Summary
Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Этот протокол полезен для очистки семян томатов на разных стадиях развития, чтобы наблюдать более тонкую эмбриональную структуру.
Abstract
Помидор (Solanum lycopersicum L.) является одной из основных товарных культур во всем мире. Семена томатов являются важной моделью для изучения генетики и биологии развития во время размножения растений. Визуализация более тонкой эмбриональной структуры внутри семени томата часто затруднена слизистой оболочкой семян, многоклеточным слоистым покровом и толстостенным эндоспермом, который необходимо устранить трудоемким встраиванием-сечением. Более простой альтернативой является использование методов очистки тканей, которые делают семена почти прозрачными с помощью химических агентов. Хотя обычные процедуры очистки позволяют глубоко проникнуть в более мелкие семена с более тонкой семенной оболочкой, очистка семян томатов по-прежнему является технически сложной задачей, особенно на поздних стадиях развития.
Здесь представлен быстрый и трудосберегающий протокол очистки для наблюдения за развитием семян томатов от 3 до 23 дней после цветения, когда эмбриональная морфология почти завершена. Этот метод сочетает в себе раствор очистки на основе хлоралгидрата, широко используемый в Арабидопсисе , с другими модификациями, включая пропуск фиксации формалин-ацето-спирта (FAA), добавление обработки семян гипохлоритом натрия, удаление размягченной слизи семенной оболочки, а также промывку и вакуумную обработку. Этот метод может быть применен для эффективной очистки семян томатов на разных стадиях развития и полезен при полном мониторинге процесса развития мутантных семян с хорошим пространственным разрешением. Этот протокол очистки может также применяться для глубокой визуализации других коммерчески важных видов в Solanaceae.
Introduction
Томат (S. lycopersicum L.) является одной из важнейших овощных культур во всем мире, с объемом производства 186,8 млн. тонн мясистых фруктов с 5,1 млн. га в 2020 году1. Он принадлежит к большому семейству пасленовых, насчитывающему около 2 716 видов2, включая многие коммерчески важные культуры, такие как баклажаны, перец, картофель и табак. Культивируемый помидор является диплоидным видом (2n = 2x = 24) с размером генома около 900 Mb3. В течение долгого времени были приложены большие усилия для одомашнивания и селекции томатов путем отбора желаемых признаков из дикого Solanum spp. В Центре генетических ресурсов томатов зарегистрировано более 5000 томатов, и во всем мире хранится более 80 000 зародышевой плазмы помидоров4. Растение томат является многолетним в теплице и размножается семенами. Зрелое семя томата состоит из трех основных отсеков: полноценного эмбриона, остаточного эндосперма клеточного типа и твердой семенной оболочки 5,6 (рисунок 1А). После двойного оплодотворения развитию эндосперма клеточного типа предшествует развитие зигот. Через ~5-6 дней после цветения (DAF) впервые наблюдается двухклеточное проэмбрио, когда эндосперм состоит из шести-восьми ядер7. В Solanum pimpinellifolium эмбрион приближается к своему окончательному размеру после 20 DAF, а семена жизнеспособны для прорастания после 32 DAF8. По мере развития эмбриона эндосперм постепенно всасывается и в семени остается лишь небольшое количество эндосперма. Остаточный эндосперм состоит из микропирлярного эндосперма, окружающего кончик радика, и бокового эндосперма в остальной части семени 9,10. Наружная семенная оболочка развивается из утолщенного и одревесного наружного эпидермиса покрова, а с отмершими слоями остатков покрова они образуют твердую оболочку для защиты эмбриона и эндосперма5.
