Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Ett effektivt clearingprotokoll för studier av fröutveckling i tomat (Solanum lycopersicum L.)

Published: September 7, 2022 doi: 10.3791/64445

Summary

Tomatfröet är en viktig modell för att studera genetik och utvecklingsbiologi under växtreproduktion. Detta protokoll är användbart för att rensa tomatfrön i olika utvecklingsstadier för att observera den finare embryonala strukturen.

Abstract

Tomat (Solanum lycopersicum L.) är en av de största kontantgrödorna i världen. Tomatfröet är en viktig modell för att studera genetik och utvecklingsbiologi under växtreproduktion. Visualisering av finare embryonal struktur i ett tomatfrö hindras ofta av fröskiktsmucilage, flercellskiktat integument och en tjockväggig endosperm, som måste lösas genom mödosam inbäddningssektionering. Ett enklare alternativ är att använda vävnadsrensningstekniker som gör fröet nästan transparent med kemiska medel. Även om konventionella röjningsprocedurer möjliggör djup insikt i mindre frön med en tunnare fröbeläggning, fortsätter det att vara tekniskt utmanande att rensa tomatfrön, särskilt i de sena utvecklingsstadierna.

Här presenteras ett snabbt och arbetsbesparande röjningsprotokoll för att observera tomatfröutveckling från 3 till 23 dagar efter blomningen när embryonal morfologi är nästan klar. Denna metod kombinerar klorhydratbaserad clearinglösning som ofta används i Arabidopsis med andra modifieringar, inklusive utelämnande av formalin-aceto-alkohol (FAA) fixering, tillsats av natriumhypokloritbehandling av frön, avlägsnande av den mjukade fröbeläggningsmucilage och tvätt- och vakuumbehandling. Denna metod kan tillämpas för effektiv rensning av tomatfrön i olika utvecklingsstadier och är användbar vid fullständig övervakning av utvecklingsprocessen för mutanta frön med god rumslig upplösning. Detta röjningsprotokoll kan också tillämpas på djupavbildning av andra kommersiellt viktiga arter i Solanaceae.

Introduction

Tomat (S. lycopersicum L.) är en av de viktigaste grönsaksgrödorna runt om i världen, med en produktion på 186,8 miljoner ton köttiga frukter från 5,1 miljoner hektar 20201. Den tillhör den stora familjen Solanaceae med cirka 2 716 arter2, inklusive många kommersiellt viktiga grödor som aubergine, paprika, potatis och tobak. Den odlade tomaten är en diploid art (2n = 2x = 24) med en genomstorlek på cirka 900 Mb3. Under lång tid har stora ansträngningar gjorts för tomattämjning och avel genom att välja önskvärda egenskaper från vilda Solanum spp. Det finns över 5 000 tomatanslutningar listade i Tomato Genetics Resource Center och mer än 80 000 bakterieplasma av tomater lagras över hela världen4. Tomatplantan är flerårig i växthuset och förökas av frön. Ett moget tomatfrö består av tre huvudfack: ett fullvuxet embryo, kvarvarande endosperm av cellulär typ och en hårdfröbeläggning 5,6 (figur 1A). Efter dubbel befruktning föregår utvecklingen av endosperm av cellulär typ utvecklingen av zygoter. Vid ~ 5-6 dagar efter blomning (DAF) observeras tvåcellig proembryo först när endospermen består av sex till åtta kärnor7. I Solanum pimpinellifolium närmar sig embryot sin slutliga storlek efter 20 DAF, och frön är livskraftiga för spiring efter 32 DAF8. När embryot utvecklas absorberas endospermen gradvis och endast en liten mängd endosperm kvarstår i fröet. Den återstående endospermen består av mikropylar endosperm som omger radikelspetsen och lateral endosperm i resten av fröet 9,10. Den yttre fröbeläggningen är utvecklad från förtjockad och lignifierad yttre epidermis av integumentet, och med de döda lagren av integumentrester bildar de ett hårt skal för att skydda embryot och endospermen5.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av ett moget frö i Solanum lycopersicum och Arabidopsis thaliana. (A) Longitudinell anatomi hos ett moget tomatfrö. B) Longitudinell anatomi hos ett moget Arabidopsisfrö. Ett moget tomatfrö är ungefär 70 gånger större än ett Arabidopsis-frö. Skalstänger = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Produktion av högkvalitativa tomatfrön beror på samordningen mellan embryot, endospermen och moderfrökomponenterna11. Att dissekera viktiga gener och nätverk i fröutveckling kräver en djup och fullständig fenotypisk registrering av mutanta frön. Konventionella inbäddnings-sektionstekniker, såsom den halvtunna sektionen och paraffinsektionen, används i stor utsträckning på tomatfrön för att observera de lokala och finare strukturerna hos embryot12,13,14,15. Att analysera fröutvecklingen från tunna sektioner är dock vanligtvis mödosamt och saknar z-axelns rumsliga upplösning. I jämförelse är vävnadsrensning en snabb och effektiv metod för att fastställa utvecklingsstadiet för embryodefekter som mest sannolikt kommer att inträffa16. Clearingmetoden minskar ogenomskinligheten hos inre vävnad genom att homogenisera brytningsindexet med ett eller flera biokemiska medel16. Rensning av hela vävnader möjliggör observation av en växtvävnadsstruktur utan att förstöra dess integritet, och kombinationen av röjningsteknik och tredimensionell avbildning har blivit en idealisk lösning för att få information om morfologin och utvecklingstillståndet hos ett växtorgan17,18. Under åren har fröröjningstekniker använts i olika växtarter, inklusive Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare och Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Bland dessa har den helmonterade ägglossningstekniken varit ett effektivt tillvägagångssätt för att studera fröutveckling av Arabidopsis, på grund av dess lilla storlek, 4-5 lager av fröskiktcellen och endospermen av kärntyp24,25. Med den kontinuerliga uppdateringen av olika clearingblandningar, såsom framväxten av Hoyers lösning26, avbildades inre strukturer i kornäggstocken med hög grad av klarhet även om dess endosperm utgör huvuddelen av fröna. Embryogenes av sockerbetor kan observeras genom rensning i kombination med vakuumbehandling och mjukning med saltsyra19. Till skillnad från de arter som nämns ovan har dock embryologiska observationer genom rensningsprotokoll i tomatfrön inte rapporterats. Detta förhindrar detaljerad undersökning av embryonal och fröutveckling av tomater.

Klorhydrat används ofta som en clearinglösning som gör att de nedsänkta vävnaderna och cellerna kan visas på olika optiska plan och bevarar cellerna eller vävnadskomponenterna27,28,29. Klorhydratbaserat clearingprotokoll har framgångsrikt använts för helmontering av frön för att observera embryot och endospermen av Arabidopsis21,28. Denna clearinglösning är emellertid inte effektiv för att rensa tomatfrön, som är mer ogenomträngliga än Arabidopsisfrön. De fysiska barriärerna inkluderar: (1) tomatintegumentet har nästan 20 cellskikt vid 3 till 15 DAF 30,31, (2) tomatendospermen är cellulär, inte kärntyp32, och (3) tomatfrön är cirka 70 gånger större i storlek33,34 och (4) producerar stora mängder fröskiktsmucilage, vilket blockerar penetrationen av clearingreagens och påverkar visualiseringen av embryoceller.

Därför presenterar denna rapport en optimerad klorhydratbaserad röjningsmetod för helmonterad rensning av tomatfrön i olika stadier, vilket möjliggör djup avbildning av embryoutvecklingsprocessen (figur 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av lösningar

  1. Förbered FAA-fixeringsmedel genom att tillsätta 2,5 ml 37% formaldehyd, 2,5 ml isättika och 45 ml 70% etanol i ett 50 ml centrifugrör. Vortex och förvara den vid 4 °C. Nyberedd FAA-fixativ strax före användning.
    VARNING: 37% formaldehyd är frätande och potentiellt cancerframkallande vid exponering eller inandning. Fixeringsmedlet måste utföras i en dragskåp medan du bär lämplig personlig skyddsutrustning.
  2. Förbered rensningslösningen genom att tillsätta 5 ml 100% glycerol, 40 g klorhydrat och 10 ml destillerat vatten i en 100 ml glasflaska insvept med tennfolie. Lös upp med en magnetomrörare över natten vid rumstemperatur. Den beredda lösningen kan förvaras vid 4 °C i upp till 6 månader.
    VARNING: Klorhydrat är cancerframkallande och har en skarp lukt. Utför experimentet i en dragskåp och använd lämplig personlig skyddsutrustning. Klorhydrat är lätt att deliquesce i luften och bör inte förvaras i stora mängder. Röjningslösningen kan brytas ned när den utsätts för ljus och bör hållas borta från ljus.
  3. Bered desinfektionslösningen genom att tillsätta 10 ml 6% natriumhypoklorit, 40 ml destillerat vatten och 50 μl Tween-20 i ett 50 ml centrifugrör. Vortex och förvara den vid rumstemperatur. Nyberedd desinfektionslösningen strax före användning.
    OBS: Det effektiva klorinnehållet i natriumhypoklorit som har placerats under lång tid kan minska, och innehållet av 6% natriumhypoklorit kan ökas enligt den faktiska situationen.

2. Frö insamling

  1. Så tomatfrön (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, se materialtabell) i 8 cm × 8 cm × 8 cm fyrkantiga bassänger fulla med en 1:1-blandning av blomnäringsjord och substrat (v/v) (se materialtabell) och växa i ett tillväxtrum med 16/8 h ljus/mörka perioder vid 24 ± 2 °C (dag) och 18 ± 2 °C (natt), 60%-70% relativ luftfuktighet och en ljusintensitet på 4 000 Lux. Cirka 6 veckor senare gick växterna in i blomningsstadiet.
  2. Märk blomningsdatumet för oberoende blommor vid anthesis (kronbladets öppningsvinkel är 90 °) och registrera dagen efter blomningen (DAF).
  3. Skörda frukterna från 3 till 23 DAF-tomatplantor och lägg dem omedelbart på is. Dela frukt (frön eller embryon) från 3 till 23 DAF i tidiga (3-10 DAF), mellersta (11-16 DAF) och sena (17-23 DAF) frukter (frön eller embryon).
    OBS: Samla inte för många frukter åt gången och se till att fröna i varje frukt avlägsnas inom 1 h för vidare behandling.
  4. För tidiga frukter, bryt frukten och lägg den på en bild och samla färska frön försiktigt med precisionstång under stereomikroskopet (se materialtabell) vid 1x till 4x förstoring. För mellersta och sena frukter, bryt frukten och samla direkt färska frön med precisionstång.

3. Klorhydratbaserad rensning av frön

OBS: Konventionella35 och optimerade protokoll jämfördes i denna studie för deras fröröjningseffektivitet.

  1. Clearing med ett konventionellt protokoll
    1. Placera omedelbart färska frön (erhållna i steg 2.4) i ett 2 ml centrifugrör som innehåller 1,5 ml FAA-fixeringsmedel och inkubera på en orbitalskakapparat (5 rpm, se materialtabell) i 4 timmar vid rumstemperatur.
    2. Dehydrera dessa frön i en etanolserie på 70%, 95% och 100% etanol (v / v) i 1 h vardera på en orbital shaker (5 rpm).
    3. Placera fröna i 3-5 droppar clearinglösning (~ 100 μL) på bilden och täck försiktigt provet med en täckglas. Byt ut bilden mot en enda konkav bild (se Materialförteckning) för mellersta och sena frön.
    4. Förvara dessa bilder eller enstaka konkava objektglas vid rumstemperatur i 30 min (3 DAF), 2 timmar (6 DAF), 1 dag (9 DAF), 3 dagar (12 DAF) eller 7 dagar (14 till 22 DAF) beroende på frömaterialets utvecklingsstadier (ju yngre material, desto snabbare röjningshastighet).
    5. Observera proverna med ett DIC-mikroskop (differential interference contrast) utrustat med en digitalkamera (se materialförteckning) med 10x, 20x och 40x förstoring. Justera och optimera det överförda ljusets ljusstyrka, DIC-skjutreglage och kondensoröppning i realtid för varje prov och ta bilder.
  2. Rensning med det optimerade protokollet
    1. Placera färska frön (erhållna i steg 2.4) direkt i ett 2 ml centrifugrör som innehåller 1,5 ml desinfektionslösning (steg 1.3).
      OBS: Antalet frön som samlas in i 2 ml centrifugröret varierar beroende på frönas utvecklingsstadium. Närmare uppgifter finns i tabell 1.
    2. Inkubera proverna på en orbital shaker (30 rpm) vid rumstemperatur i 3 till 50 minuter tills den innersta fröbeläggningens kontur är tydligt synlig. Kassera desinfektionslösningen.
      OBS: Den inkubationstid som krävs beror på fröutvecklingsstadiet (ju senare frön, desto längre blir inkubationstiden). Närmare uppgifter finns i tabell 1.
    3. För mellersta och sena frön, överför fröna till en bild och ta bort frömucilage med pincett och en dissekeringsnål under ett stereomikroskop vid 1x till 4x förstoring. Överför fröna tillbaka till det ursprungliga centrifugröret med pincett.
      OBS: Detta steg är inte nödvändigt för tidiga frön.
    4. Tvätta fröna 5x med 1,5 ml avjoniserat vatten, 10 s varje gång. Kassera det avjoniserade vattnet.
    5. Tillsätt en clearinglösning på 2 × frönas volym, följt av vakuumbehandling i 0 till 50 min (tabell 1) med en vakuumpump (se materialförteckning). Intermittent vakuumbehandling utförs med varje vakuumbehandling i 10 min med 10 minuters mellanrum.
    6. Byt ut med en ny clearinglösning på 2 × fröets volym. Håll centrifugröret på 2 ml som innehåller fröna i rumstemperatur och skyddat från ljus i 30 minuter till 7 dagar för att underlätta röjning (tabell 1). Under inkubationen, för sena embryon, byt ut clearinglösningen dagligen med färsk lösning och utsätt fröna för vakuumbehandling i 10 min.
    7. Förbered de rensade fröna på bilder eller enkelkonkava bilder och observera med DIC-mikroskopet utrustat med en digitalkamera med 10x, 20x och 40x förstoring. Justera och optimera det överförda ljusets ljusstyrka, DIC-skjutreglage och kondensoröppning i realtid för varje prov och ta bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

När tomatfrön rensades med en konventionell metod som i Arabidopsis blockerade täta endospermceller visualiseringen av tidiga tomatembryon vid 3 DAF och 6 DAF (figur 3A,B). När den totala volymen av embryot ökade kunde ett klotformigt embryo knappt urskiljas vid 9 DAF (figur 3C). Men när fröstorleken fortsatte att öka minskade dess permeabilitet, vilket resulterade i ett luddigt hjärtembryo vid 12 DAF (figur 3D). Från och med 13 DAF blev frömucilage och fröbeläggning gradvis tätare, vilket förhindrade penetrering av clearingmedel. Konturen av embryot inuti 14-19 DAF-frön var extremt suddig även när behandlingstiden förlängdes till 7 dagar (figur 3E-G). I 22 DAF-frön var fröets inre struktur helt osynlig (figur 3H).

Därför optimerades det konventionella klorhydratbaserade röjningsförfarandet för att möjliggöra effektiv rensning av tomatfrön. Information om alla steg finns i tabell 1. För det första utelämnades FAA-fixerings- och etanoluttorkningsstegen, som ofta krävs i konventionella clearingprocedurer, från protokollet. Medan FAA-fixering vanligtvis används för att bevara den morfologiska strukturen och cellulära komponenter från förfall, fann man (i denna studie) att den inre strukturen hos tomatfrön inte lätt deformerades och var välbevarad trots frånvaron av FAA-fixering och etanoluttorkning.

För det andra är fröskiktsmucilage som produceras av fröskiktets epidermala celler mycket framträdande från 13 DAF och framåt (figur 4). Den polysackaridrika frömucilage visade en hög viskositet och en signifikant låg permeabilitet35,36. Inledande försök att ta bort den utan att förstöra fröskiktet med fina pincett och nålar under ett dissekerande mikroskop misslyckades tyvärr. Detta beror på att fröskiktet är sprött och anslutet tätt till mucilage. Dessutom leder förekomsten av pigment i fröskiktet ytterligare till nedgången i kvaliteten på ljusfältbilden37. För att övervinna detta problem behandlades fröna med en desinfektionslösning av 1,2% natriumhypoklorit och 0,1% Tween 20. Blekningseffekten av natriumhypoklorit möjliggör en tydlig identifiering av det inre fröskiktet och skapar en relativt steril miljö som gjorde att prover kunde lagras under lång tid. Användningen av tvättmedel Tween 20 kan sänka ytspänningen och öka fröpermeabiliteten. Ännu viktigare, efter detta steg kan det mesta av den vidhäftande mucileringen lossas från fröet utan att skada fröskiktet (figur 4). Hädanefter poolades de behandlade fröna i ett 2 ml centrifugrör och inkuberades vid rumstemperatur i en orbital shaker (30 rpm).

För det tredje användes vakuumbehandling för att påskynda penetrationen av clearinglösningen till embryona i mitten och sena stadier. Slutligen, eftersom tomatfrön är särskilt större efter 12 DAF, ersattes konventionella bilder med enstaka konkava bilder vid DIC-avbildning.

Efter behandling enligt det optimerade clearingprotokollet visade tomatfrön tillfredsställande transparens i alla testade utvecklingsstadier (figur 5A-L). I motsats till fuzzy cellkonturer erhållna med konventionella protokoll var distinkta cellskikt av fröskiktet vid 3 DAF synliga (figur 5A). Endospermceller var mer urskiljbara vid 5 DAF (figur 5B). Det stickformade embryot uppträdde vid 7 DAF, och sedan nådde embryot det globulära stadiet vid 9 DAF och hjärtstadiet vid 11 DAF (figur 5C-E). Under dessa utvecklingsstadier var konturerna av cellerna inuti embryot tydligast synliga. Jämfört med den konventionella metoden producerade det optimerade protokollet betydligt bättre kvalitetsbilder från hjärtstadiet till det mogna embryostadiet. När embryonal utveckling nådde det tidiga torpedstadiet vid 13 DAF, det mellersta torpedstadiet vid 14 DAF, det sena torpedstadiet vid 15 DAF, det tidiga cotyledonstadiet vid 16 DAF, det böjda cotyledonstadiet vid 19 DAF och 21 DAF och det mogna embryot vid 23 DAF, fångades graden av krullningen av cotyledoner och skjuta apikal meristem mycket lätt (Figur 5F-L ). Men utöver 23 DAF var det inte möjligt att visualisera detaljerna i embryot, även när clearingbehandlingen förlängdes till över 1 vecka.

Figure 2
Figur 2: Flödesschema över konventionellt protokoll och optimerat protokoll. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kontrastbilder av differentiell interferens av S. lycopersicum ägglossor behandlade med den konventionella clearingmetoden. (A) En äggstock med luddig embryosäck vid 3 DAF. (B) Embryosäck med synliga endospermceller (pilspetsar) vid 6 DAF. (C) Ett knappt urskiljbart klotformigt embryo vid 9 DAF. Ett luddigt embryo vid (D) 12, (E) 14, (F) 16 och (G) 19 DAF. (H) Fröets inre struktur är helt osynlig vid 22 DAF. Skalstänger = 25 μm; em = embryo; es = embryosäck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Desinfektion av S. lycopersicum frön i olika utvecklingsstadier. De översta bilderna (A1-F1) är de randiga fröna från de utvecklande frukterna vid (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 och (F1) 21 DAF, medan de nedre bilderna (A2-F2) är frön behandlade med desinfektionslösning. I A2-F2 kan den inre fröbeläggningskonturen identifieras tydligt. Skalstänger = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Kontrastbilder av S. lycopersicum som rensats med hjälp av det optimerade protokollet. (A-L) DIC-mikroskopibilder av tomatäggstocken med synlig embryosäck vid (A) 3 DAF och (B) 5 DAF, (C) ett stickformat embryo vid 7 DAF, (D) ett klotformigt embryo vid 9 DAF, (E) ett hjärtembryo vid 11DAF, (F) ett tidigt torpedembryo vid 13 DAF, (G) ett mellersta torpedembryo 14 DAF, (H) ett sent torpedembryo vid 15 DAF, (I) ett tidigt cotyledonembryo vid 16 DAF, ett bent-cotyledon-embryo vid (J) 19 DAF och (K) 21 DAF, och (L) ett moget embryo vid 23 DAF. Skalstänger = 50 μm; em = embryo; sc = fröbeläggning; en = endosperm; es = embryosäck; hy = hypokotyl; co = cotyledon; r = radikel; sa = skjut apikal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Vävnadsbehandling Embryo utveckling
3–7 DAF 8–10 DAF 11–13 DAF 14–16 DAF 17-20 DAF 21–23 DAF
1 Antal färska frön 50 40 30 20 15 10
2 Desinfektion 1,5 ml, 3 min 1,5 ml, 10 min 1,5 ml, 20 min 1,5 ml, 30 min 1,5 ml, 40 min 1,5 ml, 50 min
3 Skalar av slemhinnan Nej Nej Ja Ja Ja Ja
4 Tvätt 5x 10 s
5 Glänta 2x volymen frön
6 Dammsugning Nej 1 x 10 minuter 2 x 10 minuter 3 x 10 minuter 4 x 10 minuter 5 x 10 minuter
7 Inkubation 30 minuter 2 timmar 3 timmar 8 timmar 1–4 dagar 3–7 dagar

Tabell 1: Optimering av protokollet för att förbättra clearingeffekten i tomatfrön. 1 = Batchoperationer, rensningsobservation av ett stort antal frön samtidigt; frön placerades i ett 2 ml centrifugrör. 2 = Desinfektion med 6% NaClO:dH2O:Tween-20, i proportionerna 200:800:1 (v/v); Alla steg utfördes på en orbital shaker med 30 rpm skakning. 3 = Alla steg utfördes under ett dissekeringsmikroskop med pincett och dissekeringsnålar om inte annat anges. 4 = Frön tvättades med destillerat vatten efter varje steg. 5 = Rensning med 100% glycerol:klorhydrat:dH2O, i proportionerna 1:8:2 (v/w/v). 6 = Varje vakuumbehandling varade i 10 min och fördelades med 10 minuters mellanrum. 7 = Byt ut med färsk röjningslösning och förvara frön borta från ljus vid rumstemperatur; För frön från 17 DAF till 23 DAF, byt ut clearinglösningen mot färsk lösning och vakuum i 10 minuter varje dag under inkubationsperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jämfört med mekanisk sektionering är röjningstekniken mer fördelaktig för tredimensionell avbildning eftersom den behåller integriteten hos växtvävnader eller organ16. Konventionella clearingprotokoll är ofta begränsade till små prover på grund av enklare penetration av kemiska lösningar. Tomatfrö är ett problematiskt prov för vävnadsrensning eftersom det är cirka 70 gånger större än ett Arabidopsis-frö i storlek och har fler permeabilitetsbarriärer. Arabidopsisfröskiktet består av fyra till fem levande cellskikt härledda från det yttre integumentet och det inre integumentet24. Jämfört med Arabidopsis finns det emellertid 22-27 parenkymala cellskikt (i scenen av det globulära embryot) i tomatfröskiktet6. Det innersta skiktet av tomatfröskiktet består av suberin och är känt som det semipermeabla skiktet, vilket har visat sig vara ett hinder för rörelsen av vattenlösliga föreningar38. Dessutom visade den polysackaridrika frömucilage en hög viskositet och en signifikant låg permeabilitet, vilket hindrade penetrationen av clearinglösningen. Det pigmentrika fröskiktet av tomat minskar också bildkvaliteten35,36,37. Historiskt sett löses avlägsnandet av pigment genom applicering av oxidanter åtföljd av uppvärmning eller långvarig behandling 37,39,40,41. Emellertid, knappast någon användning av oxidanter i clearingmetoden baserad på klorhydrat har rapporterats.

I denna studie behandlades fröna före rensningsprocessen med en desinfektionslösning innehållande natriumhypoklorit, kompletterad med ett ytaktivt medel Tween 20. Överraskande, efter behandling med desinfektionslösningen (3 till 50 min), kan mucilage av tomatfrön lätt avlägsnas, vilket kraftigt förbättrar fröets permeabilitet. Blekningsprocessen för fröskiktet kan observeras i realtid och varaktigheten av frödesinfektion justeras i enlighet därmed. Blekningsprocessen upprätthåller också en relativt steril miljö, vilket möjliggör efterföljande lagring av de behandlade fröna i 8 månader utan förorening.

Det optimerade protokollet som utvecklades i studien uppnådde övergripande transparens för tomatfrön från 3 DAF till 23 DAF. Fördelarna med detta protokoll återspeglas huvudsakligen i följande aspekter: För det första förkortade elimineringen av FAA-fixering och efterföljande etanolgradientuttorkning behandlingstiden med minst 7 timmar. Användningen av natriumhypokloritbehandling i kombination med clearinglösning förbättrade signifikant permeabiliteten hos fröna och visualiseringen av det innersta skiktet av fröskiktet. Slutligen, för mellanembryon, kan högkvalitativa bilder av embryon förvärvas efter 10 h, medan det tar minst 3 dagar med traditionella protokoll.

Trots fördelarna med detta protokoll har det två viktiga begränsningar. Först, vid 5 DAF, observerades inte den tidiga proembryon vid två- till sextoncelligt stadium, vilket förmodligen berodde på de täta och större endospermcellerna av cellulär typ som hindrade visualiseringen av embryon. För det andra, även om tomatembryots morfologi är nästan fullständig vid cirka 23 DAF, kunde distinkta bilder för frön efter 24 DAF inte erhållas med denna optimerade metod. Det är möjligt att när embryot närmar sig sin fulla storlek, tjocknar nagelbandet på endospermens yta avsevärt, resterna av döende integumentparenkymceller bildar täta skikt och de yttre epidermiscellerna i integumentet ökar dramatiskt i lignifiering6. Dessa tyder på en drastisk minskning av fröpenetrationskapaciteten, vilket gör det omöjligt att visualisera den inre vävnaden med befintliga metoder.

Sammanfattningsvis ger detta optimerade protokoll ett effektivt sätt att hitta den onormala perioden av embryonal utveckling, vilket ger grunden för observation av finare cellstrukturer med hjälp av skivningstekniker. Dessutom kommer denna metod i viss utsträckning sannolikt att ge ett referensschema för andra kommersiellt viktiga grödor i Solanaceae, såsom potatis, aubergine, paprika och tobak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Dr. Jie Le och Dr. Xiufen Song för deras användbara förslag om differentiell interferenskontrastmikroskopi respektive konventionell clearingmetod. Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31870299) och Youth Innovation Promotion Association vid Chinese Academy of Sciences. Figur 2 skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette GILSON FA10006M
1,000 µL pipette tips Corning T-1000-B
2 ml centrifuge tube Axygen MCT-200-C
37% formaldehyde DAMAO 685-2013
5,000 µL pipette Eppendorf 3120000275
5,000 µL pipette tips biosharp BS-5000-TL
50 ml centrifuge tube Corning 430829
Absolute Ethanol BOYUAN 678-2002
Bottle glass Fisher FB800-100
Chloral Hydrate Meryer M13315-100G
Coverslip Leica 384200
DIC microscope Zeiss Axio Imager A1 10x, 20x and 40x magnification
Disinfectant QIKELONGAN 17-9185
Dissecting needle Bioroyee 17-9140
Flower nutrient soil FANGJIE
Forceps HAIOU 4-94
Glacial Acetic Acid BOYUAN 676-2007
Glycerol Solarbio G8190
Magnetic stirrer IKA RET basic
Micro-Tom Tomato Genetics Resource Center LA3911
Orbital shaker QILINBEIER QB-206
Seeding substrate PINDSTRUP LV713/018-LV252 Screening:0-10 mm
Single concave slide HUABODEYI HBDY1895
Slide Leica 3800381
Stereomicroscope Leica S8 APO 1x to 4x magnification
Tin foil ZAOWUFANG 613
Tween 20 Sigma P1379
Vacuum pump SHIDING SHB-III
Vortex meter Silogex MX-S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G. The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature. 485 (7400), 635-641 (2012).
  4. Ebert, A. W., Chou, Y. Y. The tomato collection maintained by AVRDC - The World Vegetable Center: composition, germplasm dissemination and use in breeding. Acta Horticulturae. 1101, 169-176 (2015).
  5. Hilhorst, H., Groot, S., Bino, R. J. The tomato seed as a model system to study seed development and germination. Acta Botanica Neerlandica. 47, 169-183 (1998).
  6. Chaban, I. A., Gulevich, A. A., Kononenko, N. V., Khaliluev, M. R., Baranova, E. N. Morphological and structural details of tomato seed coat formation: A different functional role of the inner and outer epidermises in unitegmic ovule. Plants-Basel. 11 (9), 1101 (2022).
  7. Iwahori, S. High temperature injuries in tomato. V. Fertilization and development of embryo with special reference to the abnormalities caused by high temperature. Journal of The Japanese Society for Horticultural Science. 35 (4), 379-386 (1966).
  8. Xiao, H., et al. Integration of tomato reproductive developmental landmarks and expression profiles, and the effect of SUN. on fruit shape. BMC Plant Biology. 9 (1), 49 (2009).
  9. Karssen, C. M., Haigh, A. M., Toorn, P., Weges, R. Physiological mechanisms involved in seed priming. Recent advances in the development and germination of seeds. NATO ASI Series. Taylorson, R. B. 187, Springer. Boston, MA. (1989).
  10. Nonogaki, H. Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses. Frontiers in Plant Science. 5, 233 (2014).
  11. Doll, N. M., Ingram, G. C. Embryo-endosperm interactions. Annual Review of Plant Biology. 73, 293-321 (2022).
  12. Serrani, J. C., Fos, M., Atarés, A., García-Martínez, J. L. Effect of gibberellin and auxin on parthenocarpic fruit growth induction in the cv micro-tom of tomato. Journal of Plant Growth Regulation. 26 (3), 211-221 (2007).
  13. Yang, C., et al. A regulatory gene induces trichome formation and embryo lethality in tomato. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (29), 11836-11841 (2011).
  14. Goetz, S., et al. Role of cis-12-oxo-phytodienoic acid in tomato embryo development. Plant Physiology. 158 (4), 1715-1727 (2012).
  15. Ko, H. Y., Ho, L. H., Neuhaus, H. E., Guo, W. J. Transporter SlSWEET15 unloads sucrose from phloem and seed coat for fruit and seed development in tomato. Plant Physiology. 187 (4), 2230-2245 (2021).
  16. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  17. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  18. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), (2021).
  19. Kwiatkowska, M., Kadłuczka, D., Wędzony, M., Dedicova, B., Grzebelus, E. Refinement of a clearing protocol to study crassinucellate ovules of the sugar beet (Beta vulgaris L., Amaranthaceae). Plant Methods. 15, 71 (2019).
  20. Ponitka, A., Ślusarkiewicz-Jarzina, A. Cleared-ovule technique used for rapid access to early embryo development in Secale cereale × Zea mays crosses. Acta Biologica Cracoviensia. Series Botanica. 46, 133-137 (2014).
  21. Ceccato, L., et al. Maternal control of PIN1 is required for female gametophyte development in Arabidopsis. PLoS One. 8 (6), 66148 (2013).
  22. Wilkinson, L. G., Tucker, M. R. An optimised clearing protocol for the quantitative assessment of sub-epidermal ovule tissues within whole cereal pistils. Plant Methods. 13, 67 (2017).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of Arabidopsis flower organs and Siliques. Journal of Visualized Experiments. (134), e56441 (2018).
  24. Creff, A., Brocard, L., Ingram, G. A mechanically sensitive cell layer regulates the physical properties of the Arabidopsis seed coat. Nature Communications. 6, 6382 (2015).
  25. Yang, T., et al. The B3 domain-containing transcription factor ZmABI19 coordinates expression of key factors required for maize seed development and grain filling. Plant Cell. 33 (1), 104-128 (2021).
  26. Anderson, L. E. Hoyer's solution as a rapid permanent mounting medium for bryophytes. Bryologist. 57 (3), 242-244 (1954).
  27. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. American Journal of Botany. 58 (8), 785-790 (1971).
  28. Yadegari, R., et al. Cell differentiation and morphogenesis are uncoupled in Arabidopsis raspberry embryos. The Plant Cell. 6 (12), 1713-1729 (1995).
  29. Grini, P. E., Jurgens, G., Hulskamp, M. Embryo and endosperm development is disrupted in the female gametophytic capulet mutants of Arabidopsis. Genetics. 162 (4), 1911-1925 (2002).
  30. Kataoka, K., Uemachi, A., Yazawa, S. Fruit growth and pseudoembryo development affected by uniconazole, an inhibitor of gibberellin biosynthesis, in pat-2 and auxin-Induced parthenocarpic tomato fruits. Scientia Horticulturae. 98 (1), 9-16 (2003).
  31. de Jong, M., Wolters-Arts, M., Feron, R., Mariani, C., Vriezen, W. H. The Solanum lycopersicum auxin response factor 7 (SlARF7) regulates auxin signaling during tomato fruit set and development. Plant Journal. 57 (1), 160-170 (2009).
  32. Roth, M., Florez-Rueda, A. M., Paris, M., Stadler, T. Wild tomato endosperm transcriptomes reveal common roles of genomic imprinting in both nuclear and cellular endosperm. Plant Journal. 95 (6), 1084-1101 (2018).
  33. Orsi, C. H., Tanksley, S. D. Natural variation in an ABC transporter gene associated with seed size evolution in tomato species. PLoS Genetics. 5 (1), 1000347 (2009).
  34. Herridge, R. P., Day, R. C., Baldwin, S., Macknight, R. C. Rapid analysis of seed size in Arabidopsis for mutant and QTL discovery. Plant Methods. 7 (1), 3 (2011).
  35. Xu, T. T., Ren, S. C., Song, X. F., Liu, C. M. CLE19 expressed in the embryo regulates both cotyledon establishment and endosperm development in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 66 (17), 5217-5227 (2015).
  36. Ghadiri Alamdari, N., Salmasi, S., Almasi, H. Tomato seed mucilage as a new source of biodegradable film-forming material: effect of glycerol and cellulose nanofibers on the characteristics of resultant films. Food and Bioprocess Technology. 14 (12), 2380-2400 (2021).
  37. Gardner, R. O. An overview of botanical clearing technique. Stain Technology. 50 (2), 99-105 (1975).
  38. Beresniewicz, M. M., Taylor, A. G., Goffinet, M. C., Terhune, B. T. Characterization and location of a semipermeable layer in seed coats of leek and onion (Liliaceae), tomato and pepper (Solanaceae). Seed Science and Technology. 23 (1), 123-134 (1995).
  39. Stebbins, G. L. A bleaching and clearing method for plant tissues. Science. 87 (2245), 21-22 (1938).
  40. Debenham, E. M. A modified technique for the microscopic examination of the xylem of whole plants or plant organs. Annals of Botany. 3 (2), 369-373 (1939).
  41. Morley, T. Accelerated clearing of plant leaves by NaOH in association with oxygen. Stain Technology. 43 (6), 315-319 (1968).

Tags

Utvecklingsbiologi utgåva 187
Ett effektivt clearingprotokoll för studier av fröutveckling i tomat (<em>Solanum lycopersicum</em> L.)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. AnMore

Feng, Y., Wang, T., Liu, L. An Efficient Clearing Protocol for the Study of Seed Development in Tomato (Solanum lycopersicum L.). J. Vis. Exp. (187), e64445, doi:10.3791/64445 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter