Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

En effektiv clearingprotokoll for studier av frøutvikling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64445
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

Summary

Tomatfrøet er en viktig modell for å studere genetikk og utviklingsbiologi under plantereproduksjon. Denne protokollen er nyttig for å rydde tomatfrø på ulike utviklingsstadier for å observere den finere embryonale strukturen.

Abstract

Tomat (Solanum lycopersicum L.) er en av de store kontantavlingene over hele verden. Tomatfrøet er en viktig modell for å studere genetikk og utviklingsbiologi under plantereproduksjon. Visualisering av finere embryonal struktur i et tomatfrø hindres ofte av frøbeleggslim, flercellelags integument og en tykkvegget endosperm, som må løses ved arbeidskrevende innebygging. Et enklere alternativ er å bruke vevsryddingsteknikker som gjør frøet nesten gjennomsiktig ved hjelp av kjemiske midler. Selv om konvensjonelle ryddeprosedyrer gir dyp innsikt i mindre frø med tynnere frøbelegg, fortsetter rydding av tomatfrø å være teknisk utfordrende, spesielt i de sene utviklingsstadiene.

Presentert her er en rask og arbeidsbesparende clearingprotokoll for å observere tomatfrøutvikling fra 3 til 23 dager etter blomstring når embryonal morfologi er nesten fullført. Denne metoden kombinerer klorhydratbasert clearingløsning som er mye brukt i Arabidopsis med andre modifikasjoner, inkludert utelatelse av formalin-aceto-alkohol (FAA) fiksering, tilsetning av natriumhypoklorittbehandling av frø, fjerning av myknet frøbeleggslim og vasking og vakuumbehandling. Denne metoden kan brukes til effektiv rydding av tomatfrø i forskjellige utviklingsstadier og er nyttig i full overvåking av utviklingsprosessen av mutantfrø med god romlig oppløsning. Denne clearingprotokollen kan også brukes på dyp avbildning av andre kommersielt viktige arter i Solanaceae.

Introduction

Tomat (S. lycopersicum L.) er en av de viktigste vegetabilske avlingene rundt om i verden, med en produksjon på 186,8 millioner tonn kjøttfulle frukter fra 5,1 millioner hektar i 20201. Den tilhører den store Solanaceae-familien med ca 2,716 arter2, inkludert mange kommersielt viktige avlinger som aubergine, paprika, potet og tobakk. Den kultiverte tomaten er en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstørrelse på ca. 900 Mb3. I lang tid har det blitt gjort store anstrengelser mot tomatdomestisering og avl ved å velge ønskelige egenskaper fra vill Solanum spp. Det er over 5000 tomattilganger oppført i Tomato Genetics Resource Center, og mer enn 80.000 bakterieplasma av tomater lagres over hele verden4. Tomatplanten er flerårig i drivhuset og forplantes av frø. Et modent tomatfrø består av tre hovedrom: et fullvoksent embryo, gjenværende endosperm av cellulær type og et hardt frøbelegg 5,6 (figur 1A). Etter dobbel befruktning går utviklingen av cellulær endosperm foran utviklingen av zygoter. Ved ~ 5-6 dager etter blomstring (DAF) observeres tocellet proembryo først når endospermen består av seks til åtte kjerner7. I Solanum pimpinellifolium nærmer embryoet seg sin endelige størrelse etter 20 DAF, og frø er levedyktige for spiring etter 32 DAF8. Etter hvert som embryoet utvikler seg, absorberes endospermen gradvis, og bare en liten mengde endosperm forblir i frøet. Den gjenværende endospermen består av mikropylær endosperm som omgir radikelspissen, og lateral endosperm i resten av frøet 9,10. Den ytre frøbelegget er utviklet fra fortykket og lignifisert ytre epidermis av integumentet, og med de døde lagene av integumentrester danner de et hardt skall for å beskytte embryoet og endospermen5.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av et modent frø i Solanum lycopersicum og Arabidopsis thaliana. (A) Langsgående anatomi av et modent tomatfrø. (B) Langsgående anatomi av et modent Arabidopsis-frø. Et modent tomatfrø er omtrent 70 ganger større i størrelse enn et Arabidopsis-frø. Skala barer = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Produksjon av tomatfrø av høy kvalitet avhenger av koordineringen mellom embryoet, endospermen og morsfrøkomponentene11. Dissekering av viktige gener og nettverk i frøutvikling krever en dyp og fullsporet fenotypisk registrering av mutante frø. Konvensjonelle innebyggingsteknikker, som den halvtynne delen og parafinseksjonen, brukes mye på tomatfrø for å observere de lokale og finere strukturene til embryoet12,13,14,15. Imidlertid er det vanligvis arbeidskrevende å analysere frøutviklingen fra tynne seksjoner og mangler romlig oppløsning på z-aksen. Til sammenligning er vevsrydding en rask og effektiv metode for å finne utviklingsstadiet av embryodefekter som mest sannsynlig vil oppstå16. Clearingmetoden reduserer ugjennomsiktigheten av indre vev ved å homogenisere brytningsindeksen med ett eller flere biokjemiske midler16. Hele vevsrydding tillater observasjon av en plantevevstruktur uten å ødelegge integriteten, og kombinasjonen av clearingteknologi og tredimensjonal avbildning har blitt en ideell løsning for å få informasjon om morfologien og utviklingstilstanden til et planteorgan17,18. Gjennom årene har frøryddingsteknikker blitt brukt i forskjellige plantearter, inkludert Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare og Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Blant disse har hele eggløsningsryddingsteknologien vært en effektiv tilnærming til å studere frøutvikling av Arabidopsis, på grunn av sin lille størrelse, 4-5 lag av frøbeleggcellen og endospermen av kjernetypen24,25. Med kontinuerlig oppdatering av forskjellige clearingblandinger, for eksempel fremveksten av Hoyers løsning26, ble indre strukturer av byggeggløsningen avbildet med høy grad av klarhet, selv om endospermen utgjør hoveddelen av frøene. Embryogenese av sukkerroer kan observeres ved rydding kombinert med vakuumbehandling og mykning med saltsyre19. Ikke desto mindre, i motsetning til artene nevnt ovenfor, har embryologiske observasjoner ved å rydde protokoller i tomatfrø ikke blitt rapportert. Dette forhindrer detaljert undersøkelse av embryonal og frøutvikling av tomater.

Kloralhydrat brukes ofte som en clearingløsning som gjør at nedsenket vev og celler kan vises på forskjellige optiske plan, og bevarer cellene eller vevskomponentene vesentlig27,28,29. Kloralhydratbasert clearingprotokoll har blitt brukt til helmontering av frø for å observere embryo og endosperm av Arabidopsis21,28. Denne clearingløsningen er imidlertid ikke effektiv når det gjelder å rydde tomatfrø, som er mer ugjennomtrengelige enn Arabidopsisfrø. De fysiske barrierene inkluderer: (1) tomatintegumentet har nesten 20 cellelag ved 3 til 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen er cellulær type, ikke nukleær-type32, og (3) tomatfrø er omtrent 70 ganger større i størrelse33,34 og (4) produserer store mengder frøbelegg, som blokkerer penetrasjonen av clearingreagenser og påvirker visualiseringen av embryoceller.

Derfor presenterer denne rapporten en optimalisert kloralhydratbasert clearingmetode for helmontering av tomatfrø på forskjellige stadier, noe som muliggjør dyp avbildning av embryoutviklingsprosessen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av løsninger

  1. Forbered FAA-fiksativ ved å tilsette 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml iseddik og 45 ml 70% etanol i et 50 ml sentrifugerør. Vortex og oppbevar den ved 4 °C. Tilberedt FAA-fikseringsmiddel rett før bruk.
    FORSIKTIG: 37% formaldehyd er etsende og potensielt kreftfremkallende hvis det eksponeres eller inhaleres. Fikseringsmiddelet må utføres i en avtrekkshette mens du har på deg passende personlig verneutstyr.
  2. Forbered ryddeløsningen ved å tilsette 5 ml 100 % glyserol, 40 g kloralhydrat og 10 ml destillert vann i en 100 ml glassflaske innpakket med tinnfolie. Oppløs ved hjelp av en magnetisk omrører over natten ved romtemperatur. Den tilberedte oppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 6 måneder.
    FORSIKTIG: Kloralhydrat er kreftfremkallende og har en skarp lukt. Utfør eksperimentet i en avtrekkshette og bruk passende personlig verneutstyr. Kloralhydrat er lett å deliquesce i luften og bør ikke lagres i store mengder. Clearingløsningen kan brytes ned når den utsettes for lys og bør holdes borte fra lys.
  3. Forbered desinfeksjonsmiddeloppløsningen ved å tilsette 10 ml 6% natriumhypokloritt, 40 ml destillert vann og 50 μL Tween-20 i et 50 ml sentrifugerør. Vortex og lagre den ved romtemperatur. Forbered desinfeksjonsmiddeloppløsningen rett før bruk.
    MERK: Det effektive klorinnholdet i natriumhypokloritt som har blitt plassert i lang tid kan reduseres, og innholdet av 6% natriumhypokloritt kan økes i henhold til den faktiske situasjonen.

2. Innsamling av frø

  1. Så tomatfrø (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, se Materialtabell) i 8 cm × 8 cm × 8 cm firkantede bassenger fulle med en 1:1 blanding av blomsternæringsjord og substrat (v/v) (se Materialtabell), og vokse i et vekstrom med 16/8 timer lyse/mørke perioder ved 24 ± 2 °C (dag) og 18 ± 2 °C (natt), 60% -70% relativ fuktighet, og en lysintensitet på 4000 Lux. Omtrent 6 uker senere kom planter inn i blomstringsstadiet.
  2. Merk blomstringsdatoen for uavhengige blomster ved anthesis (åpningsvinkelen til kronbladene er 90 °), og registrer dagen etter blomstringen (DAF).
  3. Høst fruktene fra 3 til 23 DAF-tomatplanter og legg dem umiddelbart på is. Del frukt (frø eller embryoer) fra 3 til 23 DAF i tidlig (3-10 DAF), midt (11-16 DAF) og sen (17-23 DAF) frukt (frø eller embryoer).
    MERK: Ikke samle for mange frukter om gangen, og sørg for at frøene i hver frukt blir fjernet innen 1 time for videre behandling.
  4. For tidlige frukter, bryt frukten og legg den på et lysbilde, og samle friske frø forsiktig med presisjonstang under stereomikroskopet (se Materialtabell) ved 1x til 4x forstørrelse. For mellom- og senfrukter, bryt frukten og samle friske frø direkte ved hjelp av presisjonstang.

3. Kloralhydratbasert rydding av frø

MERK: Konvensjonelle35 og optimaliserte protokoller ble sammenlignet i denne studien for deres frøryddingseffektivitet.

  1. Rydding ved hjelp av en konvensjonell protokoll
    1. Plasser friske frø (oppnådd i trinn 2.4) umiddelbart i et 2 ml sentrifugerør som inneholder 1,5 ml FAA-fikseringsmiddel og inkuber på en orbital shaker (5 rpm, se Materialtabell) i 4 timer ved romtemperatur.
    2. Dehydrer disse frøene i en etanolserie på 70%, 95% og 100% etanol (v / v) i 1 time hver på en orbital shaker (5 rpm).
    3. Legg frøene i 3-5 dråper ryddeløsning (~ 100 μL) på lysbildet og dekk prøven forsiktig med en deksel. Erstatt lysbildet med et enkelt konkavt lysbilde (se Materialfortegnelse) for midtre og sene frø.
    4. Hold disse lysbildene eller enkle konkave lysbildene ved romtemperatur i 30 minutter (3 DAF), 2 timer (6 DAF), 1 dag (9 DAF), 3 dager (12 DAF) eller 7 dager (14 til 22 DAF), avhengig av utviklingsstadiene til frømaterialet (jo yngre materialene er, desto raskere blir clearinghastigheten).
    5. Observer prøvene med et DIC-mikroskop (differential interference contrast) utstyrt med et digitalkamera (se Materialfortegnelse) ved 10x, 20x og 40x forstørrelse. Juster og optimaliser den overførte lyslysstyrken, DIC-glidebryteren og kondensatoråpningen i sanntid for hver prøve og ta bilder.
  2. Fjerne ved hjelp av den optimaliserte protokollen
    1. Legg friske frø (oppnådd i trinn 2.4) direkte i et 2 ml sentrifugerør som inneholder 1,5 ml desinfeksjonsmiddeloppløsning (trinn 1.3).
      MERK: Antall frø samlet i 2 ml sentrifugerøret varierer i henhold til utviklingsstadiet av frøene. Detaljer er listet opp i tabell 1.
    2. Inkuber prøvene på en orbital shaker (30 o / min) ved romtemperatur i 3 til 50 minutter til det innerste frøbelegget er tydelig synlig. Kast desinfeksjonsmiddeloppløsningen.
      MERK: Inkubasjonstiden som kreves, avhenger av frøutviklingsstadiet (jo senere frøene, desto lengre blir inkubasjonstiden). Detaljer er listet opp i tabell 1.
    3. For midtre og sene frø, overfør frøene på et lysbilde og fjern frøslimet med tang og en dissekeringsnål under et stereomikroskop ved 1x til 4x forstørrelse. Overfør frøene tilbake til det opprinnelige sentrifugerøret ved hjelp av tang.
      MERK: Dette trinnet er ikke nødvendig for tidlige frø.
    4. Vask frøene 5x med 1,5 ml avionisert vann, 10 s hver gang. Kast det avioniserte vannet.
    5. Tilsett en clearingløsning på 2 × volumet av frøene, etterfulgt av vakuumbehandling i 0 til 50 minutter (tabell 1) med en vakuumpumpe (se materialfortegnelse). Intermitterende vakuumbehandling utføres med hver vakuumbehandling i 10 minutter fordelt med 10 minutters mellomrom.
    6. Bytt ut med en frisk ryddeløsning på 2 × volumet av frøene. Hold 2 ml sentrifugerøret som inneholder frøene ved romtemperatur og beskyttet mot lys i 30 minutter til 7 dager for å lette rydding (tabell 1). Under inkubasjonen, for sene embryoer, erstatt clearingløsningen daglig med frisk løsning og utsett frøene for vakuumbehandling i 10 minutter.
    7. Forbered de ryddede frøene på lysbilder eller enkeltkonkave lysbilder og observer med DIC-mikroskopet utstyrt med et digitalkamera med 10x, 20x og 40x forstørrelse. Juster og optimaliser den overførte lyslysstyrken, DIC-glidebryteren og kondensatoråpningen i sanntid for hver prøve og ta bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når tomatfrø ble fjernet ved hjelp av en konvensjonell metode som i Arabidopsis, blokkerte tette endospermceller visualiseringen av tidlige tomatembryoer ved 3 DAF og 6 DAF (figur 3A, B). Etter hvert som det totale volumet av embryoet økte, var et globulært embryo knapt å skille på 9 DAF (figur 3C). Men etter hvert som frøstørrelsen fortsatte å øke, ble permeabiliteten redusert, noe som resulterte i et fuzzy hjerteembryo ved 12 DAF (figur 3D). Fra 13 DAF og fremover ble frøslim og frøbelegg gradvis tettere, og forhindret penetrasjon av clearingmidler. Omrisset av embryoet inne i 14-19 DAF-frø var ekstremt uskarpt selv når behandlingstiden ble utvidet til 7 dager (figur 3E-G). I 22 DAF-frø var frøets indre struktur helt usynlig (figur 3H).

Derfor ble den konvensjonelle klorhydratbaserte clearingprosedyren optimalisert for å muliggjøre effektiv rydding av tomatfrø. Detaljer om alle trinnene er oppført i tabell 1. For det første ble FAA-fikserings- og etanoldehydreringstrinnene, som ofte kreves i konvensjonelle clearingprosedyrer, utelatt fra protokollen. Mens FAA-fiksering vanligvis brukes til å bevare den morfologiske strukturen og cellulære komponenter fra forfall, ble det funnet (i denne studien) at den indre strukturen av tomatfrø ikke lett ble deformert og var godt bevart til tross for fraværet av FAA-fiksering og etanoldehydrering.

For det andre er frøbeleggslim produsert av frøbeleggets epidermale celler svært fremtredende fra 13 DAF og fremover (figur 4). Polysakkaridrik frøslimhinne viste høy viskositet og betydelig lav permeabilitet35,36. Innledende forsøk på å fjerne den uten å ødelegge frøbelegget ved hjelp av fine tang og nåler under et dissekeringsmikroskop mislyktes dessverre. Dette skyldes at frøbelegget er sprøtt og koblet tett til slimhinnen. Videre fører eksistensen av pigment i frøbelegget ytterligere til nedgangen i kvaliteten på lysfeltbildet37. For å overvinne dette problemet ble frøene behandlet med en desinfiserende løsning på 1,2% natriumhypokloritt og 0,1% Tween 20. Blekeeffekten av natriumhypokloritt muliggjør en klar identifisering av det indre frøbelegget og skaper et relativt sterilt miljø som gjorde det mulig å lagre prøver i lang tid. Bruk av vaskemiddel Tween 20 kan senke overflatespenningen og øke frøpermeabiliteten. Enda viktigere, etter dette trinnet, kan det meste av den vedheftende mucilage løsnes fra frøet uten å skade frøbelegget (figur 4). Fra nå av ble de behandlede frøene samlet i et 2 ml sentrifugerør og ble inkubert ved romtemperatur i en orbital shaker (30 rpm).

For det tredje ble vakuumbehandling brukt til å akselerere penetrasjonen av clearingløsningen til embryoene i midtre og sene stadier. Til slutt, fordi tomatfrø er spesielt større etter 12 DAF, ble konvensjonelle lysbilder erstattet med enkle konkave lysbilder ved DIC-avbildning.

Etter behandling i henhold til den optimaliserte clearingprotokollen viste tomatfrø tilfredsstillende gjennomsiktighet i alle testede utviklingsstadier (figur 5A-L). I motsetning til uklare cellekonturer oppnådd ved bruk av konvensjonelle protokoller, var forskjellige cellelag av frøbelegget ved 3 DAF synlige (figur 5A). Endospermceller var mer gjenkjennelige ved 5 DAF (figur 5B). Det pinneformede embryoet dukket opp ved 7 DAF, og deretter nådde embryoet kulestadiet ved 9 DAF og hjertestadiet ved 11 DAF (figur 5C-E). Under disse utviklingsstadiene var konturene av cellene inne i embryoet tydeligst synlige. Sammenlignet med den konvensjonelle metoden ga den optimaliserte protokollen betydelig bedre kvalitetsbilder fra hjertestadiet til det modne embryostadiet. Da embryonal utvikling nådde det tidlige torpedostadiet ved 13 DAF, det midterste torpedostadiet ved 14 DAF, det sene torpedostadiet ved 15 DAF, det tidlige cotyledonstadiet ved 16 DAF, det bøyde kotyledonstadiet ved 19 DAF og 21 DAF, og det modne embryoet ved 23 DAF, ble graden av krøllen av cotyledoner og skuddapikal meristem veldig lett fanget (figur 5F-L ). Men utover 23 DAF var det ikke mulig å visualisere detaljene i embryoet, selv når clearingbehandlingen ble forlenget til over 1 uke.

Figure 2
Figur 2: Flytskjema for konvensjonell protokoll og optimalisert protokoll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Differensielle interferenskontrastbilder av S. lycopersicum-ovler behandlet med konvensjonell clearingmetode. (A) En eggløsning med uklar embryosekk ved 3 DAF. (B) Embryosekk med synlige endospermceller (pilspisser) ved 6 DAF. (C) Et knapt gjenkjennelig kuleformet embryo ved 9 DAF. Et uklart embryo ved (D) 12, (E) 14, (F) 16 og (G) 19 DAF. (H) Frøets indre struktur er helt usynlig ved 22 DAF. Skala barer = 25 μm; em = embryo; es = embryo sac. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Desinfeksjon av S. lycopersicumfrø i ulike utviklingsstadier. De øverste bildene (A1-F1) er de stripete frøene fra utviklingsfruktene ved (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 og (F1) 21 DAF, mens de nederste bildene (A2-F2) er frø behandlet med desinfiserende løsning. I A2-F2 kan den indre frøbeleggkonturen identifiseres tydelig. Vektstenger = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Differensielle interferenskontrastbilder av S. lycopersicum-embryoer fjernet ved hjelp av den optimaliserte protokollen. (A-L) DIC-mikroskopibilder av tomateggløsningen med synlig embryosekk ved (A) 3 DAF og (B) 5 DAF, (C) et pinneformet embryo ved 7 DAF, (D) et kuleformet embryo ved 9 DAF, (E) et hjerteembryo ved 11DAF, (F) et tidlig torpedoembryo ved 13 DAF, (G) et midtre torpedoembryo 14 DAF, (H) et sent torpedoembryo ved 15 DAF, (I) et tidlig cotyledon-embryo ved 16 DAF, et bent-cotyledon-embryo ved (J) 19 DAF og (K) 21 DAF, og (L) et modent embryo ved 23 DAF. Skala barer = 50 μm; em = embryo; sc = frøbelegg; no = endosperm; es = embryo sac; hy = hypokotyl; co = cotyledon; r = radikel; sa = skyt apikal. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vev behandling Embryo utvikling
3-7 DAF 8-10 DAF 11-13 DAF 14-16 DAF 17-20 DAF 21-23 DAF
1 Antall friske frø 50 40 30 20 15 10
2 Desinfeksjon 1,5 ml, 3 min 1,5 ml, 10 min 1,5 ml, 20 min 1,5 ml, 30 min 1,5 ml, 40 min 1,5 ml, 50 min
3 Peeling av mucilage Nei Nei Ja Ja Ja Ja
4 Klesvask 5x 10 s
5 Lysning 2x volumet av frø
6 Støvsuging Nei 1 x 10 minutter 2 x 10 minutter 3 x 10 minutter 4 x 10 minutter 5 x 10 minutter
7 Inkubasjon 30 minutter 2 timer 3 timer 8 timer 1–4 dager 3–7 dager

Tabell 1: Optimalisering av protokollen for å forbedre clearingeffektiviteten i tomatfrø. 1 = Batchoperasjoner, rydding av observasjon av et stort antall frø samtidig; frø ble plassert i et 2 ml sentrifugerør. 2 = Desinfeksjon ved bruk av 6% NaClO: dH2O: Tween-20, i proporsjoner på 200: 800: 1 (v / v); Alle trinnene ble utført på en orbital shaker med 30 rpm risting. 3 = Alle trinnene ble utført under et dissekeringsmikroskop med tang og dissekeringsnåler med mindre annet er spesifisert. 4 = Frøene ble vasket med destillert vann etter hvert trinn. 5 = Clearing med 100% glyserol: kloralhydrat: dH 2 O, i proporsjoner på 1: 8:2(v / w / v). 6 = Hver vakuumbehandling varte i 10 min og ble fordelt med 10 minutters mellomrom. 7 = Bytt ut med fersk ryddeløsning og oppbevar frø vekk fra lys ved romtemperatur; for frø fra 17 DAF til 23 DAF, erstatt ryddeløsning med fersk løsning og vakuum i 10 minutter hver dag gjennom hele inkubasjonsperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med mekanisk seksjonering er clearingteknologien mer fordelaktig for tredimensjonal avbildning, da den beholder integriteten til plantevev eller organer16. Konvensjonelle clearingprotokoller er ofte begrenset til små prøver på grunn av lettere penetrasjon av kjemiske løsninger. Tomatfrø er en problematisk prøve for vevsrydding fordi den er omtrent 70 ganger større enn et Arabidopsis-frø i størrelse og har flere permeabilitetsbarrierer. Arabidopsis frøbelegg består av fire til fem levende cellelag avledet fra ytre integument og indre integument24. Imidlertid, sammenlignet med Arabidopsis, er det 22-27 parenkymale cellelag (i scenen av det kuleformede embryoet) i tomatfrøbelegget6. Det innerste laget av tomatfrøbelegget består av suberin og er kjent som det semipermeable laget, som har vist seg å være en barriere for bevegelse av vannløselige forbindelser38. I tillegg viste polysakkaridrik frøslimhinne en høy viskositet og en betydelig lav permeabilitet, noe som hindret penetrasjonen av clearingløsningen. Det pigmentrike frølaget med tomat reduserer også bildekvaliteten35,36,37. Historisk er fjerning av pigmenter løst ved bruk av oksidanter ledsaget av oppvarming eller langvarig behandling 37,39,40,41. Imidlertid er det ikke rapportert noen anvendelse av oksidanter i clearingmetoden basert på kloralhydrat.

I denne studien ble frøene behandlet før clearingsprosessen med en desinfiserende løsning som inneholder natriumhypokloritt, supplert med et overflateaktivt middel Tween 20. Overraskende, etter behandling med desinfeksjonsløsningen (3 til 50 min), kan mucilage av tomatfrø lett fjernes, noe som forbedrer permeabiliteten til frøene. Blekingsprosessen av frøbelegget kan observeres i sanntid, og varigheten av frødesinfeksjon justeres tilsvarende. Blekeprosessen opprettholder også et relativt sterilt miljø, og tillater dermed etterfølgende lagring av de behandlede frøene i 8 måneder uten forurensning.

Den optimaliserte protokollen utviklet i studien oppnådde generell gjennomsiktighet av tomatfrø fra 3 DAF til 23 DAF. Fordelene med denne protokollen gjenspeiles hovedsakelig i følgende aspekter: For det første forkortet eliminering av FAA-fiksering og påfølgende etanolgradientdehydrering behandlingstiden med minst 7 timer. Bruken av natriumhypoklorittbehandling kombinert med clearingløsning forbedret permeabiliteten til frøene betydelig og visualisering av det innerste laget av frøbelegget. Til slutt, for mellomembryoer, kan bilder av embryoer av høy kvalitet anskaffes etter 10 timer, mens det tar minst 3 dager med tradisjonelle protokoller.

Til tross for fordelene med denne protokollen, har den to viktige begrensninger. For det første, ved 5 DAF, ble den tidlige proembryoen på to- til sekstencellet stadium ikke observert, noe som sannsynligvis skyldtes de tette og større cellulære endospermcellene som hindret visualiseringen av embryoer. For det andre, selv om morfologien til tomatembryoet er nesten komplett på rundt 23 DAF, kunne ikke forskjellige bilder for frø etter 24 DAF oppnås med denne optimaliserte metoden. Det er mulig at når embryoet nærmer seg full størrelse, tykner kutikulaen på overflaten av endospermen betydelig, restene av døende integument parenchyma-celler danner tette lag og de ytre epidermiscellene i integumentet øker dramatisk i lignifisering6. Disse antyder en drastisk reduksjon i frøpenetrasjonskapasiteten, noe som gjør det umulig å visualisere det indre vevet med eksisterende metoder.

Avslutningsvis gir denne optimaliserte protokollen et effektivt middel for å finne den unormale perioden med embryonal utvikling, noe som gir grunnlag for observasjon av finere cellestrukturer ved hjelp av skiveteknikker. Videre vil denne metoden til en viss grad sannsynligvis gi et referanseskjema for andre kommersielt viktige avlinger i Solanaceae, som poteter, aubergine, paprika og tobakk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Dr. Jie Le og Dr. Xiufen Song for deres nyttige forslag til henholdsvis differensiell interferenskontrastmikroskopi og konvensjonell clearingmetode. Denne forskningen ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (31870299) og Youth Innovation Promotion Association of the Chinese Academy of Sciences. Figur 2 ble opprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 187
En effektiv clearingprotokoll for studier av frøutvikling i tomat (<em>Solanum lycopersicum</em> L.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An… More

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter