Summary
Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Dit protocol is nuttig voor het opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia om de fijnere embryonale structuur te observeren.
Abstract
Tomaat (Solanum lycopersicum L.) is een van de belangrijkste cash crops wereldwijd. Het tomatenzaad is een belangrijk model voor het bestuderen van genetica en ontwikkelingsbiologie tijdens de voortplanting van planten. Visualisatie van de fijnere embryonale structuur in een tomatenzaad wordt vaak belemmerd door zaadlaagslijm, meercellige gelaagde omhulling en een dikwandig endosperm, dat moet worden opgelost door moeizame inbeddingssectie. Een eenvoudiger alternatief is om weefselzuiveringstechnieken te gebruiken die het zaad bijna transparant maken met behulp van chemische middelen. Hoewel conventionele opruimprocedures diep inzicht bieden in kleinere zaden met een dunnere zaadlaag, blijft het opruimen van tomatenzaden technisch uitdagend, vooral in de late ontwikkelingsstadia.
Hier wordt een snel en arbeidsbesparend clearingprotocol gepresenteerd om de ontwikkeling van tomatenzaad te observeren van 3 tot 23 dagen na de bloei wanneer de embryonale morfologie bijna voltooid is. Deze methode combineert op chloraalhydraat gebaseerde clearingoplossing die veel wordt gebruikt in Arabidopsis met andere modificaties, waaronder het weglaten van Formaline-Aceto-Alcohol (FAA) fixatie, de toevoeging van natriumhypochlorietbehandeling van zaden, verwijdering van het verzachte zaadlaagslijm en wassen en vacuümbehandeling. Deze methode kan worden toegepast voor het efficiënt opruimen van tomatenzaden in verschillende ontwikkelingsstadia en is nuttig bij volledige monitoring van het ontwikkelingsproces van mutante zaden met een goede ruimtelijke resolutie. Dit clearingprotocol kan ook worden toegepast op diepe beeldvorming van andere commercieel belangrijke soorten in de Solanaceae.
Introduction
Tomaat (S. lycopersicum L.) is een van de belangrijkste groentegewassen ter wereld, met een output van 186,8 miljoen ton vlezig fruit van 5,1 miljoen hectare in 20201. Het behoort tot de grote Solanaceae-familie met ongeveer 2.716 soorten2, waaronder veel commercieel belangrijke gewassen zoals aubergine, paprika's, aardappelen en tabak. De gekweekte tomaat is een diploïde soort (2n = 2x = 24) met een genoomgrootte van ongeveer 900 Mb3. Lange tijd is er veel moeite gedaan voor het domesticeren en veredelen van tomaten door het selecteren van gewenste eigenschappen uit wilde Solanum spp. Er zijn meer dan 5.000 tomatentoetredingen vermeld in het Tomato Genetics Resource Center en meer dan 80.000 kiemplasma van tomaten worden wereldwijd opgeslagen4. De tomatenplant is overblijvend in de kas en vermeerdert zich door zaden. Een rijp tomatenzaad bestaat uit drie belangrijke compartimenten: een volgroeid embryo, resterend cellulair endosperm en een harde zaadlaag 5,6 (figuur 1A). Na dubbele bevruchting gaat de ontwikkeling van cellulair endosperm vooraf aan de ontwikkeling van zygoten. Bij ~5-6 dagen na de bloei (DAF) wordt tweecellige proembryo voor het eerst waargenomen wanneer het endosperm bestaat uit zes tot acht kernen7. In Solanum pimpinellifolium nadert het embryo zijn uiteindelijke grootte na 20 DAF en zijn zaden levensvatbaar voor ontkieming na 32 DAF8. Naarmate het embryo zich ontwikkelt, wordt het endosperm geleidelijk geabsorbeerd en blijft er slechts een kleine hoeveelheid endosperm in het zaad achter. Het resterende endosperm bestaat uit micropylar endosperm rond de radikelpunt en lateraal endosperm in de rest van het zaad 9,10. De buitenste zaadlaag is ontwikkeld uit verdikte en gelamineerde buitenste epidermis van het integument, en met de dode lagen van integumentresten vormen ze een harde schaal om het embryo en endosperm5 te beschermen.
Figuur 1: Schematische weergave van een rijp zaad in Solanum lycopersicum en Arabidopsis thaliana. (A) Longitudinale anatomie van een rijp tomatenzaad. (B) Longitudinale anatomie van een volwassen Arabidopsis zaad. Een volwassen tomatenzaad is ongeveer 70 keer groter dan een Arabidopsiszaadje . Schaalbalken = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De productie van hoogwaardige tomatenzaden hangt af van de coördinatie tussen het embryo, het endosperm en de maternale zaadcomponenten11. Het ontleden van belangrijke genen en netwerken in zaadontwikkeling vereist een diepe en full-track fenotypische opname van gemuteerde zaden. Conventionele inbeddingstechnieken, zoals de halfdunne sectie en paraffinesectie, worden op grote schaal toegepast op tomatenzaden om de lokale en fijnere structuren van het embryo te observeren 12,13,14,15. Het analyseren van de zaadontwikkeling vanuit dunne secties is echter meestal bewerkelijk en mist de ruimtelijke resolutie van de z-as. Ter vergelijking: weefselopruiming is een snelle en efficiënte methode om het ontwikkelingsstadium van embryodefecten te lokaliseren die het meest waarschijnlijk optreden16. De clearingmethode vermindert de ondoorzichtigheid van inwendig weefsel door de brekingsindex te homogeniseren met een of meer biochemische agentia16. Het opruimen van hele weefsels maakt observatie van een plantenweefselstructuur mogelijk zonder de integriteit ervan te vernietigen, en de combinatie van clearingtechnologie en driedimensionale beeldvorming is een ideale oplossing geworden om informatie te verkrijgen over de morfologie en ontwikkelingstoestand van een plantenorgaan17,18. In de loop der jaren zijn zaadzuiveringstechnieken gebruikt bij verschillende plantensoorten, waaronder Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare en Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Onder deze, de hele-mount ovule clearing technologie is een efficiënte benadering geweest voor het bestuderen van zaadontwikkeling van Arabidopsis, vanwege zijn kleine formaat, 4-5 lagen van de zaadlaagcel, en het nucleaire type endosperm24,25. Met de voortdurende actualisering van verschillende clearingmengsels, zoals de opkomst van Hoyer's oplossing26, werden interne structuren van de gerst-eicel met een hoge mate van helderheid in beeld gebracht, hoewel het endosperm het grootste deel van de zaden uitmaakt. Embryogenese van suikerbieten kan worden waargenomen door opklaring in combinatie met vacuümbehandeling en verzachting met zoutzuur19. Niettemin zijn, in tegenstelling tot de hierboven genoemde soorten, embryologische waarnemingen door clearingprotocollen in tomatenzaden niet gemeld. Dit voorkomt gedetailleerd onderzoek naar de embryonale en zaadontwikkeling van tomaten.
Chloraalhydraat wordt vaak gebruikt als een opruimoplossing waarmee de ondergedompelde weefsels en cellen op verschillende optische vlakken kunnen worden weergegeven en de cellen of weefselcomponenten aanzienlijk behouden 27,28,29. Het op chloraalhydraat gebaseerde clearingprotocol is met succes gebruikt voor het volledig opruimen van zaden om het embryo en endosperm van Arabidopsis21,28 te observeren. Deze clearingoplossing is echter niet efficiënt bij het opruimen van tomatenzaden, die ondoordringbaarder zijn dan Arabidopsis-zaden. De fysieke barrières omvatten: (1) het tomatenintegument heeft bijna 20 cellagen bij 3 tot 15 DAF30,31, (2) het tomatenendosperm is cellulair type, niet nucleair type32, en (3) tomatenzaden zijn ongeveer 70 keer groter in grootte33,34 en (4) produceren grote hoeveelheden zaadlaagslijm, wat de penetratie van clearingreagentia blokkeert en de visualisatie van embryocellen beïnvloedt.
Daarom presenteert dit rapport een geoptimaliseerde op chloraalhydraat gebaseerde clearingmethode voor het volledig opruimen van tomatenzaden in verschillende stadia, waardoor diepe beeldvorming van het embryo-ontwikkelingsproces mogelijk is (figuur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van oplossingen
- Bereid FAA-fixatief voor door 2,5 ml 37% formaldehyde, 2,5 ml ijsazijn en 45 ml 70% ethanol toe te voegen in een centrifugebuis van 50 ml. Vortex en bewaar het bij 4 °C. Bereid FAA-fixatief vers voor gebruik.
LET OP: 37% formaldehyde is corrosief en mogelijk kankerverwekkend bij blootstelling of inademing. Het fixatief moet worden uitgevoerd in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen. - Bereid de opruimoplossing door 5 ml 100% glycerol, 40 g chloraalhydraat en 10 ml gedestilleerd water toe te voegen in een glazen fles van 100 ml omwikkeld met tinfolie. Los op met een magneetroerder 's nachts bij kamertemperatuur. De bereide oplossing kan maximaal 6 maanden bij 4 °C worden bewaard.
LET OP: Chloorhydraat is kankerverwekkend en heeft een penetrante geur. Voer het experiment uit in een zuurkast en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Chloraalhydraat is gemakkelijk te deliquesce in de lucht en mag niet in grote hoeveelheden worden bewaard. De opruimoplossing kan ontbinden bij blootstelling aan licht en moet uit de buurt van licht worden gehouden. - Bereid de desinfecterende oplossing door 10 ml 6% natriumhypochloriet, 40 ml gedestilleerd water en 50 μL Tween-20 toe te voegen in een centrifugebuis van 50 ml. Vortex en bewaar het bij kamertemperatuur. Bereid de desinfecterende oplossing vlak voor gebruik vers voor.
OPMERKING: Het effectieve chloorgehalte van natriumhypochloriet dat lange tijd is geplaatst, kan afnemen en het gehalte aan 6% natriumhypochloriet kan worden verhoogd afhankelijk van de werkelijke situatie.
2. Zaadverzameling
- Tomatenzaden (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, zie Materiaaltabel) zaaien in 8 cm × vierkante bassins van 8 cm × 8 cm vol met een 1:1 mengsel van bloemvoedingsgrond en substraat (v/v) (zie Materiaaltabel), en groeien in een groeiruimte met 16/8 uur licht/donker periodes bij 24 ± 2 °C (dag) en 18 ± 2 °C (nacht), 60%-70% relatieve vochtigheid en een lichtintensiteit van 4.000 Lux. Ongeveer 6 weken later kwamen planten in de bloeifase.
- Tag de bloeidatum van onafhankelijke bloemen bij anthese (openingshoek van de bloemblaadjes is 90°) en noteer de dag na de bloei (DAF).
- Oogst de vruchten van 3 tot 23 DAF tomatenplanten en zet ze meteen in de ijskast. Verdeel vruchten (zaden of embryo's) van 3 tot 23 DAF in vroege (3-10 DAF), middelste (11-16 DAF) en late (17-23 DAF) vruchten (zaden of embryo's).
OPMERKING: Verzamel niet te veel vruchten tegelijk en zorg ervoor dat de zaden in elke vrucht binnen 1 uur worden gestript voor verdere behandeling. - Voor vroege vruchten, breek het fruit en leg het op een dia en verzamel verse zaden voorzichtig met precisietangen onder de stereomicroscoop (zie Tabel van materialen) bij 1x tot 4x vergroting. Voor midden- en late vruchten, breek het fruit en verzamel direct verse zaden met behulp van een precisietang.
3. Opruimen van zaden op basis van chloraalhydraat
OPMERKING: Conventionele35 en geoptimaliseerde protocollen werden in deze studie vergeleken voor hun zaadzuiveringsefficiëntie.
- Wissen met behulp van een conventioneel protocol
- Plaats verse zaden (verkregen in stap 2.4) onmiddellijk in een centrifugebuis van 2 ml met 1,5 ml FAA-fixatief en incubeer op een orbitale shaker (5 tpm, zie materiaaltabel) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
- Droog deze zaden uit in een ethanolreeks van 70%, 95% en 100% ethanol (v/v) gedurende elk 1 uur op een orbitale shaker (5 rpm).
- Leg de zaden in 3-5 druppels opruimoplossing (~100 μL) op de dia en bedek het monster voorzichtig met een deklip. Vervang de dia door een enkele holle dia (zie Materiaaltabel) voor middelste en late zaden.
- Bewaar deze dia's of enkele concave dia's bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten (3 DAF), 2 uur (6 DAF), 1 dag (9 DAF), 3 dagen (12 DAF) of 7 dagen (14 tot 22 DAF), afhankelijk van de ontwikkelingsstadia van het zaadmateriaal (hoe jonger de materialen, hoe sneller de opruimsnelheid).
- Observeer de monsters met een differentiële interferentiecontrast (DIC) microscoop uitgerust met een digitale camera (zie Tabel van materialen) bij 10x, 20x en 40x vergroting. Pas de helderheid van het verzonden licht, de DIC-schuifregelaar en het condensoropening in realtime aan en optimaliseer deze voor elk monster en leg beelden vast.
- Wissen met behulp van het geoptimaliseerde protocol
- Breng verse zaden (verkregen in stap 2.4) rechtstreeks in een centrifugebuis van 2 ml met 1,5 ml desinfecterende oplossing (stap 1.3).
OPMERKING: Het aantal zaden verzameld in de centrifugebuis van 2 ml varieert afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de zaden. De details zijn vermeld in tabel 1. - Incubeer de monsters op een orbitale shaker (30 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 3 tot 50 minuten totdat de binnenste zaadlaagcontour duidelijk zichtbaar is. Gooi de desinfecterende oplossing weg.
OPMERKING: De vereiste incubatietijd is afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het zaad (hoe later de zaden, hoe langer de incubatietijd). De details zijn vermeld in tabel 1. - Voor middelste en late zaden breng je de zaden over op een dia en verwijder je het zaadslijm met een tang en een ontleednaald onder een stereomicroscoop bij 1x tot 4x vergroting. Breng de zaden terug in de oorspronkelijke centrifugebuis met behulp van een tang.
OPMERKING: Deze stap is niet nodig voor vroege zaden. - Was de zaden 5x met 1,5 ml gedeïoniseerd water, telkens 10 s. Gooi het gedeïoniseerde water weg.
- Voeg een opruimoplossing van 2 × het volume van de zaden toe, gevolgd door een vacuümbehandeling gedurende 0 tot 50 minuten (tabel 1) met een vacuümpomp (zie materiaaltabel). Intermitterende vacuümbehandeling wordt uitgevoerd met elke vacuümbehandeling gedurende 10 minuten met intervallen van 10 minuten.
- Vervang door een verse opruimoplossing van 2 × het volume van de zaden. Houd de centrifugebuis van 2 ml met de zaden op kamertemperatuur en beschermd tegen licht gedurende 30 minuten tot 7 dagen om het opruimen te vergemakkelijken (tabel 1). Vervang tijdens de incubatie, voor late embryo's, de clearingoplossing dagelijks door verse oplossing en onderwerp de zaden gedurende 10 minuten aan een vacuümbehandeling.
- Bereid de geklaarde zaden voor op dia's of enkel-concaaf dia's en observeer met de DIC-microscoop uitgerust met een digitale camera met een vergroting van 10x, 20x en 40x. Pas de helderheid van het verzonden licht, de DIC-schuifregelaar en het condensoropening in realtime aan en optimaliseer deze voor elk monster en leg beelden vast.
- Breng verse zaden (verkregen in stap 2.4) rechtstreeks in een centrifugebuis van 2 ml met 1,5 ml desinfecterende oplossing (stap 1.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toen tomatenzaden werden geklaard met behulp van een conventionele methode zoals in Arabidopsis, blokkeerden dichte endospermcellen de visualisatie van vroege tomatenembryo's bij 3 DAF en 6 DAF (figuur 3A, B). Naarmate het totale volume van het embryo toenam, was een bolvormig embryo nauwelijks te onderscheiden bij 9 DAF (figuur 3C). Naarmate de zaadgrootte echter bleef toenemen, nam de permeabiliteit af, wat resulteerde in een wazig hartembryo bij 12 DAF (figuur 3D). Vanaf 13 DAF werden zaadslijm en zaadlaag geleidelijk dichter, waardoor het binnendringen van clearingmiddelen werd voorkomen. De omtrek van het embryo in 14-19 DAF-zaden was extreem wazig, zelfs wanneer de behandelingstijd werd verlengd tot 7 dagen (figuur 3E-G). Bij 22 DAF-zaden was de interne structuur van het zaad volledig onzichtbaar (figuur 3H).
Daarom werd de conventionele op chloraalhydraat gebaseerde clearingprocedure geoptimaliseerd om het efficiënt opruimen van tomatenzaden mogelijk te maken. Details over alle stappen zijn opgenomen in tabel 1. Ten eerste werden de FAA-fixatie- en ethanoldehydrateringsstappen, die vaak vereist zijn in conventionele clearingprocedures, weggelaten uit het protocol. Hoewel FAA-fixatie over het algemeen wordt gebruikt om de morfologische structuur en cellulaire componenten te beschermen tegen verval, bleek (in deze studie) dat de interne structuur van tomatenzaden niet gemakkelijk vervormd was en goed bewaard bleef ondanks de afwezigheid van FAA-fixatie en ethanoluitdroging.
Ten tweede is zaadlaagslijm geproduceerd door de zaadlaag epidermale cellen zeer prominent vanaf 13 DAF (figuur 4). Het polysacchariderijke zaadslijm vertoonde een hoge viscositeit en een significant lage permeabiliteit35,36. Eerste proeven om het te verwijderen zonder de zaadlaag te vernietigen met behulp van fijne tangen en naalden onder een ontleedmicroscoop mislukten helaas. Dit komt omdat de zaadlaag broos is en nauw verbonden met het slijm. Bovendien leidt het bestaan van pigment in de zaadlaag verder tot de afname van de kwaliteit van het heldere veldbeeld37. Om dit probleem op te lossen, werden de zaden behandeld met een desinfecterende oplossing van 1,2% natriumhypochloriet en 0,1% Tween 20. Het blekende effect van natriumhypochloriet maakt een duidelijke identificatie van de binnenste zaadlaag mogelijk en creëert een relatief steriele omgeving waardoor monsters lange tijd konden worden bewaard. Het gebruik van wasmiddel Tween 20 kan de oppervlaktespanning verlagen en de zaaddoorlaatbaarheid verhogen. Wat nog belangrijker is, na deze stap kan het grootste deel van het aanhangende slijm van het zaad worden losgemaakt zonder de zaadlaag te beschadigen (figuur 4). Voortaan werden de behandelde zaden samengevoegd in een centrifugebuis van 2 ml en bij kamertemperatuur geïncubeerd in een orbitale shaker (30 rpm).
Ten derde werd vacuümbehandeling gebruikt om de penetratie van de clearingoplossing naar de embryo's in het midden en late stadium te versnellen. Ten slotte, omdat tomatenzaden vooral groter zijn na 12 DAF, werden conventionele dia's vervangen door enkele concave dia's bij DIC-beeldvorming.
Na behandeling volgens het geoptimaliseerde clearingprotocol vertoonden tomatenzaden voldoende transparantie in alle geteste ontwikkelingsstadia (figuur 5A-L). In tegenstelling tot wazige celcontouren verkregen met behulp van conventionele protocollen, waren verschillende cellagen van de zaadlaag bij 3 DAF zichtbaar (figuur 5A). Endospermcellen waren beter te onderscheiden bij 5 DAF (figuur 5B). Het stokvormige embryo verscheen bij 7 DAF en vervolgens bereikte het embryo het bolvormige stadium bij 9 DAF en het hartstadium bij 11 DAF (figuur 5C-E). Tijdens deze ontwikkelingsstadia waren de contouren van de cellen in het embryo het duidelijkst zichtbaar. In vergelijking met de conventionele methode produceerde het geoptimaliseerde protocol beelden van aanzienlijk betere kwaliteit van het hartstadium tot het volwassen embryostadium. Toen de embryonale ontwikkeling het vroege torpedostadium bereikte bij 13 DAF, het middelste torpedostadium bij 14 DAF, het late torpedostadium bij 15 DAF, het vroege zaadlouwstadium bij 16 DAF, het gebogen zaadlobbige stadium bij 19 DAF en 21 DAF, en het volwassen embryo bij 23 DAF, werd de mate van de krul van zaadlobben en scheut apicale meristeem heel gemakkelijk vastgelegd (figuur 5F-L ). Buiten 23 DAF was het echter niet mogelijk om de details in het embryo te visualiseren, zelfs niet wanneer de opruimbehandeling werd verlengd tot meer dan 1 week.
Figuur 2: Stroomdiagram van conventioneel protocol en geoptimaliseerd protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Differentiële interferentiecontrastbeelden van S. lycopersicum-eicellen behandeld met behulp van de conventionele clearingmethode. (A) Een eicel met pluizige embryozak bij 3 DAF. (B) Embryozak met zichtbare endospermcellen (pijlpunten) bij 6 DAF. (C) Een nauwelijks te onderscheiden bolvormig embryo bij 9 DAF. Een wazig embryo bij (D) 12, (E) 14, (F) 16 en (G) 19 DAF. (H) De interne structuur van het zaad is volledig onzichtbaar bij 22 DAF. Schaalstaven = 25 μm; em = embryo; es = embryozak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Desinfectie van S. lycopersicum zaden in verschillende ontwikkelingsstadia. De bovenste afbeeldingen (A1-F1) zijn de gestreepte zaden van de zich ontwikkelende vruchten op (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 en (F1) 21 DAF, terwijl de onderste afbeeldingen (A2-F2) zaden zijn die zijn behandeld met desinfecterende oplossing. In A2-F2 is de binnenste zaadvachtcontour duidelijk te herkennen. Schaalbalken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 5: Differentiële interferentiecontrastbeelden van S. lycopersicum-embryo's gewist met behulp van het geoptimaliseerde protocol. (A-L) DIC-microscopiebeelden van de tomaten-eicel met zichtbare embryozak bij (A) 3 DAF en (B) 5 DAF, (C) een stokvormig embryo bij 7 DAF, (D) een bolvormig embryo bij 9 DAF, (E) een hartembryo bij 11DAF, (F) een vroeg torpedo-embryo bij 13 DAF, (G) een middelste torpedo-embryo 14 DAF, (H) een laat torpedo-embryo bij 15 DAF, (I) een vroeg-zaadlobbenembryo bij 16 DAF, een gebogen-zaadlobbenembryo bij (J) 19 DAF en (K) 21 DAF, en (L) een volwassen embryo bij 23 DAF. Schaalstaven = 50 μm; em = embryo; sc = zaadvacht; nl = endosperm; es = embryozak; hy = hypocotyl; co = zaadlobbig; r = radikel; sa = schiet apisch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Weefselverwerking | Embryo ontwikkeling | ||||||
| 3-7 DAF | 8-10 DAF | 11-13 DAF | 14-16 DAF | 17-20 DAF | 21-23 DAF | ||
| 1 | Aantal verse zaden | 50 | 40 | 30 | 20 | 15 | 10 |
| 2 | Desinfectie | 1,5 ml, 3 min | 1,5 ml, 10 min | 1,5 ml, 20 min | 1,5 ml, 30 min | 1,5 ml, 40 min | 1,5 ml, 50 min |
| 3 | Het slijm eraf pellen | Nee | Nee | Ja | Ja | Ja | Ja |
| 4 | Was | 5x 10 s | |||||
| 5 | Verrekening | 2x het volume van de zaden | |||||
| 6 | Stofzuigen | Nee | 1 x 10 min | 2 x 10 min | 3 x 10 min | 4 x 10 min | 5 x 10 min |
| 7 | Incubatie | 30 min. | 2 u | 3 u | 8 u | 1-4 dagen | 3-7 dagen |
Tabel 1: Optimalisatie van het protocol voor het verbeteren van de clearingeffectiviteit in tomatenzaden. 1 = Batchbewerkingen, clearing van observatie van een groot aantal zaden tegelijk; zaden werden in een centrifugebuis van 2 ml geplaatst. 2 = Desinfectie met 6% NaClO:dH2O:Tween-20, in verhoudingen van 200:800:1 (v/v); alle stappen werden uitgevoerd op een orbitale shaker met 30 rpm schudden. 3 = Alle stappen werden uitgevoerd onder een ontleedmicroscoop met een tang en ontleednaalden, tenzij anders aangegeven. 4 = Zaden werden na elke stap gewassen met gedestilleerd water. 5 = Opruimen met 100% glycerol:chloraalhydraat:dH2O, in verhoudingen van 1:8:2 (v/w/v). 6 = Elke vacuümbehandeling duurde 10 minuten en werd met tussenpozen van 10 minuten uit elkaar geplaatst. 7 = Vervangen door verse opruimoplossing en zaden uit de buurt van licht bij kamertemperatuur bewaren; voor zaden van 17 DAF tot 23 DAF, vervang de opruimoplossing door een verse oplossing en vacuüm gedurende 10 minuten per dag gedurende de incubatieperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vergelijking met mechanische secties is de clearingtechnologie voordeliger voor driedimensionale beeldvorming omdat deze de integriteit van plantenweefsels of organen behoudt16. Conventionele clearingprotocollen zijn vaak beperkt tot kleine monsters vanwege de gemakkelijkere penetratie van chemische oplossingen. Tomatenzaad is een problematisch monster voor weefselzuivering omdat het ongeveer 70 keer groter is dan een Arabidopsis-zaad in grootte en meer permeabiliteitsbarrières heeft. De Arabidopsis zaadlaag bestaat uit vier tot vijf levende cellagen afgeleid van het buitenste omhulsel en het binnenste omhulsel24. In vergelijking met Arabidopsis zijn er echter 22-27 parenchymale cellagen (in het stadium van het bolvormige embryo) in de tomatenzaadlaag6. De binnenste laag van de tomatenzaadlaag bestaat uit suberine en staat bekend als de semipermeabele laag, waarvan is aangetoond dat deze een barrière vormt voor de beweging van in water oplosbare verbindingen38. Bovendien vertoonde het polysacchariderijke zaadslijm een hoge viscositeit en een significant lage permeabiliteit, wat de penetratie van de clearingoplossing belemmerde. De pigmentrijke zaadlaag van tomaat vermindert ook de beeldkwaliteitmet 35,36,37. Historisch gezien wordt de verwijdering van pigmenten opgelost door de toepassing van oxidanten vergezeld van verhitting of langdurige behandeling 37,39,40,41. Er is echter nauwelijks toepassing van oxidanten in de clearingmethode op basis van chloraalhydraat gemeld.
In deze studie werden de zaden vóór het opruimproces behandeld met een ontsmettende oplossing die natriumhypochloriet bevat, aangevuld met een oppervlakteactieve stof Tween 20. Verrassend genoeg kon na behandeling met de desinfectieoplossing (3 tot 50 minuten) het slijm van tomatenzaden gemakkelijk worden verwijderd, waardoor de permeabiliteit van de zaden aanzienlijk werd verbeterd. Het bleekproces van de zaadlaag kan in realtime worden waargenomen en de duur van de zaaddesinfectie wordt dienovereenkomstig aangepast. Het bleekproces handhaaft ook een relatief steriele omgeving, waardoor de behandelde zaden vervolgens gedurende 8 maanden zonder besmetting kunnen worden bewaard.
Het geoptimaliseerde protocol dat in het onderzoek is ontwikkeld, heeft de algehele transparantie van tomatenzaden van 3 DAF tot 23 DAF bereikt. De voordelen van dit protocol komen voornamelijk tot uiting in de volgende aspecten: Ten eerste verkortte de eliminatie van FAA-fixatie en de daaropvolgende dehydratie van de ethanolgradiënt de behandelingstijd met ten minste 7 uur. Het gebruik van natriumhypochlorietbehandeling in combinatie met een clearingoplossing verbeterde de permeabiliteit van de zaden en de visualisatie van de binnenste laag van de zaadlaag aanzienlijk. Ten slotte kunnen voor middelste embryo's na 10 uur hoogwaardige beelden van embryo's worden verkregen, terwijl het met traditionele protocollen minstens 3 dagen duurt.
Ondanks de voordelen van dit protocol, heeft het twee belangrijke beperkingen. Ten eerste werd bij 5 DAF de vroege proembryo in het twee- tot zestiencellige stadium niet waargenomen, wat waarschijnlijk te wijten was aan de dichte en grotere cellulaire endospermcellen die de visualisatie van embryo's belemmerden. Ten tweede, hoewel de morfologie van het tomatenembryo bijna voltooid is met ongeveer 23 DAF, konden met deze geoptimaliseerde methode geen verschillende beelden voor zaden na 24 DAF worden verkregen. Het is mogelijk dat naarmate het embryo zijn volledige grootte nadert, de cuticula op het oppervlak van het endosperm aanzienlijk dikker wordt, de overblijfselen van stervende integument parenchymcellen dichte lagen vormen en de buitenste epidermiscellen van het omhulsel dramatisch toenemen in lignificatie6. Deze suggereren een drastische vermindering van de zaadpenetratiecapaciteit, waardoor het onmogelijk wordt om het interne weefsel te visualiseren met de bestaande methoden.
Kortom, dit geoptimaliseerde protocol biedt een effectief middel om de abnormale periode van embryonale ontwikkeling te vinden en biedt de basis voor de observatie van fijnere celstructuren met behulp van snijtechnieken. Bovendien zal deze methode tot op zekere hoogte waarschijnlijk een referentieschema bieden voor andere commercieel belangrijke gewassen in Solanaceae, zoals aardappelen, aubergines, paprika's en tabak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn Dr. Jie Le en Dr. Xiufen Song dankbaar voor hun nuttige suggesties over respectievelijk differentiële interferentiecontrastmicroscopie en conventionele clearingmethode. Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31870299) en de Youth Innovation Promotion Association van de Chinese Academy of Sciences. Figuur 2 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette | GILSON | FA10006M | |
| 1,000 µL pipette tips | Corning | T-1000-B | |
| 2 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | |
| 37% formaldehyde | DAMAO | 685-2013 | |
| 5,000 µL pipette | Eppendorf | 3120000275 | |
| 5,000 µL pipette tips | biosharp | BS-5000-TL | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Absolute Ethanol | BOYUAN | 678-2002 | |
| Bottle glass | Fisher | FB800-100 | |
| Chloral Hydrate | Meryer | M13315-100G | |
| Coverslip | Leica | 384200 | |
| DIC microscope | Zeiss | Axio Imager A1 | 10x, 20x and 40x magnification |
| Disinfectant | QIKELONGAN | 17-9185 | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Flower nutrient soil | FANGJIE | ||
| Forceps | HAIOU | 4-94 | |
| Glacial Acetic Acid | BOYUAN | 676-2007 | |
| Glycerol | Solarbio | G8190 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RET basic | |
| Micro-Tom | Tomato Genetics Resource Center | LA3911 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER | QB-206 | |
| Seeding substrate | PINDSTRUP | LV713/018-LV252 | Screening:0-10 mm |
| Single concave slide | HUABODEYI | HBDY1895 | |
| Slide | Leica | 3800381 | |
| Stereomicroscope | Leica | S8 APO | 1x to 4x magnification |
| Tin foil | ZAOWUFANG | 613 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vacuum pump | SHIDING | SHB-III | |
| Vortex meter | Silogex | MX-S |
References
- FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
- Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
- Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
- Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
- Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
- Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
- Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
- Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
- Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
- Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
- Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
- Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
- Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
- Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
- Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
- Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
- Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
- Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
- Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
- Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
- Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
- Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
- Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
- Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
- Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
- de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
- Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
- Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
- Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
- Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
- Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
- Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
- Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
- Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
- Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
- Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).