Рисунок 1: Схематическое изображение зрелого семени у Solanum lycopersicum и Arabidopsis thaliana. (A) Продольная анатомия зрелого семени томата. (B) Продольная анатомия зрелого семени Arabidopsis . Зрелое семя помидора примерно в 70 раз больше по размеру, чем семя арабидопсиса . Шкала = (A) 400 мкм, (B) 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Производство высококачественных семян томатов зависит от координации между компонентами эмбриона, эндосперма и материнского семенного компонента11. Препарирование ключевых генов и сетей в развитии семян требует глубокой и полной фенотипической регистрации мутантных семян. Традиционные методы встраивания-сечения, такие как полутонкое сечение и парафиновое сечение, широко применяются к семенам томатов для наблюдения за местными и более тонкими структурами эмбриона 12,13,14,15. Однако анализ развития семян из тонких участков обычно трудоемкий и не имеет пространственного разрешения по оси Z. Для сравнения, очистка тканей является быстрым и эффективным методом для точного определения стадии развития дефектов эмбриона, которые, скорее всего, произойдут16. Способ очистки уменьшает непрозрачность внутренней ткани путем гомогенизации показателя преломления одним или несколькими биохимическими агентами16. Очистка всей ткани позволяет наблюдать структуру растительной ткани, не разрушая ее целостность, а сочетание технологии очистки и трехмерной визуализации стало идеальным решением для получения информации о морфологии и состоянии развития растительного органа17,18. На протяжении многих лет методы очистки семян использовались у различных видов растений, включая Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare и Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Среди них технология очистки яйцеклеток с цельной горой была эффективным подходом к изучению развития семян Arabidopsis, благодаря его небольшому размеру, 4-5 слоям клетки семенной оболочки и эндосперму ядерного типа24,25. При постоянном обновлении различных очищающих смесей, таких как появление раствораХойера 26, внутренние структуры яйцеклетки ячменя были изображены с высокой степенью прозрачности, хотя ее эндосперм составляет основную часть семян. Эмбриогенез сахарной свеклы можно наблюдать путем очистки в сочетании с вакуумной обработкой и размягчения соляной кислотой19. Тем не менее, в отличие от видов, упомянутых выше, об эмбриологических наблюдениях путем очистки протоколов в семенах томатов не сообщалось. Это препятствует детальному исследованию эмбрионального и семенного развития томатов.
Хлоралгидрат обычно используется в качестве очищающего раствора, который позволяет погружаться тканям и клеткам отображаться на различных оптических плоскостях и по существу сохраняет клетки или тканевые компоненты 27,28,29. Протокол очистки на основе хлоралгидрата был успешно использован для очистки семян по всей установке для наблюдения за зародышем и эндоспермом Arabidopsis 21,28. Однако этот очистительный раствор не эффективен при очистке семян томатов, которые более непроницаемы, чем семена арабидопсиса. Физические барьеры включают: (1) кожный покров томата имеет почти 20 клеточных слоев при 3-15 DAF30,31, (2) эндосперм томата клеточного типа, а не ядерного типа32, и (3) семена томатов примерно в 70 раз больше поразмеру 33,34 и (4) производят большое количество слизи семенной оболочки, что блокирует проникновение очищающих реагентов и влияет на визуализацию эмбриональных клеток.
Таким образом, в настоящем отчете представлен оптимизированный метод очистки на основе хлоралгидрата для полной очистки семян томатов на разных стадиях, который позволяет глубоко визуализировать процесс развития эмбриона (рисунок 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов
- Приготовьте фиксатор FAA, добавив 2,5 мл 37% формальдегида, 2,5 мл ледниковой уксусной кислоты и 45 мл 70% этанола в 50 мл центрифужной трубки. Вихрь и храните его при 4 °C. Только что приготовьте фиксатор FAA непосредственно перед использованием.
ВНИМАНИЕ: 37% формальдегида является коррозионным и потенциально канцерогенным при воздействии или вдыхании. Фиксатор необходимо выполнять в вытяжном капюшоне при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты. - Приготовьте очищающий раствор, добавив 5 мл 100% глицерина, 40 г хлоралгидрата и 10 мл дистиллированной воды в стеклянную бутылку емкостью 100 мл, обернутую оловянной фольгой. Растворить с помощью магнитной мешалки на ночь при комнатной температуре. Приготовленный раствор можно хранить при 4 °C до 6 месяцев.
ВНИМАНИЕ: Хлоралгидрат является канцерогенным и имеет резкий запах. Проведите эксперимент в вытяжке и наденьте соответствующие средства индивидуальной защиты. Хлоралгидрат легко расщепляется в воздухе и не должен храниться в больших количествах. Очищающий раствор может разлагаться при воздействии света и должен храниться подальше от света. - Приготовьте дезинфицирующий раствор, добавив 10 мл 6% гипохлорита натрия, 40 мл дистиллированной воды и 50 мкл Tween-20 в 50 мл центрифужной трубки. Вихрь и храните его при комнатной температуре. Свежеприготовьте дезинфицирующий раствор непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективное содержание хлора в гипохлорите натрия, которое было размещено в течение длительного времени, может уменьшаться, а содержание 6% гипохлорита натрия может быть увеличено в соответствии с фактической ситуацией.
2. Сбор семян
- Сейте семена томатов (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, см. Таблицу материалов) в 8 см × 8 см × 8 см квадратных бассейнах, заполненных смесью 1:1 цветочной питательной почвы и субстрата (v/v) (см. Таблицу материалов), и выращивайте в комнате для роста с периодами 16/8 ч света/темноты при 24 ± 2 °C (день) и 18 ± 2 °C (ночью), Относительная влажность 60%-70% и интенсивность света 4000 люкс. Примерно через 6 недель растения вступили в стадию цветения.
- Пометьте дату цветения независимых цветов на антезисе (угол раскрытия лепестков составляет 90°) и запишите день после цветения (DAF).
- Соберите плоды от 3 до 23 растений томатов DAF и сразу же положите их на лед. Разделите плоды (семена или эмбрионы) от 3 до 23 DAF на ранние (3-10 DAF), средние (11-16 DAF) и поздние (17-23 DAF) плоды (семена или эмбрионы).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не собирайте слишком много плодов за один раз и убедитесь, что семена в каждом плоде удаляются в течение 1 ч для дальнейшей обработки. - Для ранних плодов разбейте плод и положите его на горку, а свежие семена тщательно соберите с помощью точных щипцов под стереомикроскопом (см. Таблицу материалов) с увеличением от 1x до 4x. Для средних и поздних плодов разбейте плоды и непосредственно соберите свежие семена с помощью прецизионных щипцов.
3. Очистка семян на основе хлоралгидрата
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании сравнивались обычные35 и оптимизированные протоколы на предмет эффективности очистки семян.
- Очистка по обычному протоколу
- Поместите свежие семена (полученные на стадии 2.4) непосредственно в центрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую фиксатор FAA 1,5 мл, и инкубируйте на орбитальном шейкере (5 об/мин, см. Таблицу материалов) в течение 4 ч при комнатной температуре.
- Обезвоживайте эти семена в серии этанола 70%, 95% и 100% этанола (v/v) в течение 1 ч каждый на орбитальном шейкере (5 об/мин).
- Поместите семена в 3-5 капель очищающего раствора (~100 мкл) на слайд и аккуратно накройте образец крышкой. Замените слайд одним вогнутым слайдом (см. Таблицу материалов) для средних и поздних семян.
- Держите эти слайды или одиночные вогнутые слайды при комнатной температуре в течение 30 мин (3 DAF), 2 ч (6 DAF), 1 день (9 DAF), 3 дня (12 DAF) или 7 дней (от 14 до 22 DAF) в зависимости от стадий развития семенного материала (чем моложе материалы, тем быстрее скорость очистки).
- Наблюдайте за образцами с помощью дифференциального интерференционно-контрастного (DIC) микроскопа, оснащенного цифровой камерой (см. Таблицу материалов) с увеличением 10x, 20x и 40x. Отрегулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захват изображений.
- Очистка по оптимизированному протоколу
- Поместите свежие семена (полученные на стадии 2.4) непосредственно в центрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую дезинфицирующий раствор 1,5 мл (стадия 1.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество семян, собранных в центрифужной трубке объемом 2 мл, варьируется в зависимости от стадии развития семян. Подробная информация приведена в таблице 1. - Инкубируйте образцы на орбитальном шейкере (30 об/мин) при комнатной температуре в течение 3-50 мин до тех пор, пока не будет хорошо виден самый внутренний контур семенного слоя. Выбросьте дезинфицирующий раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое время инкубации зависит от стадии развития семян (чем позже семена, тем дольше будет время инкубации). Подробная информация приведена в таблице 1. - Для средних и поздних семян переложите семена на слайд и удалите семенную слизь щипцами и рассекающей иглой под стереомикроскопом с увеличением от 1 до 4 раз. Перенесите семена обратно в исходную центрифужную трубку с помощью щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является необходимым для ранних семян. - Промывайте семена 5 раз деионизированной водой объемом 1,5 мл, каждый раз по 10 с. Выбросьте деионизированную воду.
- Добавляют очищающий раствор 2 × объем семян с последующей вакуумной обработкой в течение 0 - 50 мин (таблица 1) вакуумным насосом (см. Таблицу материалов). Прерывистая вакуумная обработка проводится с каждой вакуумной обработкой в течение 10 мин с интервалом в 10 мин.
- Заменить свежим очищающим раствором 2 × объема семян. Держите центрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую семена, при комнатной температуре и защищенной от света в течение 30-7 дней для облегчения очистки (таблица 1). Во время инкубации для поздних эмбрионов ежедневно заменяйте очищающий раствор свежим раствором и подвергайте семена вакуумной обработке в течение 10 мин.
- Подготовьте очищенные семена на слайдах или одновогнутых слайдах и наблюдайте с помощью микроскопа DIC, оснащенного цифровой камерой с увеличением 10x, 20x и 40x. Отрегулируйте и оптимизируйте яркость пропускаемого света, ползунок DIC и диафрагму конденсатора в режиме реального времени для каждого образца и захват изображений.
- Поместите свежие семена (полученные на стадии 2.4) непосредственно в центрифужную трубку объемом 2 мл, содержащую дезинфицирующий раствор 1,5 мл (стадия 1.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда семена томатов очищали с использованием обычного метода, как в Arabidopsis, плотные клетки эндосперма блокировали визуализацию ранних эмбрионов томатов при 3 DAF и 6 DAF (рисунок 3A, B). По мере увеличения общего объема эмбриона шаровидный эмбрион был едва различим при 9 DAF (рисунок 3C). Однако, поскольку размер семян продолжал увеличиваться, их проницаемость уменьшалась, что приводило к нечеткому сердечному эмбриону при 12 DAF (рисунок 3D). Начиная с 13 DAF, слизь семян и семенная оболочка постепенно становились плотнее, предотвращая проникновение очищающих агентов. Контур эмбриона внутри 14-19 семян DAF был чрезвычайно размытым даже тогда, когда время обработки было увеличено до 7 дней (рисунок 3E-G). В 22 семенах DAF внутренняя структура семени была полностью невидимой (рисунок 3H).
Поэтому обычная процедура очистки на основе хлоралгидрата была оптимизирована для обеспечения эффективной очистки семян томатов. Подробная информация обо всех шагах приведена в таблице 1. Во-первых, этапы фиксации FAA и обезвоживания этанола, которые часто требуются в обычных процедурах очистки, были исключены из протокола. В то время как фиксация FAA обычно используется для сохранения морфологической структуры и клеточных компонентов от распада, было обнаружено (в этом исследовании), что внутренняя структура семян томатов не была легко деформирована и хорошо сохранилась, несмотря на отсутствие фиксации FAA и обезвоживания этанола.
Во-вторых, слизь семенной оболочки, продуцируемая эпидермальными клетками семенной оболочки, очень заметна начиная с 13 DAF и далее (рисунок 4). Богатая полисахаридами семенная слизь показала высокую вязкость и значительно низкую проницаемость35,36. Первоначальные испытания по его удалению без разрушения семенной оболочки с помощью тонких щипцов и игл под рассекающим микроскопом, к сожалению, не увенчались успехом. Это связано с тем, что оболочка семян хрупкая и плотно связана со слизью. Более того, наличие пигмента в семенной оболочке в дальнейшем приводит к снижению качества изображения яркого поля37. Чтобы преодолеть эту проблему, семена обрабатывали дезинфицирующим раствором 1,2% гипохлорита натрия и 0,1% Tween 20. Отбеливающий эффект гипохлорита натрия позволяет четко идентифицировать внутреннюю оболочку семян и создает относительно стерильную среду, которая позволяет хранить образцы в течение длительного времени. Использование моющего средства Tween 20 позволяет снизить поверхностное натяжение и увеличить проницаемость семян. Что еще более важно, после этого этапа большая часть адгезивной слизи может быть отделена от семени, не повреждая семенную оболочку (рисунок 4). Отныне обработанные семена объединяли в центрифужной трубке объемом 2 мл и инкубировали при комнатной температуре в орбитальном шейкере (30 об/мин).
В-третьих, вакуумная обработка применялась для ускорения проникновения очищающего раствора к эмбрионам на средней и поздней стадиях. Наконец, поскольку семена томатов особенно крупнее после 12 DAF, обычные слайды были заменены одиночными вогнутыми слайдами при визуализации ДВС-синдрома.
После обработки в соответствии с оптимизированным протоколом очистки семена томатов показали удовлетворительную прозрачность на всех проверенных стадиях развития (рисунок 5A-L). В отличие от нечетких контуров клеток, полученных с использованием обычных протоколов, были видны отдельные клеточные слои семенного слоя при 3 DAF (рисунок 5A). Клетки эндосперма были более различимы при 5 DAF (рисунок 5B). Палочковидный эмбрион появился на 7 DAF, а затем эмбрион достиг шаровидной стадии на 9 DAF и стадии сердца на 11 DAF (рисунок 5C-E). На этих этапах развития контуры клеток внутри эмбриона были наиболее четко видны. По сравнению с обычным методом, оптимизированный протокол дал значительно более качественные изображения от стадии сердца до стадии зрелого эмбриона. Когда эмбриональное развитие достигло ранней стадии торпеды в 13 DAF, средней ступени торпеды в 14 DAF, поздней торпедной ступени в 15 DAF, ранней стадии семядолона в 16 DAF, стадии изогнутого семядолона в 19 DAF и 21 DAF и зрелого эмбриона в 23 DAF, степень завитка семядолий и побеговой апикальной меристемы была очень легко захвачена (рисунок 5F-L). ). Однако, помимо 23 DAF, было невозможно визуализировать детали в эмбрионе, даже когда очищающее лечение было продлено до более чем 1 недели.
Рисунок 2: Блок-схема обычного протокола и оптимизированного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Дифференциальные интерференционные контрастные изображения яйцеклеток S. lycopersicum , обработанные с использованием традиционного метода очистки. (A) Яйцеклетка с нечетким эмбриональным мешком при 3 DAF. (B) Эмбриональный мешок с видимыми клетками эндосперма (наконечники стрелок) при 6 DAF. (C) Едва различимый шаровидный эмбрион при 9 DAF. Нечеткий эмбрион при (D) 12, (E) 14, (F) 16 и (G) 19 DAF. (H) Внутренняя структура семени полностью невидима при 22 DAF. Шкала стержней = 25 мкм; em = эмбрион; es = эмбриональный мешок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Дезинфекция семян S. lycopersicum на разных стадиях развития. Верхние изображения (A1-F1) представляют собой полосатые семена развивающихся плодов при (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 и (F1) 21 DAF, в то время как нижние изображения (A2-F2) представляют собой семена, обработанные дезинфицирующим раствором. В A2-F2 можно четко определить внутренний контур семенного покрова. Шкала стержней = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Дифференциальные интерференционные контрастные изображения эмбрионов S. lycopersicum очищены с использованием оптимизированного протокола. (A-L) микроскопические изображения яйцеклетки томата с видимым эмбриональным мешком при (A) 3 DAF и (B) 5 DAF, (C) палочковидный эмбрион при 7 DAF, (D) шаровидный эмбрион при 9 DAF, (E) эмбрион сердца при 11DAF, (F) ранний торпедный эмбрион при 13 DAF, (G) средний эмбрион торпеды 14 DAF, (H) поздний торпедный эмбрион при 15 DAF, (I) ранне-семяледонный эмбрион при 16 DAF, эмбрион bent-cotyledon при (J) 19 DAF и (K) 21 DAF и (L) зрелый эмбрион при 23 DAF. Шкала стержней = 50 мкм; em = эмбрион; sc = семенная оболочка; en = эндосперм; es = эмбриональный мешок; hy = гипокотил; co = семядолон; r = радикль; sa = побег апикальный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Обработка тканей | Развитие эмбриона | ||||||
| 3-7 ДАФ | 8-10 ДАФ | 11-13 ДАФ | 14-16 ДАФ | 17-20 ДАФ | 21-23 ДАФ | ||
| 1 | Количество свежих семян | 50 | 40 | 30 | 20 | 15 | 10 |
| 2 | Дезинфекция | 1,5 мл, 3 мин | 1,5 мл, 10 мин | 1,5 мл, 20 мин | 1,5 мл, 30 мин | 1,5 мл, 40 мин | 1,5 мл, 50 мин |
| 3 | Отслаивание слизи | Нет | Нет | Да | Да | Да | Да |
| 4 | Стирка | 5x 10 с | |||||
| 5 | Очистка | 2x объем семян | |||||
| 6 | Пылесосом | Нет | 1 x 10 мин | 2 x 10 мин | 3 x 10 мин | 4 x 10 мин | 5 x 10 мин |
| 7 | Инкубация | 30 мин | 2 ч | 3 ч | 8 ч | 1–4 дня | 3–7 дней |
Таблица 1: Оптимизация протокола для повышения эффективности очистки семян томатов. 1 = пакетные операции, очистка наблюдения за большим количеством семян одновременно; семена помещали в центрифужную трубку объемом 2 мл. 2 = дезинфекция с использованием 6% NaClO:dH2O:Tween-20, в пропорциях 200:800:1 (v/v); все шаги выполнялись на орбитальном шейкере с встряхиванием 30 об/мин. 3 = Все этапы выполнялись под рассекающим микроскопом с щипцами и рассекающими иглами, если не указано иное. 4 = Семена промывали дистиллированной водой после каждого этапа. 5 = Очистка с использованием 100% глицерина:хлоралгидрата:dH2O, в пропорциях 1:8:2 (v/w/v). 6 = Каждая вакуумная обработка длилась 10 минут и размещалась с интервалом в 10 минут. 7 = Заменить свежим очищающим раствором и хранить семена вдали от света при комнатной температуре; для семян от 17 DAF до 23 DAF заменить очищающий раствор свежим раствором и пылесосить в течение 10 мин каждый день в течение всего инкубационного периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с механическим сечением, технология очистки более выгодна для трехмерной визуализации, поскольку она сохраняет целостность растительных тканей или органов16. Обычные протоколы очистки часто ограничиваются небольшими образцами из-за более легкого проникновения химических растворов. Семена томатов являются проблематичным образцом для очистки тканей, потому что они примерно в 70 раз больше, чем семена арабидопсиса по размеру, и имеют больше барьеров проницаемости. Оболочка семян Arabidopsis состоит из четырех-пяти слоев живых клеток, полученных из внешнего покрова и внутреннего покрова24. Однако, по сравнению с Арабидопсисом, в оболочке семян томата6 имеется 22-27 паренхиматозных клеточных слоев (в стадии шаровидного эмбриона). Самый внутренний слой оболочки семян томата состоит из суберина и известен как полупроницаемый слой, который, как было показано, является барьером для движения водорастворимых соединений38. Кроме того, богатая полисахаридами семенная слизь показала высокую вязкость и значительно низкую проницаемость, что затрудняло проникновение очищающего раствора. Богатая пигментами оболочка семян томата также снижает качество изображенияна 35,36,37. Исторически удаление пигментов решается применением окислителей, сопровождающихся нагреванием или длительнойобработкой 37,39,40,41. Однако практически не сообщалось о каком-либо применении окислителей в методе очистки, основанном на хлоралгидрате.
В этом исследовании семена обрабатывали перед процессом очистки дезинфицирующим раствором, содержащим гипохлорит натрия, дополненным поверхностно-активным веществом Tween 20. Удивительно, но после обработки дезинфицирующим раствором (от 3 до 50 мин) слизь семян томатов можно было легко удалить, значительно улучшив проницаемость семян. Процесс отбеливания семенной оболочки можно наблюдать в режиме реального времени, и продолжительность дезинфекции семян корректируется соответствующим образом. Процесс отбеливания также поддерживает относительно стерильную среду, тем самым позволяя последующее хранение обработанных семян в течение 8 месяцев без загрязнения.
Оптимизированный протокол, разработанный в исследовании, достиг общей прозрачности семян томатов от 3 DAF до 23 DAF. Преимущества этого протокола в основном отражаются в следующих аспектах: Во-первых, устранение фиксации FAA и последующее обезвоживание градиента этанола сократило время обработки по крайней мере на 7 ч. Применение обработки гипохлорита натрия в сочетании с очищающим раствором значительно улучшило проницаемость семян и визуализацию самого внутреннего слоя семенной оболочки. Наконец, для средних эмбрионов высококачественные изображения эмбрионов могут быть получены через 10 ч, в то время как по традиционным протоколам это занимает не менее 3 дней.
Несмотря на преимущества этого протокола, он имеет два важных ограничения. Во-первых, при 5 DAF раннее проэмбрио на двух-шестнадцатиклеточной стадии не наблюдалось, что, вероятно, было связано с плотными и более крупными клетками эндосперма клеточного типа, препятствующими визуализации эмбрионов. Во-вторых, хотя морфология эмбриона томата почти завершена на уровне около 23 DAF, различные изображения для семян после 24 DAF не могут быть получены с помощью этого оптимизированного метода. Не исключено, что по мере приближения эмбриона к своим полным размерам кутикула на поверхности эндосперма значительно утолщается, остатки умирающих клеток паренхимы покрова образуют плотные слои, а наружные клетки эпидермиса покрова резко увеличиваются при огнении6. Они предполагают резкое снижение проникающей способности семян, что делает невозможным визуализацию внутренней ткани существующими методами.
В заключение, этот оптимизированный протокол обеспечивает эффективное средство для поиска аномального периода эмбрионального развития, обеспечивая основу для наблюдения более тонких клеточных структур с использованием методов нарезки. Кроме того, в некоторой степени этот метод, вероятно, обеспечит эталонную схему для других коммерчески важных культур в пасленовых, таких как картофель, баклажаны, перец и табак.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы благодарны доктору Цзе Ле и доктору Сюфэнь Сун за их полезные предложения по дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии и традиционному методу очистки соответственно. Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (31870299) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи Китайской академии наук. Рисунок 2 был создан с помощью BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette | GILSON | FA10006M | |
| 1,000 µL pipette tips | Corning | T-1000-B | |
| 2 ml centrifuge tube | Axygen | MCT-200-C | |
| 37% formaldehyde | DAMAO | 685-2013 | |
| 5,000 µL pipette | Eppendorf | 3120000275 | |
| 5,000 µL pipette tips | biosharp | BS-5000-TL | |
| 50 ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Absolute Ethanol | BOYUAN | 678-2002 | |
| Bottle glass | Fisher | FB800-100 | |
| Chloral Hydrate | Meryer | M13315-100G | |
| Coverslip | Leica | 384200 | |
| DIC microscope | Zeiss | Axio Imager A1 | 10x, 20x and 40x magnification |
| Disinfectant | QIKELONGAN | 17-9185 | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Flower nutrient soil | FANGJIE | ||
| Forceps | HAIOU | 4-94 | |
| Glacial Acetic Acid | BOYUAN | 676-2007 | |
| Glycerol | Solarbio | G8190 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RET basic | |
| Micro-Tom | Tomato Genetics Resource Center | LA3911 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER | QB-206 | |
| Seeding substrate | PINDSTRUP | LV713/018-LV252 | Screening:0-10 mm |
| Single concave slide | HUABODEYI | HBDY1895 | |
| Slide | Leica | 3800381 | |
| Stereomicroscope | Leica | S8 APO | 1x to 4x magnification |
| Tin foil | ZAOWUFANG | 613 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vacuum pump | SHIDING | SHB-III | |
| Vortex meter | Silogex | MX-S |
References
- FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
- Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
- Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
- Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
- Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
- Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
- Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
- Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
- Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
- Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
- Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
- Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
- Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
- Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
- Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
- Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
- Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
- Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
- Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
- Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
- Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
- Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
- Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
- Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
- Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
- de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
- Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
- Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
- Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
- Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
- Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
- Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
- Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
- Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
- Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
- Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).
