजना लेजर लाइन सेट करें (जो नमूना स्तर पर 4.0 μW से मेल खाती है) ( सामग्री की तालिका देखें), और एमटीओसी से जीएफपी सिग्नल का निरीक्षण करने के लिए 500-550 एनएम के वर्णक्रमीय बैंडविड्थ का उपयोग करें। एमचेरी-टैग किए गए सीईपी 192 से प्रतिदीप्ति के एक साथ अवलोकन के लिए, लेजर शक्ति के लगभग 8% पर 585 एनएम उत्तेजना लेजर लाइन सेट करें (जो नमूना स्तर पर 10.7 μW से मेल खाती है), और 595-645 एनएम के वर्णक्रमीय बैंडविड्थ के लिए एक और डिटेक्टर सेट का उपयोग करें।
    नोट: अंडाणु सीमाओं का समवर्ती रूप से पता लगाने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के संचारित प्रकाश डिटेक्टर (टीएलडी) का उपयोग करना सहायक है।
  8. लाइव स्कैनिंग मोड और जेड-ड्राइव के मैनुअल नियंत्रण का उपयोग करके, एमटीओसी के लिए अंडाणु की स्क्रीन करें।
  9. एक बार जब एक एमसीएमटीओसी का पता चल जाता है, तो इसके चारों ओर रुचि का एक वर्ग क्षेत्र (आरओआई) खींचें।

6. एमसीएमटीओसी का पृथक्करण

  1. एक फेम्टोसेकंड लेजर को 740 एनएम तरंग दैर्ध्य पर सेट करें।
    नोट: लेजर तरंग दैर्ध्य माइक्रोस्कोप और लेजर स्थितियों के अनुसार बदला जा सकता है।
  2. नमूना विमान पर 60-70 मेगावाट शक्ति के अनुरूप लेजर शक्ति को 70% -80% तक सेट करने के लिए मल्टी-फोटॉन माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के इलेक्ट्रो-ऑप्टिक मॉड्यूलेटर का उपयोग करें।
    नोट: यदि लेजर फेम्टोसेकंड पल्स प्रतिपूरक से लैस है, तो समूह देरी फैलाव (जीडीडी) के लिए इसे सही करने के लिए इसका उपयोग करें। जीडीडी सुधार कुशल एमसीएमटीओसी एब्लेशन के लिए आवश्यक लेजर शक्ति की मात्रा को कम करता है और अंडाणु को फोटोडैमेज को कम करता है। जीडीडी नियंत्रण आमतौर पर वाणिज्यिक मल्टी-फोटॉन माइक्रोस्कोप के छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ एकीकृत होता है।
  3. चरण 5.6 में एक ही छवि प्रारूप, ज़ूम कारक और स्कैनिंग आवृत्ति का उपयोग करें। लाइन सेट करें और औसत मापदंडों को 1 पर फ्रेम करें।
  4. चयनित आरओआई के एकल लेजर स्कैन का संचालन करके एमसीएमटीओसी के पृथक्करण को करने के लिए सॉफ्टवेयर में स्कैन बटन पर क्लिक करें।
  5. मल्टी-फोटॉन लेजर एक्सपोज़र से पहले और बाद में ली गई जीएफपी-लेबल संरचनाओं की छवियों की तुलना करके एब्लेशन के परिणामों की समीक्षा करने के लिए चरण 5.7 से चैनल सेटिंग्स का उपयोग करें। यदि पृथक्करण सफल होता है, तो लक्षित एमसीएमटीओसी में जीएफपी प्रतिदीप्ति की तीव्रता पृष्ठभूमि में देखे गए स्तरों तक कम हो जाती है।
  6. यदि जीएफपी-लेबलिंग संरचना के कुछ टुकड़े रहते हैं, तो एमसीएमटीओसी के विभिन्न जेड विमानों पर ध्यान केंद्रित करके चरण 6.4 को एक या अधिक बार दोहराएं।
  7. mcMTOC से जुड़े mCherry संकेतों (mCh-Cep192) के पूर्ण नुकसान से पृथक्करण दक्षता को सत्यापित करने के लिए चरण 5.7 से चैनल सेटिंग्स का उपयोग करें।
  8. चरण 5.8 को चरण 6.7 तक दोहराएं जब तक कि एक अंडाणु (विभिन्न फोकल विमानों पर) के सभी एमटीओसी को हटा न दिया जाए।
    नोट: यह प्रोटोकॉल मल्टी-फोटॉन लेजर एक्सपोजर के बाद एमसीएमटीओसी की कमी की पुष्टि करने और इस संभावना को बाहर करने की संभावना को बाहर करने के लिए एक रणनीति के रूप में एमसीएच-सीईपी 192 माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करता है कि जीएफपी फोटोब्लीचिंग के कारण जीएफपी फ्लोरेसेंस का नुकसान होता है। हालांकि, इस जांच का माइक्रोइंजेक्शन वैकल्पिक है और एब्लेशन प्रक्रिया के लिए आवश्यक नहीं है।

