Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

بروتوكول تطهير فعال لدراسة تطور البذور في الطماطم (Solanum lycopersicum L.)

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64445
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

Summary

تعتبر بذور الطماطم نموذجا مهما لدراسة علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي أثناء تكاثر النبات. هذا البروتوكول مفيد لإزالة بذور الطماطم في مراحل النمو المختلفة لمراقبة البنية الجنينية الدقيقة.

Abstract

الطماطم (Solanum lycopersicum L.) هي واحدة من المحاصيل النقدية الرئيسية في جميع أنحاء العالم. تعتبر بذور الطماطم نموذجا مهما لدراسة علم الوراثة وعلم الأحياء التنموي أثناء تكاثر النبات. غالبا ما يتم إعاقة تصور البنية الجنينية الدقيقة داخل بذور الطماطم عن طريق صمغ معطف البذور ، والتكامل متعدد الطبقات ، والسويداء السميك الجدران ، والذي يحتاج إلى حل عن طريق التضمين الشاق. البديل الأبسط هو استخدام تقنيات إزالة الأنسجة التي تحول البذور شبه شفافة باستخدام عوامل كيميائية. على الرغم من أن إجراءات المقاصة التقليدية تسمح برؤية عميقة للبذور الأصغر ذات طبقة البذور الرقيقة ، إلا أن إزالة بذور الطماطم لا تزال تمثل تحديا تقنيا ، خاصة في مراحل النمو المتأخرة.

يظهر هنا بروتوكول تطهير سريع وموفر للعمالة لمراقبة نمو بذور الطماطم من 3 إلى 23 يوما بعد الإزهار عندما يكون التشكل الجنيني على وشك الاكتمال. تجمع هذه الطريقة بين محلول المقاصة القائم على هيدرات الكلورال المستخدم على نطاق واسع في أرابيدوبسيس مع تعديلات أخرى ، بما في ذلك إغفال تثبيت الفورمالين - الأسيتو - الكحول (FAA) ، وإضافة معالجة هيبوكلوريت الصوديوم للبذور ، وإزالة صمغ معطف البذور المخفف ، والغسيل والمعالجة بالتفريغ. يمكن تطبيق هذه الطريقة للإزالة الفعالة لبذور الطماطم في مراحل النمو المختلفة وهي مفيدة في المراقبة الكاملة لعملية تطوير البذور الطافرة بدقة مكانية جيدة. يمكن أيضا تطبيق بروتوكول المقاصة هذا على التصوير العميق للأنواع الأخرى المهمة تجاريا في Solanaceae.

Introduction

الطماطم (S. lycopersicum L.) هي واحدة من أهم محاصيل الخضروات في جميع أنحاء العالم ، حيث يبلغ إنتاجها 186.8 مليون طن من الفواكه السمين من 5.1 مليون هكتار في عام 20201. ينتمي إلى عائلة Solanaceae الكبيرة مع حوالي 2716 نوعا2 ، بما في ذلك العديد من المحاصيل المهمة تجاريا مثل الباذنجان والفلفل والبطاطس والتبغ. الطماطم المزروعة هي نوع ثنائي الصيغة الصبغية (2n = 2x = 24) بحجم جينوم يبلغ حوالي 900 ميجا بايت3. لفترة طويلة ، تم بذل جهد كبير نحو تدجين الطماطم وتكاثرها عن طريق اختيار السمات المرغوبة من Solanum spp. هناك أكثر من 5000 مدخل طماطم مدرج في مركز موارد علم الوراثة للطماطم ويتم تخزين أكثر من 80000 مادة وراثية من الطماطم في جميع أنحاء العالم4. نبات الطماطم معمر في الدفيئة وينتشر بالبذور. تتكون بذرة الطماطم الناضجة من ثلاث حجرات رئيسية: جنين كامل النمو ، السويداء الخلوي المتبقي ، ومعطف البذور الصلب 5,6 (الشكل 1 أ). بعد الإخصاب المزدوج ، يسبق تطور السويداء من النوع الخلوي تطور الزيجوت. في ~ 5-6 أيام بعد الإزهار (DAF) ، لوحظ الجنين ثنائي الخلية لأول مرة عندما يتكون السويداء من ستة إلى ثمانية نوى7. في Solanum pimpinellifolium ، يقترب الجنين من حجمه النهائي بعد 20 DAF ، والبذور قابلة للإنبات بعد 32 DAF8. مع تطور الجنين ، يتم امتصاص السويداء تدريجيا وتبقى كمية صغيرة فقط من السويداء في البذور. يتكون السويداء المتبقي من السويداء micropylar المحيطة بطرف الجذر ، والسويداء الجانبي في بقية البذور 9,10. تم تطوير طبقة البذور الخارجية من البشرة الخارجية السميكة والخشنة للتكامل ، ومع الطبقات الميتة من بقايا التكامل ، فإنها تشكل قشرة صلبة لحماية الجنين والسويداء5.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لبذرة ناضجة في Solanum lycopersicum و Arabidopsis thaliana. أ: التشريح الطولي لبذور الطماطم الناضجة. (ب) التشريح الطولي لبذرة أرابيدوبسيس ناضجة. يبلغ حجم بذور الطماطم الناضجة حوالي 70 مرة أكبر من بذور أرابيدوبسيس. قضبان المقياس = (أ) 400 ميكرومتر ، (ب) 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يعتمد إنتاج بذور الطماطم عالية الجودة على التنسيق بين الجنين والسويداء ومكونات بذور الأم11. يتطلب تشريح الجينات والشبكات الرئيسية في تطوير البذور تسجيلا ظاهريا عميقا وكاملا للبذور الطافرة. يتم تطبيق تقنيات التضمين التقليدية ، مثل القسم شبه الرقيق وقسم البارافين ، على نطاق واسع على بذور الطماطم لمراقبة الهياكل المحلية والدقيقة للجنين12،13،14،15. ومع ذلك ، فإن تحليل تطور البذور من المقاطع الرقيقة عادة ما يكون شاقا ويفتقر إلى الدقة المكانية للمحور z. بالمقارنة ، تعد إزالة الأنسجة طريقة سريعة وفعالة لتحديد المرحلة التنموية لعيوب الجنين التي من المرجح أن تحدث16. تقلل طريقة المقاصة من عتامة الأنسجة الداخلية عن طريق تجانس معامل الانكسار مع واحد أو أكثر من العوامل الكيميائية الحيوية16. تسمح إزالة الأنسجة الكاملة بمراقبة بنية الأنسجة النباتية دون تدمير سلامتها ، وأصبح الجمع بين تقنية المقاصة والتصوير ثلاثي الأبعاد حلا مثاليا للحصول على معلومات حول التشكل والحالة التنموية لعضو النبات17,18. على مر السنين ، تم استخدام تقنيات إزالة البذور في أنواع نباتية مختلفة ، بما في ذلك Arabidopsis thaliana و Hordeum vulgare و Beta vulgaris19،20،21،22،23. من بين هذه ، كانت تقنية إزالة البويضات الكاملة نهجا فعالا لدراسة تطور بذور Arabidopsis ، نظرا لصغر حجمها ، و 4-5 طبقات من خلية معطف البذور ، والسويداء من النوع النووي24,25. مع التحديث المستمر لمخاليط المقاصة المختلفة ، مثل ظهور محلول هوير26 ، تم تصوير الهياكل الداخلية لبويضة الشعير بدرجة عالية من الوضوح على الرغم من أن السويداء يشكل الجزء الأكبر من البذور. يمكن ملاحظة التطور الجنيني لبنجر السكر عن طريق التطهير مع المعالجة الفراغية والتليين بحمض الهيدروكلوريك19. ومع ذلك ، على عكس الأنواع المذكورة أعلاه ، لم يتم الإبلاغ عن الملاحظات الجنينية عن طريق بروتوكولات الإزالة في بذور الطماطم. هذا يمنع التحقيق التفصيلي في التطور الجنيني والبذور للطماطم.

يستخدم هيدرات الكلورال بشكل شائع كمحلول تطهير يسمح بعرض الأنسجة والخلايا المغمورة على مستويات بصرية مختلفة ، ويحافظ بشكل كبير على الخلايا أو مكونات الأنسجة27،28،29. تم استخدام بروتوكول المقاصة القائم على هيدرات الكلورال بنجاح لإزالة البذور بالكامل لمراقبة الجنين والسويداء في Arabidopsis21,28. ومع ذلك ، فإن محلول المقاصة هذا ليس فعالا في إزالة بذور الطماطم ، والتي هي أكثر نفاذية من بذور Arabidopsis. تشمل الحواجز المادية: (1) يحتوي تكامل الطماطم على ما يقرب من 20 طبقة خلية من 3 إلى 15 DAF 30,31 ، (2) السويداء الطماطم من النوع الخلوي ، وليس من النوعالنووي 32 ، و (3) بذور الطماطم أكبر بحوالي 70 مرة في الحجم 33,34 و (4) تنتج كميات كبيرة من صمغ معطف البذور ، مما يمنع تغلغل الكواشف المطهرة ويؤثر على تصور خلايا الجنين.

لذلك ، يقدم هذا التقرير طريقة محسنة للمقاصة القائمة على هيدرات الكلورال لإزالة بذور الطماطم بالكامل في مراحل مختلفة ، مما يسمح بالتصوير العميق لعملية تطور الجنين (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الحلول

  1. قم بإعداد مثبت FAA بإضافة 2.5 مل من 37٪ فورمالديهايد ، و 2.5 مل من حمض الخليك الجليدي ، و 45 مل من 70٪ إيثانول في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. دوامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. تحضير مثبت FAA طازجا قبل الاستخدام مباشرة.
    تنبيه: 37٪ فورمالديهايد مادة أكالة ويحتمل أن تكون مسرطنة إذا تعرضت أو استنشقت. يجب إجراء المثبت في غطاء دخان أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  2. تحضير محلول المقاصة بإضافة 5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ ، و 40 جم من هيدرات الكلورال ، و 10 مل من الماء المقطر في زجاجة زجاجية سعة 100 مل ملفوفة بورق القصدير. يذوب باستخدام محرك مغناطيسي طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. يمكن تخزين المحلول المحضر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    تنبيه: هيدرات الكلورال مادة مسرطنة ولها رائحة نفاذة. قم بإجراء التجربة في غطاء دخان وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة. من السهل تسييل هيدرات الكلورال في الهواء ويجب عدم تخزينها بكميات كبيرة. يمكن أن يتحلل محلول المقاصة عند تعرضه للضوء ويجب إبعاده عن الضوء.
  3. قم بإعداد المحلول المطهر بإضافة 10 مل من هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 6٪ ، و 40 مل من الماء المقطر ، و 50 ميكرولتر من Tween-20 في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. دوامة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تحضير محلول مطهر طازج قبل الاستخدام مباشرة.
    ملاحظة: قد ينخفض محتوى الكلور الفعال في هيبوكلوريت الصوديوم الذي تم وضعه لفترة طويلة ، ويمكن زيادة محتوى هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 6٪ وفقا للوضع الفعلي.

2. جمع البذور

  1. زرع بذور الطماطم (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom ، انظر جدول المواد) في أحواض 8 سم × 8 سم × 8 سم مربعة مليئة بمزيج 1: 1 من تربة مغذيات الزهور والركيزة (v / v) (انظر جدول المواد) ، وتنمو في غرفة نمو مع فترات ضوئية / مظلمة 16/8 ساعة عند 24 ± 2 درجة مئوية (يوم) و 18 ± 2 درجة مئوية (ليلا) ، 60٪ -70٪ رطوبة نسبية ، وشدة ضوء 4000 لوكس. بعد حوالي 6 أسابيع ، دخلت النباتات مرحلة الإزهار.
  2. ضع علامة على تاريخ ازدهار الزهور المستقلة عند النقش (زاوية فتح البتلات 90 درجة) ، وسجل اليوم التالي للإزهار (DAF).
  3. حصاد الثمار من 3 إلى 23 نباتات الطماطم DAF ووضعها على الفور على الجليد. قسم الثمار (البذور أو الأجنة) من 3 إلى 23 DAF إلى ثمار مبكرة (3-10 DAF) ، ومتوسطة (11-16 DAF) ، ومتأخرة (17-23 DAF) (بذور أو أجنة).
    ملاحظة: لا تجمع الكثير من الفاكهة في وقت واحد وتأكد من تجريد البذور الموجودة في كل فاكهة في غضون 1 ساعة لمزيد من العلاج.
  4. بالنسبة للفواكه المبكرة ، قم بكسر الفاكهة ووضعها على شريحة ، واجمع البذور الطازجة بعناية باستخدام ملقط دقيق تحت المجهر المجسم (انظر جدول المواد) بتكبير 1x إلى 4x. بالنسبة للفواكه المتوسطة والمتأخرة ، قم بكسر الفاكهة وجمع البذور الطازجة مباشرة باستخدام ملقط دقيق.

3. إزالة البذور القائمة على هيدرات الكلورال

ملاحظة: تمت مقارنة35 بروتوكولا تقليديا وبروتوكولا محسنا في هذه الدراسة من أجل كفاءة إزالة البذور.

  1. المقاصة باستخدام بروتوكول تقليدي
    1. ضع البذور الطازجة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4) على الفور في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على مثبت FAA سعة 1.5 مل واحتضانها على شاكر مداري (5 دورات في الدقيقة ، انظر جدول المواد) لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    2. قم بتجفيف هذه البذور في سلسلة إيثانول 70٪ و 95٪ و 100٪ إيثانول (v / v) لمدة 1 ساعة لكل منها على شاكر مداري (5 دورة في الدقيقة).
    3. ضع البذور في 3-5 قطرات من محلول المقاصة (~ 100 ميكرولتر) على الشريحة وقم بتغطية العينة برفق باستخدام غطاء غطاء. استبدل الشريحة بشريحة مقعرة واحدة (انظر جدول المواد) للبذور المتوسطة والمتأخرة.
    4. احتفظ بهذه الشرائح أو الشرائح المقعرة المفردة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة (3 DAF) أو 2 ساعة (6 DAF) أو يوم واحد (9 DAF) أو 3 أيام (12 DAF) أو 7 أيام (14 إلى 22 DAF) اعتمادا على مراحل تطوير مادة البذور (كلما كانت المواد أصغر ، زادت سرعة الإزالة).
    5. راقب العينات باستخدام مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC) المجهز بكاميرا رقمية (انظر جدول المواد) بتكبير 10x و 20x و 40x. اضبط وحسن سطوع الضوء المرسل وشريط تمرير DIC وفتحة المكثف في الوقت الفعلي لكل عينة والتقاط الصور.
  2. المقاصة باستخدام البروتوكول الأمثل
    1. ضع البذور الطازجة (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4) مباشرة في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل يحتوي على محلول مطهر سعة 1.5 مل (الخطوة 1.3).
      ملاحظة: يختلف عدد البذور التي تم جمعها في أنبوب الطرد المركزي سعة 2 مل وفقا لمرحلة نمو البذور. وترد التفاصيل في الجدول 1.
    2. احتضن العينات على شاكر مداري (30 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 إلى 50 دقيقة حتى يصبح مخطط طبقة البذور الأعمق مرئيا بوضوح. تخلص من محلول المطهر.
      ملاحظة: يعتمد وقت الحضانة المطلوب على مرحلة نمو البذور (كلما تأخرت البذور ، زاد وقت الحضانة). وترد التفاصيل في الجدول 1.
    3. بالنسبة للبذور المتوسطة والمتأخرة ، انقل البذور إلى شريحة وقم بإزالة صمغ البذور بالملقط وإبرة تشريح تحت مجهر مجسم بتكبير 1x إلى 4x. نقل البذور مرة أخرى إلى أنبوب الطرد المركزي الأصلي باستخدام ملقط.
      ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية للبذور المبكرة.
    4. اغسل البذور 5 مرات ب 1.5 مل من الماء منزوع الأيونات ، 10 ثوان في كل مرة. تخلص من الماء منزوع الأيونات.
    5. أضف محلول تطهير من 2 × حجم البذور ، متبوعا بمعالجة فراغية لمدة 0 إلى 50 دقيقة (الجدول 1) بمضخة تفريغ (انظر جدول المواد). يتم إجراء المعالجة الفراغية المتقطعة مع كل معالجة فراغ لمدة 10 دقائق متباعدة على فترات 10 دقائق.
    6. استبدل بمحلول مقاصة جديد من 2 × حجم البذور. احتفظ بأنبوب الطرد المركزي سعة 2 مل الذي يحتوي على البذور في درجة حرارة الغرفة ومحميا من الضوء لمدة 30 دقيقة إلى 7 أيام لتسهيل التطهير (الجدول 1). أثناء الحضانة ، بالنسبة للأجنة المتأخرة ، استبدل محلول المقاصة يوميا بمحلول جديد وأخضع البذور للمعالجة الفراغية لمدة 10 دقائق.
    7. قم بإعداد البذور التي تم تطهيرها على شرائح أو شرائح مقعرة واحدة وراقبها باستخدام مجهر DIC المجهز بكاميرا رقمية بتكبير 10x و 20x و 40x. اضبط وحسن سطوع الضوء المرسل وشريط تمرير DIC وفتحة المكثف في الوقت الفعلي لكل عينة والتقاط الصور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما تم إزالة بذور الطماطم باستخدام طريقة تقليدية كما هو الحال في Arabidopsis ، منعت خلايا السويداء الكثيفة تصور أجنة الطماطم المبكرة عند 3 DAF و 6 DAF (الشكل 3 أ ، ب). مع زيادة الحجم الكلي للجنين ، كان الجنين الكروي بالكاد يمكن تمييزه عند 9 DAF (الشكل 3C). ومع ذلك ، مع استمرار زيادة حجم البذور ، انخفضت نفاذيتها ، مما أدى إلى جنين قلب غامض عند 12 DAF (الشكل 3D). من 13 DAF فصاعدا ، أصبح صمغ البذور ومعطف البذور تدريجيا أكثر كثافة ، مما يمنع تغلغل عوامل التطهير. كان مخطط الجنين داخل 14-19 بذور DAF غير واضح للغاية حتى عندما تم تمديد وقت العلاج إلى 7 أيام (الشكل 3E-G). في 22 بذرة DAF ، كان الهيكل الداخلي للبذور غير مرئي تماما (الشكل 3H).

لذلك ، تم تحسين إجراء الإزالة التقليدي القائم على هيدرات الكلورال لتمكين الإزالة الفعالة لبذور الطماطم. يتم سرد تفاصيل جميع الخطوات في الجدول 1. أولا ، تم حذف خطوات تثبيت FAA وتجفيف الإيثانول ، والتي غالبا ما تكون مطلوبة في إجراءات المقاصة التقليدية ، من البروتوكول. بينما يستخدم تثبيت FAA بشكل عام للحفاظ على البنية المورفولوجية والمكونات الخلوية من الاضمحلال ، فقد وجد (في هذه الدراسة) أن البنية الداخلية لبذور الطماطم لم تكن مشوهة بسهولة وتم الحفاظ عليها جيدا على الرغم من عدم وجود تثبيت FAA وتجفيف الإيثانول.

ثانيا ، صمغ معطف البذور الذي تنتجه خلايا البشرة ذات الغلاف البذري بارز جدا من 13 DAF فصاعدا (الشكل 4). أظهر صمغ البذور الغني بالسكريات لزوجة عالية ونفاذية منخفضة بشكل ملحوظ35,36. فشلت التجارب الأولية لإزالته دون تدمير طبقة البذور باستخدام ملقط وإبر دقيقة تحت مجهر التشريح للأسف. وذلك لأن معطف البذور هش ومتصل بإحكام بالصمغ. علاوة على ذلك ، فإن وجود الصباغ في معطف البذور يؤدي إلى انخفاض جودة صورة المجال الساطع37. للتغلب على هذه المشكلة ، تمت معالجة البذور بمحلول مطهر من 1.2 ٪ هيبوكلوريت الصوديوم و 0.1 ٪ توين 20. يتيح تأثير التبييض لهيبوكلوريت الصوديوم تحديدا واضحا لطبقة البذور الداخلية ويخلق بيئة معقمة نسبيا تسمح بتخزين العينات لفترة طويلة. يمكن أن يؤدي استخدام المنظف Tween 20 إلى تقليل التوتر السطحي وزيادة نفاذية البذور. الأهم من ذلك ، بعد هذه الخطوة ، يمكن فصل معظم الصمغ الملتصق عن البذور دون الإضرار بطبقة البذور (الشكل 4). من الآن فصاعدا ، تم تجميع البذور المعالجة في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل وتم تحضينها في درجة حرارة الغرفة في شاكر مداري (30 دورة في الدقيقة).

ثالثا ، تم استخدام المعالجة الفراغية لتسريع تغلغل محلول المقاصة للأجنة في المراحل المتوسطة والمتأخرة. أخيرا ، نظرا لأن بذور الطماطم أكبر بشكل خاص بعد 12 DAF ، فقد تم استبدال الشرائح التقليدية بشرائح مقعرة مفردة عند تصوير مدينة دبي للإنترنت.

بعد المعالجة وفقا لبروتوكول المقاصة الأمثل ، أظهرت بذور الطماطم شفافية مرضية في جميع مراحل النمو المختبرة (الشكل 5A-L). على عكس ملامح الخلية الضبابية التي تم الحصول عليها باستخدام البروتوكولات التقليدية ، كانت طبقات الخلايا المميزة لطبقة البذور عند 3 DAF مرئية (الشكل 5 أ). كانت خلايا السويداء أكثر تميزا عند 5 DAF (الشكل 5 ب). ظهر الجنين على شكل عصا في 7 DAF ، ثم وصل الجنين إلى المرحلة الكروية في 9 DAF ومرحلة القلب في 11 DAF (الشكل 5C-E). خلال هذه المراحل التنموية ، كانت الخطوط العريضة للخلايا داخل الجنين أكثر وضوحا. بالمقارنة مع الطريقة التقليدية ، أنتج البروتوكول الأمثل صورا ذات جودة أفضل بكثير من مرحلة القلب إلى مرحلة الجنين الناضج. عندما وصل التطور الجنيني إلى مرحلة الطوربيد المبكرة عند 13 DAF ، ومرحلة الطوربيد الوسطى عند 14 DAF ، ومرحلة الطوربيد المتأخرة عند 15 DAF ، ومرحلة النبتة المبكرة عند 16 DAF ، ومرحلة ثني النبتة عند 19 DAF و 21 DAF ، والجنين الناضج عند 23 DAF ، تم التقاط درجة تجعيد النبتات وإطلاق النار على meristem القمي بسهولة شديدة (الشكل 5F-L ). ومع ذلك ، بعد 23 DAF ، لم يكن من الممكن تصور التفاصيل في الجنين ، حتى عندما تم تمديد علاج المقاصة إلى أكثر من 1 أسبوع.

Figure 2
الشكل 2: مخطط انسيابي للبروتوكول التقليدي والبروتوكول الأمثل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: صور تباين التداخل التفاضلي لبويضات S. lycopersicum المعالجة باستخدام طريقة المقاصة التقليدية. (أ) بويضة بها كيس جنيني غامض عند 3 DAF. (ب) كيس الجنين مع خلايا السويداء المرئية (رؤوس الأسهم) عند 6 DAF. (ج) جنين كروي بالكاد يمكن تمييزه عند 9 DAF. جنين ضبابي عند (د) ١٢، ه، ١٤، (و) ١٦، (ز) ١٩ DAF. (ح) البنية الداخلية للبذرة غير مرئية تماما عند 22 DAF. قضبان المقياس = 25 ميكرومتر ؛ م = الجنين ؛ es = كيس الجنين. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تطهير بذور S. lycopersicum في مراحل النمو المختلفة. الصور العلوية (A1-F1) هي البذور المخططة من الثمار النامية في (A1) 11 و (B1) 12 و (C1) 14 و (D1) 16 و (E1) 18 و (F1) 21 DAF ، بينما الصور السفلية (A2-F2) هي بذور معالجة بمحلول مطهر. في A2-F2 ، يمكن تحديد محيط معطف البذور الداخلي بوضوح. قضبان المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: صور تباين التداخل التفاضلي لأجنة S. lycopersicum التي تم تطهيرها باستخدام البروتوكول الأمثل. (A-L) صور الفحص المجهري لبويضة الطماطم مع كيس جنيني مرئي عند (A) 3 DAF و (B) 5 DAF ، (ج) جنين على شكل عصا عند 7 DAF ، (د) جنين كروي عند 9 DAF ، (ه) جنين قلب عند 11DAF ، (F) جنين طوربيد مبكر عند 13 DAF ، (G) جنين طوربيد متوسط 14 DAF ، (H) جنين طوربيد متأخر عند 15 DAF ، (I) جنين فلقة مبكر عند 16 DAF ، جنين ذو فلقة منحنية عند (J) 19 DAF و (K) 21 DAF ، و (L) جنين ناضج عند 23 DAF. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر ؛ م = الجنين ؛ sc = معطف البذور ؛ en = السويداء. es = كيس الجنين ؛ hy = هيبوكوتيل ؛ شارك = نبتة. ص = الجذر. SA = تبادل لاطلاق النار قمي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معالجة الأنسجة تطور الجنين
3-7 داف 8-10 داف 11-13 داف 14-16 داف 17-20 داف 21-23 داف
1 عدد البذور الطازجة 50 40 30 20 15 10
2 تطهير 1.5 مل ، 3 دقائق 1.5 مل ، 10 دقائق 1.5 مل ، 20 دقيقة 1.5 مل ، 30 دقيقة 1.5 مل ، 40 دقيقة 1.5 مل ، 50 دقيقة
3 تقشير الصمغ لا لا نعم نعم نعم نعم
4 غسل 5x 10 ثانية
5 مسح 2x حجم البذور
6 كنس لا 1 × 10 دقيقة 2 × 10 دقيقة 3 × 10 دقيقة 4 × 10 دقيقة 5 × 10 دقيقة
7 حضانة المرض 30 دقيقة 2 ساعة 3 ساعات 8 ساعات 1-4 أيام 3-7 أيام

الجدول 1: تحسين البروتوكول لتحسين فعالية المقاصة في بذور الطماطم. 1 = عمليات الدفعات ، وإزالة ملاحظة عدد كبير من البذور في وقت واحد ؛ وضعت البذور في أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل. 2 = التطهير باستخدام 6٪ NaClO: dH2O: Tween-20 ، بنسب 200: 800: 1 (v / v) ؛ تم تنفيذ جميع الخطوات على شاكر مداري مع اهتزاز 30 دورة في الدقيقة. 3 = تم تنفيذ جميع الخطوات تحت مجهر تشريح بالملقط وإبر التشريح ما لم ينص على خلاف ذلك. 4 = تم غسل البذور بالماء المقطر بعد كل خطوة. 5 = المقاصة باستخدام 100٪ الجلسرين: هيدرات الكلورال: dH 2 O ، بنسب 1: 8:2(v / w / v). 6 = استمرت كل معالجة فراغية لمدة 10 دقائق وتم تباعدها على فترات 10 دقائق. 7 = استبدلها بمحلول إزالة طازج وقم بتخزين البذور بعيدا عن الضوء في درجة حرارة الغرفة ؛ بالنسبة للبذور من 17 DAF إلى 23 DAF ، استبدل محلول المقاصة بمحلول جديد ونظف بالمكنسة الكهربائية لمدة 10 دقائق كل يوم طوال فترة الحضانة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بالمقارنة مع التقسيم الميكانيكي ، تعد تقنية المقاصة أكثر فائدة للتصوير ثلاثي الأبعاد لأنها تحتفظ بسلامة الأنسجة أو الأعضاء النباتية16. غالبا ما تقتصر بروتوكولات المقاصة التقليدية على عينات صغيرة بسبب سهولة اختراق المحاليل الكيميائية. تعتبر بذور الطماطم عينة إشكالية لإزالة الأنسجة لأنها أكبر بحوالي 70 مرة من حجم بذور أرابيدوبسيس ولديها حواجز نفاذية أكبر. يتكون معطف بذور أرابيدوبسيس من أربع إلى خمس طبقات من الخلايا الحية مشتقة من التكامل الخارجي والتكامل الداخلي24. ومع ذلك ، بالمقارنة مع Arabidopsis ، هناك 22-27 طبقة خلية متني (في مرحلة الجنين الكروي) في معطف بذور الطماطم6. تتكون الطبقة الأعمق من معطف بذور الطماطم من السوبرين وتعرف باسم الطبقة شبه المنفذة ، والتي ثبت أنها عائق أمام حركة المركبات القابلة للذوبان في الماء38. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر صمغ البذور الغني بالسكريات لزوجة عالية ونفاذية منخفضة بشكل ملحوظ ، مما أعاق تغلغل محلول المقاصة. يقلل معطف بذور الطماطم الغني بالأصباغ أيضا من جودة الصورة35،36،37. تاريخيا ، يتم حل إزالة الأصباغ عن طريق تطبيق المؤكسدات المصحوبة بالتدفئة أو العلاج لفترات طويلة37،39،40،41. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي تطبيق للأكسدة في طريقة المقاصة القائمة على هيدرات الكلورال.

في هذه الدراسة ، تمت معالجة البذور قبل عملية المقاصة بمحلول مطهر يحتوي على هيبوكلوريت الصوديوم ، مع استكماله بخافض للتوتر السطحي توين 20. والمثير للدهشة ، بعد العلاج بمحلول التطهير (من 3 إلى 50 دقيقة) ، يمكن إزالة صمغ بذور الطماطم بسهولة ، مما يحسن بشكل كبير من نفاذية البذور. يمكن ملاحظة عملية تبييض طبقة البذور في الوقت الفعلي ويتم ضبط مدة تطهير البذور وفقا لذلك. تحافظ عملية التبييض أيضا على بيئة معقمة نسبيا ، مما يسمح بالتخزين اللاحق للبذور المعالجة لمدة 8 أشهر دون تلوث.

حقق البروتوكول الأمثل الذي تم تطويره في الدراسة الشفافية الشاملة لبذور الطماطم من 3 DAF إلى 23 DAF. تنعكس مزايا هذا البروتوكول بشكل أساسي في الجوانب التالية: أولا ، أدى القضاء على تثبيت FAA والجفاف المتدرج اللاحق للإيثانول إلى تقصير وقت العلاج بمقدار 7 ساعات على الأقل. أدى استخدام معالجة هيبوكلوريت الصوديوم جنبا إلى جنب مع محلول التطهير إلى تحسين نفاذية البذور بشكل كبير وتصور الطبقة الأعمق من طبقة البذور. أخيرا ، بالنسبة للأجنة الوسطى ، يمكن الحصول على صور عالية الجودة للأجنة بعد 10 ساعات ، بينما يستغرق الأمر 3 أيام على الأقل مع البروتوكولات التقليدية.

على الرغم من مزايا هذا البروتوكول ، إلا أنه يحتوي على قيدين مهمين. أولا ، في 5 DAF ، لم يلاحظ الجنين المبكر في المرحلة المكونة من خليتين إلى ستة عشر خلية ، والذي ربما كان بسبب خلايا السويداء الخلوية الكثيفة والأكبر التي تعيق تصور الأجنة. ثانيا ، على الرغم من أن مورفولوجيا جنين الطماطم قد اكتملت تقريبا عند حوالي 23 DAF ، إلا أنه لا يمكن الحصول على صور مميزة للبذور بعد 24 DAF بهذه الطريقة المحسنة. من الممكن أنه مع اقتراب الجنين من حجمه الكامل ، تتكاثف البشرة الموجودة على سطح السويداء بشكل كبير ، وتشكل بقايا خلايا الحمة التكاملية المحتضرة طبقات كثيفة وخلايا البشرة الخارجية للتكامل تزداد بشكل كبير في التقشير6. تشير هذه إلى انخفاض كبير في قدرة اختراق البذور ، مما يجعل من المستحيل تصور الأنسجة الداخلية بالطرق الحالية.

في الختام ، يوفر هذا البروتوكول الأمثل وسيلة فعالة للعثور على الفترة غير الطبيعية للتطور الجنيني ، مما يوفر الأساس لمراقبة هياكل الخلايا الدقيقة باستخدام تقنيات التقطيع. علاوة على ذلك ، إلى حد ما ، من المرجح أن توفر هذه الطريقة مخططا مرجعيا للمحاصيل الأخرى المهمة تجاريا في الباذنجان ، مثل البطاطس والباذنجان والفلفل والتبغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدكتور جي لو والدكتور Xiufen Song لاقتراحاتهما المفيدة حول مجهر تباين التداخل التفاضلي وطريقة المقاصة التقليدية ، على التوالي. تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31870299) وجمعية تشجيع الابتكار للشباب التابعة للأكاديمية الصينية للعلوم. تم إنشاء الشكل 2 باستخدام BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 187 ،
بروتوكول تطهير فعال لدراسة تطور البذور في الطماطم (<em>Solanum lycopersicum</em> L.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An… More

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter