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Developmental Biology

टमाटर में बीज विकास के अध्ययन के लिए एक कुशल समाशोधन प्रोटोकॉल (सोलनम लाइकोपर्सिकम एल।

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64445

Summary

टमाटर का बीज पौधे के प्रजनन के दौरान आनुवंशिकी और विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। यह प्रोटोकॉल बेहतर भ्रूण संरचना का निरीक्षण करने के लिए विभिन्न विकास चरणों में टमाटर के बीज को साफ करने के लिए उपयोगी है।

Abstract

टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम एल) दुनिया भर में प्रमुख नकदी फसलों में से एक है। टमाटर का बीज पौधे के प्रजनन के दौरान आनुवंशिकी और विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। टमाटर के बीज के भीतर महीन भ्रूण संरचना का विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर बीज कोट म्यूसिलेज, मल्टी-सेल-लेयर्ड इंटेगुमेंट और एक मोटी दीवार वाले एंडोस्पर्म द्वारा बाधित होता है, जिसे श्रमसाध्य एम्बेडिंग-सेक्शनिंग द्वारा हल करने की आवश्यकता होती है। एक सरल विकल्प ऊतक समाशोधन तकनीकों को नियोजित करना है जो रासायनिक एजेंटों का उपयोग करके बीज को लगभग पारदर्शी बनाते हैं। यद्यपि पारंपरिक समाशोधन प्रक्रियाएं पतले बीज कोट के साथ छोटे बीजों में गहरी अंतर्दृष्टि की अनुमति देती हैं, टमाटर के बीज को साफ करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण बना हुआ है, खासकर देर से विकास के चरणों में।

यहां प्रस्तुत एक तेजी से और श्रम-बचत समाशोधन प्रोटोकॉल है जो फूल आने के 3 से 23 दिनों बाद टमाटर के बीज के विकास का निरीक्षण करता है जब भ्रूण आकृति विज्ञान लगभग पूरा हो जाता है। यह विधि एराबिडोप्सिस में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन समाधान को अन्य संशोधनों के साथ जोड़ती है, जिसमें फॉर्मलिन-एसिटो-अल्कोहल (एफएए) निर्धारण, बीजों के सोडियम हाइपोक्लोराइट उपचार को जोड़ना, नरम बीज कोट म्यूसिलेज को हटाना और धोने और वैक्यूम उपचार शामिल हैं। इस विधि को विभिन्न विकास चरणों में टमाटर के बीजों के कुशल समाशोधन के लिए लागू किया जा सकता है और अच्छे स्थानिक संकल्प के साथ उत्परिवर्ती बीजों की विकास प्रक्रिया की पूर्ण निगरानी में उपयोगी है। इस समाशोधन प्रोटोकॉल को सोलानासी में अन्य व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों की गहरी इमेजिंग पर भी लागू किया जा सकता है।

Introduction

टमाटर (एस लाइकोपर्सिकम एल) दुनिया भर में सबसे महत्वपूर्ण सब्जी फसलों में से एक है, जिसमें 2020 में 5.1 मिलियन हेक्टेयर से 186.8 मिलियन टन मांसल फलों का उत्पादन होता है यह लगभग 2,716 प्रजातियों2 के साथ बड़े सोलानासी परिवार से संबंधित है, जिसमें बैंगन, मिर्च, आलू और तंबाकू जैसी कई व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण फसलें शामिल हैं। खेती की गई टमाटर एक द्विगुणित प्रजाति (2n = 2x = 24) है जिसका जीनोम आकार लगभग 900 Mb3 है। लंबे समय से, जंगली सोलनम एसपीपी से वांछनीय लक्षणों का चयन करके टमाटर को पालतू बनाने और प्रजनन की दिशा में बहुत प्रयास किया गया है। टमाटर जेनेटिक्स रिसोर्स सेंटर में 5,000 से अधिक टमाटर परिग्रहण सूचीबद्ध हैंऔर टमाटर के 80,000 से अधिक जर्मप्लाज्म दुनिया भर में संग्रहीत हैं। टमाटर का पौधा ग्रीनहाउस में बारहमासी होता है और बीजों द्वारा फैलता है। एक परिपक्व टमाटर के बीज में तीन प्रमुख डिब्बे होते हैं: एक पूर्ण विकसित भ्रूण, अवशिष्ट सेलुलर-प्रकार एंडोस्पर्म, और एक कठोर बीज कोट 5,6 (चित्रा 1 ए)। दोहरे निषेचन के बाद, सेलुलर-प्रकार के एंडोस्पर्म का विकास युग्मनज के विकास से पहले होता है। फूल (डीएएफ) के ~ 5-6 दिनों के बाद, दो-कोशिका वाले प्रोम्ब्रायो को पहली बार देखा जाता है जब एंडोस्पर्म में छह से आठ नाभिकहोते हैं। सोलनम पिंपिनेलिफोलियम में, भ्रूण 20 डीएएफ के बाद अपने अंतिम आकार तक पहुंचता है, और बीज 32 डीएएफ 8 के बाद अंकुरण के लिए व्यवहार्यहोते हैं। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, एंडोस्पर्म धीरे-धीरे अवशोषित हो जाता है और बीज में एंडोस्पर्म की केवल थोड़ी मात्रा रह जाती है। अवशिष्ट एंडोस्पर्म में रेडियल टिप के आसपास माइक्रोपाइलर एंडोस्पर्म और शेष बीज 9,10 में पार्श्व एंडोस्पर्म होते हैं। बाहरी बीज कोट को इन्टेगुमेंट के मोटे और लिग्निफाइड बाहरी एपिडर्मिस से विकसित किया जाता है, और इन्टेगुमेंट अवशेषों की मृत परतों के साथ, वे भ्रूण और एंडोस्पर्म5 की रक्षा के लिए एक कठोर खोल बनाते हैं।

Figure 1
चित्र 1: सोलनम लाइकोपर्सिकम और एराबिडोप्सिस थैलियाना में एक परिपक्व बीज का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। () एक परिपक्व टमाटर के बीज की अनुदैर्ध्य शारीरिक रचना। (बी) एक परिपक्व एराबिडोप्सिस बीज की अनुदैर्ध्य शारीरिक रचना। एक परिपक्व टमाटर का बीज एराबिडोप्सिस बीज की तुलना में आकार में लगभग 70 गुना बड़ा होता है। स्केल पट्टियाँ = (A) 400 μm, (B) 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

उच्च गुणवत्ता वाले टमाटर के बीज का उत्पादन भ्रूण, एंडोस्पर्म और मातृ बीज घटकों के बीच समन्वय पर निर्भर करताहै। बीज विकास में प्रमुख जीन और नेटवर्क को विच्छेदित करने के लिए उत्परिवर्ती बीजों की गहरी और पूर्ण-ट्रैक फेनोटाइपिक रिकॉर्डिंग की आवश्यकता होती है। पारंपरिक एम्बेडिंग-सेक्शनिंग तकनीक, जैसे अर्ध-पतले खंड और पैराफिन अनुभाग, भ्रूण 12,13,14,15 की स्थानीय और महीन संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए टमाटर के बीज पर व्यापक रूप से लागू होते हैं। हालांकि, पतले वर्गों से बीज विकास का विश्लेषण करना आमतौर पर श्रमसाध्य होता है और जेड-अक्ष स्थानिक संकल्प का अभाव होता है। इसकी तुलना में, ऊतक समाशोधन भ्रूण दोषों के विकास चरण को इंगित करने के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका हैजो होने की सबसे अधिक संभावना है। समाशोधन विधि एक या अधिक जैव रासायनिक एजेंटों के साथ अपवर्तक सूचकांक को समरूप करके आंतरिक ऊतक की अपारदर्शिता को कम करतीहै। संपूर्ण ऊतक समाशोधन इसकी अखंडता को नष्ट किए बिना एक पौधे के ऊतक संरचना के अवलोकन की अनुमति देता है, और समाशोधन तकनीक और त्रि-आयामी इमेजिंग का संयोजन एक पौधे के अंग17,18 की आकृति विज्ञान और विकासात्मक स्थिति पर जानकारी प्राप्त करने के लिए एक आदर्श समाधान बन गया है। वर्षों से, विभिन्न पौधों की प्रजातियों में बीज समाशोधन तकनीकों का उपयोग किया गया है, जिसमें एराबिडोप्सिस थैलियाना, होर्डियम वल्गर और बीटा वल्गरिस19,20,21,22,23 शामिल हैं। इनमें से, होल-माउंट डिंब समाशोधन तकनीक एराबिडोप्सिस के बीज विकास का अध्ययन करने के लिए एक कुशल दृष्टिकोण रही है, इसके छोटे आकार, बीज कोट सेल की 4-5 परतों और परमाणु-प्रकार एंडोस्पर्म24,25 के कारण। विभिन्न समाशोधन मिश्रणों के निरंतर अद्यतन के साथ, जैसे कि होयर के समाधान26 के उद्भव के साथ, जौ के अंडाणु की आंतरिक संरचनाओं को उच्च स्तर की स्पष्टता के साथ चित्रित किया गया था, हालांकि इसके एंडोस्पर्म बीज का बड़ा हिस्सा बनाते हैं। चीनी बीट के भ्रूणजनन को वैक्यूम उपचार के साथ संयुक्त रूप से साफ़ करके और हाइड्रोक्लोरिक एसिड19 के साथ नरम करके देखा जा सकता है। बहरहाल, ऊपर उल्लिखित प्रजातियों के विपरीत, टमाटर के बीज में प्रोटोकॉल को साफ़ करके भ्रूण संबंधी अवलोकनों की सूचना नहीं दी गई है। यह टमाटर के भ्रूण और बीज विकास में विस्तृत जांच को रोकता है।

क्लोरल हाइड्रेट का उपयोग आमतौर पर एक समाशोधन समाधान के रूप में किया जाता है जो डूबे हुए ऊतकों और कोशिकाओं को विभिन्न ऑप्टिकल विमानों पर प्रदर्शित करने की अनुमति देता है, और कोशिकाओं या ऊतक घटकों 27,28,29 को काफी हद तक संरक्षित करता है एराबिडोप्सिस21,28 के भ्रूण और एंडोस्पर्म का निरीक्षण करने के लिए बीजों के पूरे माउंट क्लियरिंग के लिए क्लोरल हाइड्रेट-आधारित क्लियरिंग प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है हालांकि, यह समाशोधन समाधान टमाटर के बीज को साफ करने में कुशल नहीं है, जो एराबिडोप्सिस बीजों की तुलना में अधिक अभेद्य हैं। भौतिक बाधाओं में शामिल हैं: (1) टमाटर के आंत में 3 से 15 डीएएफ 30,31 पर लगभग20 सेल परतें होती हैं, (2) टमाटर एंडोस्पर्म सेलुलर-प्रकार होता है, परमाणु-प्रकार32 नहीं, और (3) टमाटर के बीज आकार में लगभग 70 गुना बड़ेहोते हैं 33,34 और (4) बड़ी मात्रा में बीज कोट म्यूसिलेज का उत्पादन करते हैं, जो समाशोधन अभिकर्मकों के प्रवेश को अवरुद्ध करता है और भ्रूण कोशिकाओं के दृश्य को प्रभावित करता है।

इसलिए, यह रिपोर्ट विभिन्न चरणों में टमाटर के बीज के पूरे माउंट क्लियरिंग के लिए एक अनुकूलित क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन विधि प्रस्तुत करती है, जो भ्रूण विकास प्रक्रिया की गहरी इमेजिंग की अनुमति देती है (चित्रा 2)।

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Protocol

1. समाधान तैयार करना

  1. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 37% फॉर्मलाडेहाइड के 2.5 एमएल, ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 2.5 एमएल और 70% इथेनॉल के 45 एमएल को जोड़कर एफएए फिक्सेटिव तैयार करें। भंवर और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले एफएए फिक्सेटिव को ताजा तैयार करें।
    चेतावनी: 37% फॉर्मलाडेहाइड संक्षारक और संभावित रूप से कार्सिनोजेनिक है यदि उजागर या साँस लिया जाता है। फिक्सेटिव को उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनते समय एक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
  2. टिन पन्नी के साथ लिपटी 100 एमएल ग्लास बोतल में 100% ग्लिसरॉल, 40 ग्राम क्लोरल हाइड्रेट और 10 एमएल आसुत पानी के 5 एमएल जोड़कर समाशोधन समाधान तैयार करें। कमरे के तापमान पर रात भर चुंबकीय हलचल का उपयोग करके घुलें। तैयार समाधान को 6 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    चेतावनी: क्लोरल हाइड्रेट कार्सिनोजेनिक है और इसमें तीखी गंध है। प्रयोग को एक फ्यूम हुड में करें और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें। क्लोरल हाइड्रेट हवा में प्रवाह करना आसान है और इसे बड़ी मात्रा में संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए। प्रकाश के संपर्क में आने पर समाशोधन समाधान विघटित हो सकता है और इसे प्रकाश से दूर रखा जाना चाहिए।
  3. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट, 40 एमएल आसुत जल और 50 μL ट्वीन -20 के 10 एमएल जोड़कर कीटाणुनाशक समाधान तैयार करें। भंवर और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले कीटाणुनाशक समाधान तैयार करें।
    नोट: सोडियम हाइपोक्लोराइट की प्रभावी क्लोरीन सामग्री जो लंबे समय से रखी गई है, कम हो सकती है, और वास्तविक स्थिति के अनुसार 6% सोडियम हाइपोक्लोराइट की सामग्री बढ़ाई जा सकती है।

2. बीज संग्रह

  1. टमाटर के बीज (एस लाइकोपर्सिकम एल सीवी माइक्रो-टॉम, सामग्री की तालिका देखें) को 8 सेमी × 8 सेमी × वर्ग बेसिनों में फूलों की पोषक मिट्टी और सब्सट्रेट (वी / वी) के 1: 1 मिश्रण से भरा 8 सेमी वर्ग बेसिन में बोएं ( सामग्री की तालिका देखें), और 24 डिग्री सेल्सियस (दिन) और 18 ± 2 डिग्री सेल्सियस (रात) पर 16/8 घंटे प्रकाश / अंधेरे अवधि के साथ एक विकास कक्ष में बढ़ते हैं, 24 ± 2 डिग्री सेल्सियस (दिन) और 18 ± 2 डिग्री सेल्सियस (रात) पर 16/8 घंटे प्रकाश / अंधेरे अवधि के साथ बढ़ते हैं। 60% -70% सापेक्ष आर्द्रता, और 4,000 लक्स की हल्की तीव्रता। लगभग 6 सप्ताह बाद, पौधों ने फूलों के चरण में प्रवेश किया।
  2. एंथेसिस पर स्वतंत्र फूलों की फूलों की तारीख को टैग करें (पंखुड़ियों का उद्घाटन कोण 90 ° है), और फूल आने के बाद का दिन रिकॉर्ड करें (डीएएफ)।
  3. 3 से 23 डीएएफ टमाटर के पौधों से फलों को काटें और तुरंत उन्हें बर्फ पर रखें। फलों (बीज या भ्रूण) को 3 से 23 डीएएफ से प्रारंभिक (3-10 डीएएफ), मध्य (11-16 डीएएफ), और देर से (17-23 डीएएफ) फलों (बीज या भ्रूण) में विभाजित करें।
    नोट: एक समय में बहुत सारे फल एकत्र न करें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक फल में बीज आगे के उपचार के लिए 1 घंटे के भीतर छीन लिए जाएं।
  4. शुरुआती फलों के लिए, फल को तोड़ें और इसे एक स्लाइड पर रखें, और 1x से 4x आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) के नीचे सटीक बल के साथ ताजे बीजों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें। मध्य और देर से फलों के लिए, फल को तोड़ें और सटीक बल का उपयोग करके सीधे ताजा बीज इकट्ठा करें।

3. बीजों की क्लोरल हाइड्रेट-आधारित सफाई

नोट: इस अध्ययन में पारंपरिक35 और अनुकूलित प्रोटोकॉल की तुलना उनकी बीज समाशोधन दक्षता के लिए की गई थी।

  1. एक पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके समाशोधन
    1. ताजा बीज (चरण 2.4 में प्राप्त) को तुरंत 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें 1.5 एमएल एफएए फिक्सेटिव होता है और कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए ऑर्बिटल शेकर (5 आरपीएम, सामग्री की तालिका देखें) पर इनक्यूबेट करें।
    2. इन बीजों को 70%, 95%, और 100% इथेनॉल (v/v) की इथेनॉल श्रृंखला में 1 घंटे के लिए ऑर्बिटल शेकर (5 आरपीएम) पर निर्जलित करें।
    3. स्लाइड पर क्लियरिंग घोल (~ 100 μL) की 3-5 बूंदों में बीज रखें और धीरे से नमूने को कवरस्लिप के साथ कवर करें। मध्य और देर से बीजों के लिए स्लाइड को एकल अवतल स्लाइड ( सामग्री की तालिका देखें) से बदलें।
    4. बीज सामग्री के विकास चरणों के आधार पर इन स्लाइडों या एकल अवतल स्लाइडों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट (3 डीएएफ), 2 घंटे (6 डीएएफ), 1 दिन (9 डीएएफ), 3 दिन (12 डीएएफ), या 7 दिन (14 से 22 डीएएफ) के लिए रखें (सामग्री जितनी छोटी होगी, समाशोधन गति उतनी ही तेज होगी)।
    5. 10x, 20x और 40x आवर्धन पर डिजिटल कैमरा ( सामग्री की तालिका देखें) से लैस एक विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (डीआईसी) माइक्रोस्कोप के साथ नमूने का निरीक्षण करें। प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय में प्रेषित प्रकाश चमक, डीआईसी स्लाइडर और कंडेनसर एपर्चर को समायोजित और अनुकूलित करें और छवियों को कैप्चर करें।
  2. अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करसंशोधन
    1. ताजा बीज (चरण 2.4 में प्राप्त) को सीधे 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखें जिसमें 1.5 एमएल कीटाणुनाशक समाधान (चरण 1.3) हो।
      नोट: 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एकत्र किए गए बीजों की संख्या बीज के विकास चरण के अनुसार भिन्न होती है। विवरण तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
    2. 3 से 50 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कक्षीय शेकर (30 आरपीएम) पर नमूनों को इनक्यूबेट करें जब तक कि सबसे भीतरी बीज कोट की रूपरेखा स्पष्ट रूप से दिखाई न दे। कीटाणुनाशक घोल को त्याग दें।
      नोट: आवश्यक इनक्यूबेशन समय बीज विकास चरण पर निर्भर करता है (बीज बाद में, इनक्यूबेशन समय लंबा होगा)। विवरण तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं।
    3. मध्य और देर से बीजों के लिए, बीज को एक स्लाइड पर स्थानांतरित करें और 1x से 4x आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत बल और एक विच्छेदित सुई के साथ बीज म्यूसिलेज को हटा दें। बल का उपयोग करके बीज को मूल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वापस स्थानांतरित करें।
      नोट: यह कदम शुरुआती बीजों के लिए आवश्यक नहीं है।
    4. बीज को 1.5 एमएल विआयनीकृत पानी से 5 गुना धोएं, हर बार 10 सेकंड। विआयनीकृत पानी को फेंक दें।
    5. बीज की मात्रा × 2 का समाशोधन समाधान जोड़ें, इसके बाद वैक्यूम पंप के साथ 0 से 50 मिनट (तालिका 1) के लिए वैक्यूम उपचार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। आंतरायिक वैक्यूम उपचार प्रत्येक वैक्यूम उपचार के साथ 10 मिनट के अंतराल पर 10 मिनट के लिए किया जाता है।
    6. बीज की मात्रा × 2 के ताजा समाशोधन समाधान के साथ बदलें। बीज युक्त 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को कमरे के तापमान पर रखें और समाशोधन की सुविधा के लिए 30 मिनट से 7 दिनों तक प्रकाश से संरक्षित करें (तालिका 1)। इनक्यूबेशन के दौरान, देर से भ्रूण के लिए, क्लियरिंग समाधान को रोजाना ताजा समाधान से बदलें और बीज को 10 मिनट के लिए वैक्यूम उपचार के अधीन करें।
    7. स्लाइड या एकल-अवतल स्लाइड पर साफ किए गए बीज तैयार करें और 10x, 20x और 40x आवर्धन पर डिजिटल कैमरे से लैस डीआईसी माइक्रोस्कोप के साथ निरीक्षण करें। प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय में प्रेषित प्रकाश चमक, डीआईसी स्लाइडर और कंडेनसर एपर्चर को समायोजित और अनुकूलित करें और छवियों को कैप्चर करें।

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Representative Results

जब एराबिडोप्सिस में एक पारंपरिक विधि का उपयोग करके टमाटर के बीज को साफ किया गया था, तो घने एंडोस्पर्म कोशिकाओं ने 3 डीएएफ और 6 डीएएफ (चित्रा 3 ए, बी) पर शुरुआती टमाटर भ्रूण के विज़ुअलाइज़ेशन को अवरुद्ध कर दिया था। जैसे-जैसे भ्रूण की कुल मात्रा में वृद्धि हुई, एक गोलाकार भ्रूण मुश्किल से 9 डीएएफ (चित्रा 3 सी) पर अलग-अलग था। हालांकि, जैसे-जैसे बीज का आकार बढ़ता गया, इसकी पारगम्यता कम हो गई, जिसके परिणामस्वरूप 12 डीएएफ (चित्रा 3 डी) पर एक फजी हृदय भ्रूण हुआ। 13 डीएएफ के बाद से, बीज म्यूसिलेज और बीज कोट धीरे-धीरे सघन हो गए, जिससे क्लियरिंग एजेंटों के प्रवेश को रोका गया। 14-19 डीएएफ बीजों के अंदर भ्रूण की रूपरेखा बेहद धुंधली थी, तब भी जब उपचार का समय 7 दिनों तक बढ़ाया गया था (चित्रा 3 ई-जी)। 22 डीएएफ बीजों में, बीज की आंतरिक संरचना पूरी तरह से अदृश्य थी (चित्रा 3 एच)।

इसलिए, टमाटर के बीजों की कुशल समाशोधन को सक्षम करने के लिए पारंपरिक क्लोरल हाइड्रेट-आधारित समाशोधन प्रक्रिया को अनुकूलित किया गया था। सभी चरणों का विवरण तालिका 1 में सूचीबद्ध है। सबसे पहले, एफएए निर्धारण और इथेनॉल निर्जलीकरण चरण, जो अक्सर पारंपरिक समाशोधन प्रक्रियाओं में आवश्यक होते हैं, प्रोटोकॉल से हटा दिए गए थे। जबकि एफएए निर्धारण का उपयोग आम तौर पर क्षय से रूपात्मक संरचना और सेलुलर घटकों को संरक्षित करने के लिए किया जाता है, यह पाया गया (इस अध्ययन में) कि टमाटर के बीज की आंतरिक संरचना आसानी से विकृत नहीं थी और एफएए निर्धारण और इथेनॉल निर्जलीकरण की अनुपस्थिति के बावजूद अच्छी तरह से संरक्षित थी।

दूसरे, बीज कोट एपिडर्मल कोशिकाओं द्वारा उत्पादित बीज कोट म्यूसिलेज 13 डीएएफ के बाद से बहुत प्रमुख है (चित्रा 4)। पॉलीसेकेराइड युक्त बीज म्यूसिलेज ने एक उच्च चिपचिपाहट और काफी कम पारगम्यता35,36 दिखाई। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बारीक बल और सुइयों का उपयोग करके बीज कोट को नष्ट किए बिना इसे हटाने के लिए प्रारंभिक परीक्षण दुर्भाग्य से विफल रहे। ऐसा इसलिए है क्योंकि बीज कोट भंगुर है, और म्यूसिलेज से कसकर जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, बीज कोट में वर्णक का अस्तित्व आगे उज्ज्वल-क्षेत्र छवि37 की गुणवत्ता में गिरावट की ओर जाता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, बीजों को 1.2% सोडियम हाइपोक्लोराइट और 0.1% ट्वीन 20 के कीटाणुनाशक समाधान के साथ इलाज किया गया था। सोडियम हाइपोक्लोराइट का विरंजन प्रभाव आंतरिक बीज कोट की स्पष्ट पहचान को सक्षम बनाता है और अपेक्षाकृत बाँझ वातावरण बनाता है जो नमूनों को लंबे समय तक संग्रहीत करने की अनुमति देता है। डिटर्जेंट ट्वीन 20 का उपयोग सतह के तनाव को कम कर सकता है और बीज पारगम्यता को बढ़ा सकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इस कदम के बाद, अधिकांश अनुयायियों को बीज कोट को नुकसान पहुंचाए बिना बीज से अलग किया जा सकता है (चित्रा 4)। इसके बाद, उपचारित बीजों को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूल किया गया था और एक कक्षीय शेकर (30 आरपीएम) में कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट किया गया था।

तीसरा, वैक्यूम उपचार का उपयोग मध्य और देर से चरणों में भ्रूण के समाशोधन समाधान के प्रवेश में तेजी लाने के लिए किया गया था। अंत में, क्योंकि टमाटर के बीज 12 डीएएफ के बाद विशेष रूप से बड़े होते हैं, डीआईसी इमेजिंग होने पर पारंपरिक स्लाइड को एकल अवतल स्लाइड के साथ बदल दिया गया था।

अनुकूलित समाशोधन प्रोटोकॉल के अनुसार उपचार के बाद, टमाटर के बीज ने सभी परीक्षण किए गए विकास चरणों में संतोषजनक पारदर्शिता दिखाई (चित्रा 5 ए-एल)। पारंपरिक प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त फजी सेल आकृति के विपरीत, 3 डीएएफ पर बीज कोट की अलग-अलग सेल परतें दिखाई दे रही थीं (चित्रा 5 ए)। एंडोस्पर्म कोशिकाएं 5 डीएएफ (चित्रा 5 बी) पर अधिक अलग-अलग थीं। छड़ी के आकार का भ्रूण 7 डीएएफ पर दिखाई दिया, और फिर भ्रूण 9 डीएएफ पर गोलाकार चरण और 11 डीएएफ (चित्रा 5 सी-ई) पर हृदय चरण तक पहुंच गया। इन विकास चरणों के दौरान, भ्रूण के अंदर कोशिकाओं की रूपरेखा सबसे स्पष्ट रूप से दिखाई दे रही थी। पारंपरिक विधि की तुलना में, अनुकूलित प्रोटोकॉल ने हृदय चरण से परिपक्व भ्रूण चरण तक काफी बेहतर गुणवत्ता वाली छवियों का उत्पादन किया। जब भ्रूण का विकास 13 डीएएफ में प्रारंभिक टारपीडो चरण तक पहुंच गया, 14 डीएएफ पर मध्य टारपीडो चरण, 15 डीएएफ पर देर से टारपीडो चरण, 16 डीएएफ पर प्रारंभिक-कोटिलेडॉन चरण, 19 डीएएफ और 21 डीएएफ पर बेंट-कोटिलेडोन चरण, और 23 डीएएफ पर परिपक्व भ्रूण, कोटिलेडॉन और शूट एपिकल मेरिस्टेम के कर्ल की डिग्री बहुत आसानी से कैप्चर की गई (चित्रा 5 एफ-एल)। ). हालांकि, 23 डीएएफ से परे, भ्रूण में विवरण की कल्पना करना संभव नहीं था, तब भी जब समाशोधन उपचार 1 सप्ताह से अधिक समय तक चला था।

Figure 2
चित्रा 2: पारंपरिक प्रोटोकॉल और अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रवाह चार्ट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पारंपरिक समाशोधन विधि का उपयोग करके इलाज किए गए एस लाइकोपर्सिकम डिंब की विभेदक हस्तक्षेप विपरीत छवियां। () 3 डीएएफ पर फजी भ्रूण थैली के साथ एक अंडाणु। (बी) 6 डीएएफ पर दृश्यमान एंडोस्पर्म कोशिकाओं (तीर) के साथ भ्रूण थैली। (सी) 9 डीएएफ पर एक मुश्किल से अलग ग्लोबुलर भ्रूण। (डी) 12, () 14, (एफ) 16, और (जी) 19 डीएएफ पर एक फजी भ्रूण। (एच) बीज की आंतरिक संरचना 22 डीएएफ पर पूरी तरह से अदृश्य है। स्केल सलाखों = 25 μm; एम = भ्रूण; es = भ्रूण थैली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न विकास चरणों में एस लाइकोपर्सिकम के बीजों का कीटाणुशोधन। शीर्ष छवियां ( 1-एफ 1) विकासशील फलों से धारीदार बीज हैं (ए 1) 11, (बी 1) 12, (सी 1) 14, (डी 1) 16, (ई 1) 18, और (एफ 1) 21 डीएएफ, जबकि नीचे की छवियां ( 2-एफ 2) कीटाणुनाशक समाधान के साथ इलाज किए गए बीज हैं। 2-एफ 2 में, आंतरिक बीज कोट समोच्च को स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। स्केल पट्टियाँ = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करके साफ़ किए गए एस. लाइकोपर्सिकम भ्रूण की विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट छवियां। (A-L) (A-L) DIC माइक्रोस्कोपी छवियां टमाटर के अंडाणु की दृश्य मान भ्रूण थैली (A) 3 DAF और (B) 5 DAF, (C) 7 DAF पर एक छड़ी के आकार का भ्रूण, (D) 9 DAF पर एक गोलाकार भ्रूण, (E) 11DAF पर एक हृदय भ्रूण, (एफ) 13 डीएएफ पर एक प्रारंभिक टारपीडो भ्रूण, (जी) एक मध्य टारपीडो भ्रूण 14 डीएएफ, (एच) 15 डीएएफ पर एक देर से टारपीडो भ्रूण, (आई) 16 डीएएफ पर एक प्रारंभिक-कोटिलेडोन भ्रूण, (जे) 19 डीएएफ और (के) 21 डीएएफ पर एक बेंट-कोटिलेडोन भ्रूण, और (एल) 23 डीएएफ पर एक परिपक्व भ्रूण। स्केल सलाखों = 50 μm; एम = भ्रूण; एससी = बीज कोट; एन = एंडोस्पर्म; ईएस = भ्रूण थैली; हाय = हाइपोकोटिल; co = cotyledon; आर = रेडियल; सा = शूट एपिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊतक प्रसंस्करण भ्रूण का विकास
3-7 डीएएफ 8-10 डीएएफ 11-13 डीएएफ 14-16 डीएएफ 17-20 डीएएफ 21-23 डीएएफ
1 ताजे बीजों की संख्या 50 40 30 20 15 10
2 विसंक्रमण 1.5 mL, 3 मिनट 1.5 mL, 10 मिनट 1.5 mL, 20 मिनट 1.5 mL, 30 मिनट 1.5 mL, 40 मिनट 1.5 mL, 50 मिनट
3 म्यूसिलेज को छीलना नहीं नहीं हाँ हाँ हाँ हाँ
4 धुलाई 5x 10 s
5 समाशोधन 2x बीज की मात्रा
6 वैक्यूमिंग नहीं 1 x 10 मिनट 2 x 10 मिनट 3 x 10 मिनट 4 x 10 मिनट 5 x 10 मिनट
7 इनक्यूबेशन 30 मिनट 2 घंटे 3 घंटे 8 घंटे 1-4 दिन 3-7 दिन

तालिका 1: टमाटर के बीज में समाशोधन प्रभावकारिता में सुधार के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन। 1 = बैच ऑपरेशन, एक बार में बड़ी संख्या में बीजों का अवलोकन साफ़ करना; बीज को 2 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में रखा गया था। 2 = 200: 800: 1 (v / v) के अनुपात में 6% NaClO:dH 2O: ट्वीन -20 का उपयोग करके कीटाणुशोधन; सभी चरणों को 30 आरपीएम झटकों के साथ एक कक्षीय शेकर पर किया गया था। 3 = सभी चरणों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत बल के साथ किया गया था और सुइयों को विच्छेदित किया गया था जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न किया गया हो। 4 = बीजों को प्रत्येक चरण के बाद आसुत जल से धोया गया। 5 = 100% ग्लिसरॉल का उपयोग करके क्लियरिंग: क्लोरल हाइड्रेट: डीएच2ओ, 1: 8: 2 (वी / डब्ल्यू / वी) के अनुपात में। 6 = प्रत्येक वैक्यूम उपचार 10 मिनट तक चला और 10 मिनट के अंतराल पर स्थान दिया गया। 7 = ताजा समाशोधन समाधान के साथ बदलें और कमरे के तापमान पर बीज को प्रकाश से दूर रखें; 17 डीएएफ से 23 डीएएफ तक के बीजों के लिए, इनक्यूबेशन अवधि के दौरान हर दिन 10 मिनट के लिए क्लियरिंग समाधान को ताजा समाधान और वैक्यूम के साथ बदलें।

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Discussion

यांत्रिक सेक्शनिंग की तुलना में, समाशोधन तकनीक त्रि-आयामी इमेजिंग के लिए अधिक फायदेमंद है क्योंकि यह पौधे के ऊतकों या अंगों की अखंडता को बरकरार रखतीहै। रासायनिक समाधानों के आसान प्रवेश के कारण पारंपरिक समाशोधन प्रोटोकॉल अक्सर छोटे नमूनों तक सीमित होते हैं। टमाटर का बीज ऊतक समाशोधन के लिए एक समस्याग्रस्त नमूना है क्योंकि यह आकार में एराबिडोप्सिस बीज की तुलना में लगभग 70 गुना बड़ा है और इसमें अधिक पारगम्यता बाधाएं हैं। एराबिडोप्सिस बीज कोट चार से पांच जीवित कोशिका परतों से बना होता है जो बाहरी आंत और आंतरिकसंरचना 24 से प्राप्त होता है। हालांकि, एराबिडोप्सिस की तुलना में, टमाटर के बीज कोट6 में 22-27 पैरेन्काइमल सेल परतें (गोलाकार भ्रूण के चरण में) होती हैं। टमाटर के बीज कोट की सबसे भीतरी परत सुबेरिन से बनी होती है और इसे अर्धपारगम्य परत के रूप में जाना जाता है, जिसे पानी में घुलनशील यौगिकों के आंदोलन के लिए एक बाधा के रूप में दिखाया गयाहै। इसके अलावा, पॉलीसेकेराइड युक्त बीज म्यूसिलेज ने एक उच्च चिपचिपाहट और काफी कम पारगम्यता दिखाई, जिसने समाशोधन समाधान के प्रवेश को बाधित किया। टमाटर का वर्णक समृद्ध बीज कोट भी छवि गुणवत्ता 35,36,37 को कम करता है ऐतिहासिक रूप से, पिगमेंट को हटाने को हीटिंग या लंबे समय तक उपचार 37,39,40,41 के साथ ऑक्सीडेंट के आवेदन से हल किया जाता है। हालांकि, क्लोरल हाइड्रेट पर आधारित समाशोधन विधि में ऑक्सीडेंट के शायद ही कोई अनुप्रयोग की सूचना दी गई है।

इस अध्ययन में, बीजों को सोडियम हाइपोक्लोराइट युक्त कीटाणुनाशक समाधान के साथ समाशोधन प्रक्रिया से पहले इलाज किया गया था, जिसे सर्फेक्टेंट ट्वीन 20 के साथ पूरक किया गया था। आश्चर्यजनक रूप से, कीटाणुशोधन समाधान (3 से 50 मिनट) के साथ उपचार के बाद, टमाटर के बीज के म्यूसिलेज को आसानी से हटाया जा सकता है, जिससे बीज की पारगम्यता में काफी सुधार होता है। बीज कोट की विरंजन प्रक्रिया को वास्तविक समय में देखा जा सकता है और बीज कीटाणुशोधन की अवधि तदनुसार समायोजित की जाती है। विरंजन प्रक्रिया अपेक्षाकृत बाँझ वातावरण को भी बनाए रखती है, जिससे संदूषण के बिना 8 महीने तक उपचारित बीजों के बाद के भंडारण की अनुमति मिलती है।

अध्ययन में विकसित अनुकूलित प्रोटोकॉल ने 3 डीएएफ से 23 डीएएफ तक टमाटर के बीज की समग्र पारदर्शिता हासिल की। इस प्रोटोकॉल के फायदे मुख्य रूप से निम्नलिखित पहलुओं में परिलक्षित होते हैं: सबसे पहले, एफएए निर्धारण और बाद में इथेनॉल ढाल निर्जलीकरण के उन्मूलन ने उपचार के समय को कम से कम 7 घंटे तक कम कर दिया। समाशोधन समाधान के साथ संयुक्त सोडियम हाइपोक्लोराइट उपचार के उपयोग ने बीज की पारगम्यता और बीज कोट की सबसे भीतरी परत के विज़ुअलाइज़ेशन में काफी सुधार किया। अंत में, मध्य भ्रूण के लिए, भ्रूण की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को 10 घंटे के बाद प्राप्त किया जा सकता है, जबकि पारंपरिक प्रोटोकॉल के साथ कम से कम 3 दिन लगते हैं।

इस प्रोटोकॉल के फायदों के बावजूद, इसकी दो महत्वपूर्ण सीमाएं हैं। सबसे पहले, 5 डीएएफ पर, दो से सोलह-कोशिका वाले चरण में प्रारंभिक प्रोम्ब्रेयो नहीं देखा गया था, जो संभवतः घने और बड़े सेलुलर-प्रकार के एंडोस्पर्म कोशिकाओं के कारण भ्रूण के विज़ुअलाइज़ेशन में बाधा डाल रहा था। दूसरा, हालांकि टमाटर भ्रूण की आकृति विज्ञान लगभग 23 डीएएफ पर लगभग पूरा हो गया है, 24 डीएएफ के बाद बीज के लिए अलग-अलग छवियां इस अनुकूलित विधि के साथ प्राप्त नहीं की जा सकती हैं। यह संभव है कि जैसे-जैसे भ्रूण अपने पूर्ण आकार के करीब पहुंचता है, एंडोस्पर्म की सतह पर छल्ली काफी मोटी हो जाती है, मरने वाले इंटेगुमेंट पैरेन्काइमा कोशिकाओं के अवशेष घनी परतें बनाते हैं और इंटेगुमेंट की बाहरी एपिडर्मिस कोशिकाएं नाटकीय रूप से लिग्निफिकेशन 6 में वृद्धि करतीहैं। ये बीज प्रवेश क्षमता में भारी कमी का सुझाव देते हैं, जिससे मौजूदा तरीकों के साथ आंतरिक ऊतक की कल्पना करना असंभव हो जाता है।

निष्कर्ष में, यह अनुकूलित प्रोटोकॉल भ्रूण के विकास की असामान्य अवधि को खोजने के लिए एक प्रभावी साधन प्रदान करता है, जो स्लाइसिंग तकनीकों का उपयोग करके बेहतर सेल संरचनाओं के अवलोकन के लिए आधार प्रदान करता है। इसके अलावा, कुछ हद तक, यह विधि सोलनसी में अन्य व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण फसलों, जैसे आलू, बैंगन, मिर्च और तंबाकू के लिए एक संदर्भ योजना प्रदान करने की संभावना है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक क्रमशः अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी और पारंपरिक समाशोधन विधि पर उनके उपयोगी सुझावों के लिए डॉ जी ले और डॉ जियूफेन सोंग के आभारी हैं। इस शोध को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31870299) और चीनी विज्ञान अकादमी के युवा नवाचार संवर्धन संघ द्वारा वित्तपोषित किया गया था। चित्र 2 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 187
टमाटर में बीज विकास के अध्ययन के लिए एक कुशल <em>समाशोधन प्रोटोकॉल (सोलनम लाइकोपर्सिकम</em> एल।
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Feng, Y., Wang, T., Liu, L. AnMore

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

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