Representative Results

मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन चुनिंदा इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को अलग करने के लिए एक कुशल विधि प्रदान करता है। वर्तमान अध्ययन ने माउस अंडाणुओं में चुनिंदा रूप से एमसीएमटीओसी को कम करने के लिए मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन का उपयोग किया। लेजर एब्लेशन ने एमसीएमटीओसी को कुशलता पूर्वक कम कर दिया, जैसा कि लक्षित एमसीएमटीओसी में अंतर्जात जीएफपी फ्लोरेसेंस में कमी से पृष्ठभूमि के बराबर स्तर तक दिखाया गया है। लक्षित एमसीएमटीओसी में बहिर्जात एमसीएच-सीईपी 192 को लेजर एब्लेशन के बाद भी समाप्त कर दिया गया था। एमसीएमटीओसी के लेजर एब्लेशन को अंडाणु के भीतर विभिन्न फोकल विमानों पर किया जाना चाहिए (जहां एमसीएमटीओसी स्थित हैं, चित्रा 2) यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडाणु के भीतर सभी एमसीएमटीओसी समाप्त हो गए हैं (चित्रा 3)।

Figure 1
चित्र 1: अंडाणु माइक्रोइंजेक्शन। "mCh-Cep192 cRNA के साथ प्रोफ़ेज़ I-अरेस्टेड माउस अंडाणु का माइक्रोइंजेक्शन". स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: माउस अंडाणुओं में एमसीएमटीओसी की कमी। एकल फोकल विमानों की प्रतिनिधि छवियां। सफेद वर्ग मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन से पहले और बाद में एक एमसीएमटीओसी का संकेत देते हैं। स्केल पट्टी: 40 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: माउस अंडाणु में विभिन्न फोकल विमानों पर एमसीएमटीओसी की कमी। एमसीएमटीओसी-एब्लेटेड माउस अंडाणु की प्रतिनिधि अधिकतम प्रक्षेपण छवियां। स्केल पट्टी: 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: चैटोट, ज़िओमेक और बाविस्टर (सीजेडबी) और बाइकार्बोनेट-मुक्त न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम / पीवीपी) की रचनाएं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

कोशिकाओं22,23,24,25 के भीतर साइटोस्केलेटन से संबंधित संरचनाओं को परेशान करने के लिए विभिन्न तरीके मौजूद हैं। हालांकि, सेल व्यवहार्यता से समझौता किए बिना लक्षित संरचना को चुनिंदा रूप से परेशान करने के लिए कुशल तकनीकों को ढूंढना चुनौतीपूर्ण है। यहां प्रस्तुत मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन विधि अंडाणु व्यवहार्यता को बदले बिना अंडाणु के भीतर एमसीएमटीओसी के लिए चयनात्मक यांत्रिक गड़बड़ी को प्रेरित करने के लिए एक कुशल रणनीति है।

माइटोसिस और अर्धसूत्रीविभाजन22,23,26,27 के दौरान गुणसूत्र अलगाव को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के लिए लेजर एब्लेशन का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। दैहिक कोशिकाओं 28 की तुलना में स्तनधारी अंडाणुओं के अपेक्षाकृत बड़े आकार (>80 मिमी व्यास) के कारण, उनकी इंट्रासेल्युलर संरचनाओं का पृथक्करण एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, मेटाफ़ेज़ आई ओसाइट्स में औसत एमसीएमटीओसी मात्रा ~ 20 μm15 है, जो एक अतिरिक्त चुनौती का प्रतिनिधित्व करती है। इन चुनौतियों को दूर करने के लिए एक कुशल तरीका अपनाया जाना चाहिए जो गहरी ऊतक प्रवेश प्रदान करता है। एब्लेशन के लिए मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग करने का मुख्य लाभ ऑफ-टारगेट प्रभाव29 को कम करते हुए सेल में गहराई तक पहुंचने की क्षमता है।

लक्षित संरचना को कम करने के लिए लेजर एब्लेशन विधि की प्रभावकारिता और दक्षता को सत्यापित करने के लिए, समय के साथ लक्षित संरचना की पहचान करने के लिए एक फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (एब्लेशन से पहले और बाद में)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि लेजर एब्लेशन एक संरचना के रूप में पूरे एमसीएमटीओसी को कम करता है, और हालांकि छोटे एमसीएमटीओसी को समाप्त होने के लिए केवल एक लेजर एक्सपोजर की आवश्यकता होती है, बड़े एमसीएमटीओसी को विभिन्न फोकल विमानों में एक से अधिक लेजर एक्सपोजर की आवश्यकता हो सकती है। एमसीएमटीओसी एब्लेशन की दक्षता की पुष्टि करने के लिए एमटीओसी मार्कर (जैसे γ-ट्यूबुलिन, पेरिसेंट्रिन, या सीईपी 192) के साथ नियंत्रण और एमसीएमटीओसी-एब्लेटेड ओसाइट्स के एक उप-समूह को ठीक करने और इम्यूनोलेबल करने की भी सिफारिश की जाती है। नियंत्रण अंडाणुओं में, साइटोप्लाज्म के क्षेत्रों को एमसीएमटीओसी के साथ निकट लेकिन अतिव्यापी नहीं किया जाएगा।

इस प्रयोग के लिए अंडाणुओं के भीतर विभिन्न फोकल विमानों के बीच चलते हुए कई एमसीएमटीओसी एब्लेशन की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रयोग के समय को कम करने के लिए प्रयोग को निष्पादित करने से पहले इस तकनीक का कई बार अभ्यास करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, जिससे अंडाणु व्यवहार्यता बढ़ जाती है। इसके अलावा, न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो अंडाणु व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना एमसीएमटीओसी को कम करने के लिए पर्याप्त है।

इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, मल्टी-फोटॉन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप नियमित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की तुलना में अपेक्षाकृत अधिक महंगे हैं। दूसरा, विभिन्न फोकल विमानों पर सभी एमसीएमटीओसी को परेशान करना रासायनिक या आनुवंशिक गड़बड़ी की तुलना में अधिक समय लेने वाला है। तीसरा, इस प्रोटोकॉल के लिए कम से कम समय में सभी MCMTOCs को समाप्त करने के लिए तकनीकी कौशल की आवश्यकता होती है। हालांकि, एक बार महारत हासिल करने के बाद, मल्टी-फोटॉन लेजर का उपयोग माउस ओसाइट्स में कई इंट्रासेल्युलर संरचनाओं को परेशान करने के लिए एक उत्कृष्ट रणनीति प्रदान करता है, जिसमें एमसीएमटीओसी भी शामिल हैं, जो स्पिंडल पोजिशनिंग को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र की समझ में योगदान देते हैं और स्तनधारी अंडाणुओं में इसके समय पर प्रवास करते हैं।

Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

लेखक अपनी मूल्यवान सहायता और चर्चाओं के लिए बालबौला प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। लेखकों ने एमचेरी-सीईपी 192 निर्माण को साझा करने के लिए मेलिना शुह को धन्यवाद दिया। इस अध्ययन को आर 35 जीएम 142537 (एनआईजीएमएस, एनआईएच) द्वारा एजेडबी के लिए समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 IN thinwall GL 1.0 OD/.75 ID World precision instrument  TW100F-4 Injection needles 
Borosilicate glass  Fisherbrand  Cat# 13-678-20D
Borosilicate glass capillarities  World Precision Instrument  Cat# TW100-6 Holding needles 
Bovine serum albumine  MilliporeSigma  Cat# A4503
Cage incubator for Leica DMI6000 B microscope Life Imaging Services GmbH
Calcium chlrode dihydrate MilliporeSigma  Cat# C7902
CO2 controller  Pecon # 0506.000
CO2 Cover HP Pecon # 0506.020
DL-Lactic acid  MilliporeSigma  Cat# L7900
DMi8 Leica  N/A Microscope 
EDTA MilliporeSigma  Cat# E5134
Femtojet 4i Eppendorf  N/A Microinjector 
Femtotips Microloader Fisher scientific  E5242956003
Gentamicin  MilliporeSigma  Cat# G1272
Gentamycin  MilliporeSigma  Cat# 1272
Glass bottom dish  Mat Tek Corporation Cat# P35G-1.0-20-C 
Hepes  MilliporeSigma  Cat# H3784
Hepes Sodium Salt MilliporeSigma Cat # H3784
Hera Cell vios 160i Thermo  N/A CO2 incubator 
Leica TCP SP8 spectral laser scanning confocal micorscope with inverted stand DMI6000 B Leica Microsystems, Inc N/A 
L-Glutamine  MilliporeSigma Cat#G8540
Magnesium sulfate dihydrate MilliporeSigma  Cat# M7774
MaiTai DeepSee Ti-Sapphire femtosecond laser Spectra-Physics N/A
mCH-Cep192 cRNA N/A
Medium Essential Medium Eagle - MEM MilliporeSigma Cat #M0258
Milrinone MilliporeSigma Cat# M4659
Mineral oil MilliporeSigma Cat# M5310
Minimum essential medium eagle (MEM) MilliporeSigma  Cat# M0268 - 1L
Mouse: Cep192-eGFP reporter CF-1 N/A
Petri dish (100 mm) Fisherbrand  Cat# FB0875712
Petri dish (35 mm) Corning  Cat# 430165
Petri dish (60 mm) Falcon  Cat# 351007
Phenol Red  MilliporeSigma  Cat# P5530
Polyvinylpyrolidone MilliporeSigma Cat# P2307
Polyvinylpyrolidone (PVP) MilliporeSigma  Cat# P2307
Potassium chloride  MilliporeSigma  Cat# P5405
Potassium phosphate monobasic  MilliporeSigma  Cat# P5655
Pregnant mare´s serum gonadotropin  Lee BioSolutions Cat# 493-10-10 
Pyruvic acid  MilliporeSigma  Cat# P4562
Pyruvic acid  MilliporeSigma  Cat# P4562
Sewing needles  D.M.C N/A N° 5 * 16 Needles 
Sodium bicarbonate  MilliporeSigma  Cat# S5761
Sodium chloride  MilliporeSigma  Cat# S5886
Stage-top heating insert P Pecon # 0426.300
Sterezoom S9i Leica  N/A Stereomicroscope 
Syringe 1 mL BD company  Cat# 309597
Taurine  MilliporeSigma  Cat# T0625
Temperature controller Tempcontrol 37-2 digital Pecon # 0503.000
The Cube temperature controller for the cage incubator Life Imaging Services GmbH

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bennabi, I., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Meiotic spindle assembly and chromosome segregation in oocytes. Journal of Cell Biology. 215 (5), 611-619 (2016).
  2. Hashimoto, N., Kishimoto, T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation-promoting factor during mouse oocyte maturation. Development Biology. 126 (2), 242-252 (1988).
  3. Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
  4. Azoury, J., Verlhac, M. H., Dumont, J. Actin filaments: Key players in the control of asymmetric divisions in mouse oocytes. Biology of the Cell. 101 (2), 69-76 (2009).
  5. Li, H., Guo, F., Rubinstein, B., Li, R. Actin-driven chromosomal motility leads to symmetry breaking in mammalian meiotic oocytes. Nature Cell Biology. 10 (11), 1301-1308 (2008).
  6. Schuh, M., Ellenberg, J. A new model for asymmetric spindle positioning in mouse oocytes. Current Biology. 18 (24), 1986-1992 (2008).
  7. Pimenta-Marques, A., Bettencourt-Dias, M. Pericentriolar material. Current Biology. 30 (12), 687-689 (2020).
  8. Hinchcliffe, E. H. The centrosome and bipolar spindle assembly: Does one have anything to do with the other. Cell Cycle. 10 (22), 3841-3848 (2011).
  9. Szollosi, D., Calarco, P., Donahue, R. P. Absence of centrioles in the first and second meiotic spindles of mouse oocytes. Journal of Cell Science. 11 (2), 521-541 (1972).
  10. Schuh, M., Ellenberg, J. Self-organization of MTOCs replaces centrosome function during acentrosomal spindle assembly in live mouse oocytes. Cell. 130 (3), 484-498 (2007).
  11. Clift, D., Schuh, M. A three-step MTOC fragmentation mechanism facilitates bipolar spindle assembly in mouse oocytes. Nature Communications. 6, 7217 (2015).
  12. Luksza, M., Queguigner, I., Verlhac, M. H., Brunet, S. Rebuilding MTOCs upon centriole loss during mouse oogenesis. Developmental Biology. 382 (1), 48-56 (2013).
  13. Balboula, A. Z., et al. Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes. Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).
  14. Breuer, M., et al. HURP permits MTOC sorting for robust meiotic spindle bipolarity, similar to extra centrosome clustering in cancer cells. Journal of Cell Biology. 191 (7), 1251-1260 (2010).
  15. Londoño-Vásquez, D., Rodriguez-Lukey, K., Behura, S. K., Balboula, A. Z. Microtubule organizing centers regulate spindle positioning in mouse oocytes. Developmental Cell. 57 (2), 197-211 (2022).
  16. Konig, K., Riemann, I., Fischer, P., Halbhuber, K. J. Intracellular nanosurgery with near infrared femtosecond laser pulses. Cellular and Molecular Biology. 45 (2), 195-201 (1999).
  17. Galbraith, J. A., Terasaki, M. Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation. Molecular Biology of the Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).
  18. Maghelli, N., Tolic-Norrelykke, I. M. Laser ablation of the microtubule cytoskeleton: Setting up and working with an ablation system. Methods in Molecular Biology. 777, 261-271 (2011).
  19. Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D., Lewis, J. L., Torres, I. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. Journal of Reproduction and Fertility. 86 (2), 679-688 (1989).
  20. Tsafriri, A., Chun, S. Y., Zhang, R., Hsueh, A. J., Conti, M. Oocyte maturation involves compartmentalization and opposing changes of cAMP levels in follicular somatic and germ cells: Studies using selective phosphodiesterase inhibitors. Developmental Biology. 178 (2), 393-402 (1996).
  21. Greaney, J., Subramanian, G. N., Ye, Y., Homer, H. Isolation and in vitro culture of mouse oocytes. Bio Protocol. 11 (15), 4104 (2021).
  22. Khodjakov, A., Cole, R. W., Rieder, C. L. A synergy of technologies: Combining laser microsurgery with green fluorescent protein tagging. Cell Motility and the Cytoskeleton. 38 (4), 311-317 (1997).
  23. Pavin, N., Tolic, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  24. Khodjakov, A., Cole, R. W., Oakley, B. R., Rieder, C. L. Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biology. 10 (2), 59-67 (2000).
  25. Aist, J. R., Liang, H., Berns, M. W. Astral and spindle forces in PtK2 cells during anaphase B: a laser microbeam study. Journal of Cell Science. 104, 1207-1216 (1993).
  26. Bennabi, I., Manil-Segalen, M. Laser Ablation of microtubule-chromosome attachment in mouse oocytes. Methods in Molecular Biology. 1818, 153-161 (2018).
  27. Milas, A., Jagric, M., Martincic, J., Tolic, I. M. Optogenetic reversible knocksideways, laser ablation, and photoactivation on the mitotic spindle in human cells. Methods in Cell Biology. 145, 191-215 (2018).
  28. Warzych, E., Lipinska, P. Energy metabolism of follicular environment during oocyte growth and maturation. Journal of Reproduction and Development. 66 (1), 1-7 (2020).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).

Tags

विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 189 अंडाणु मेटाफ़ेज़ साइटोप्लाज्मिक एमटीओसी अर्धसूत्रीविभाजन लेजर एब्लेशन
माउस अंडाणुओं में साइटोप्लाज्मिक माइक्रोट्यूबुल्स आयोजन केंद्रों का मल्टी-फोटॉन लेजर एब्लेशन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Londoño-Vásquez, D.,… More

Londoño-Vásquez, D., Jurkevich, A., Balboula, A. Z. Multi-Photon Laser Ablation of Cytoplasmic Microtubule Organizing Centers in Mouse Oocytes. J. Vis. Exp. (189), e64439, doi:10.3791/64439 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter