Summary
تم تطوير طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لتقييم الأهمية الوظيفية للمتغيرات الخاطئة في Ube3a ، وهو جين يرتبط فقدانه واكتسابه لوظيفته بكل من متلازمة أنجلمان واضطراب طيف التوحد.
Abstract
أدى الاستخدام المتزايد للتسلسل في الطب إلى تحديد ملايين المتغيرات المشفرة في الجينوم البشري. تحدث العديد من هذه المتغيرات في الجينات المرتبطة باضطرابات النمو العصبي ، لكن الأهمية الوظيفية للغالبية العظمى من المتغيرات لا تزال غير معروفة. يصف البروتوكول الحالي دراسة المتغيرات ل Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase المرتبط بكل من التوحد ومتلازمة Angelman. يرتبط تكرار أو ثلاثة أضعاف Ube3a ارتباطا وثيقا بالتوحد ، في حين أن حذفه يسبب متلازمة أنجلمان. وبالتالي ، فإن فهم تكافؤ التغيرات في نشاط بروتين UBE3A مهم للنتائج السريرية. هنا ، يتم وصف طريقة سريعة قائمة على الخلايا تقرن متغيرات Ube3a مع مراسل مسار Wnt. هذا الفحص البسيط قابل للتطوير ويمكن استخدامه لتحديد التكافؤ وحجم تغيرات النشاط في أي متغير Ube3a . علاوة على ذلك ، فإن تسهيل هذه الطريقة يسمح بتوليد ثروة من معلومات وظيفة الهيكل ، والتي يمكن استخدامها لاكتساب رؤى عميقة في الآليات الأنزيمية ل UBE3A.
Introduction
جعلت التطورات التكنولوجية الحديثة تسلسل الإكسومات والجينوم روتينيا في البيئات السريرية 1,2. وقد أدى ذلك إلى اكتشاف عدد كبير من المتغيرات الجينية ، بما في ذلك الملايين من المتغيرات الخاطئة التي عادة ما تغير حمضا أمينيا واحدا في البروتين. لا يزال فهم الأهمية الوظيفية لهذه المتغيرات يمثل تحديا ، ولا يوجد سوى جزء صغير (~ 2٪) من المتغيرات الخاطئة المعروفة لها تفسير سريري 1,3.
ومن الأمثلة البارزة على هذه المشكلة Ube3a ، وهو جين يشفر E3 ubiquitin ligase الذي يستهدف بروتينات الركيزة للتحلل4. يوجد Ube3a داخل الكروموسوم 15q11-13 ويتم التعبير عنه حصريا من الأليلالموروث من الأم 5،6،7. تشير الملاحظات من علم الوراثة المرضية بقوة إلى أن النشاط غير الكافي أو المفرط لإنزيم UBE3A يسبب اضطرابات نمو عصبي متميزة. يؤدي حذف كروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة أنجلمان (AS) 8 ، وهو اضطراب يتميز بإعاقة ذهنية شديدة ، وإعاقات حركية ، ونوبات ، وسلوك سعيد مع ابتسامة متكررة ، وملامح وجه مشوهة8،9،10. في المقابل ، يؤدي الازدواجية أو المضاعفة الثلاثية لكروموسوم الأم 15q11-13 إلى متلازمة Dup15q ، وهي حالة غير متجانسة معترف بها كواحدة من أكثر أشكال التوحد انتشارا11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، هناك المئات من المتغيرات الخاطئة التي تم تحديدها في Ube3a ، والتي يعتبر معظمها متغيرات ذات أهمية غير مؤكدة (VUS) لأن أهميتها الوظيفية والسريرية غير معروفة. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بتطوير طرق يمكنها تقييم متغيرات Ube3a تجريبيا لتحديد ما إذا كانت تساهم في مرض النمو العصبي.
ينتمي إنزيم UBE3A إلى عائلة مجال HECT (المتماثلة مع E6-AP C-terminus) من أربطة E3 ubiquitin التي تمتلك جميعها مجال HECT المسمى ، والذي يحتوي على الآلات الكيميائية الحيوية اللازمة لقبول ubiquitin المنشط من إنزيمات E2 ونقله إلى بروتينات الركيزة14. تاريخيا ، اعتمد توصيف إنزيمات E3 على الأنظمة المعاد تشكيلها في المختبر والتي تتطلب مجموعة من البروتينات المنقاة4،15،16. هذه الأساليب بطيئة وكثيفة العمالة وغير قابلة لتقييم نشاط عدد كبير من المتغيرات. في العمل السابق ، تم تحديد UBE3A لتنشيط مسار Wnt في خلايا HEK293T عن طريق تعديل وظيفة البروتيازوم لإبطاء تدهور β-catenin17. تسمح هذه الرؤية باستخدام مراسلي مسار Wnt كطريقة فعالة وسريعة لتحديد كل من متغيرات الخسارة والكسب الوظيفي ل Ube3a18. يصف البروتوكول أدناه بالتفصيل طريقة لإنشاء متغيرات Ube3a بالإضافة إلى مراسل قائم على luciferase لتقييم التغييرات في نشاط متغيرات Ube3a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استنساخ الطفرات لتوليد متغيرات Ube3a
- استنساخ جميع متغيرات Ube3a في بلازميد pCIG2 (الشكل 1A) ، وهو ناقل bicistronic يحتوي على محفز β-actin الدجاج وموقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) لتعبير EGFP19. تحتوي بنيات Ube3a كاملة الطول على تسلسل علامة Myc الطرفية N ويتم استنساخها في pCIG2 باستخدام موقع SacI 5 'وموقع XmaI 3 '. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا استخدام مواقع EcoRI و EcoRV و PstI التي تحدث بشكل طبيعي ضمن تسلسل ترميز Ube3a لاستنساخ الأجزاء.
ملاحظة: يمكن الحصول على المتغيرات غير المحددة ل Ube3a من خلال الأدبيات وفي المستودعات المتاحة للجمهور مثل قاعدة بيانات ClinVar1. يمكن الحصول على متغيرات إضافية لم يتم الإبلاغ عنها من خلال التواصل الشخصي مع المراكز الطبية. - استخدم طريقة الطفرات الضخمةالمعدلة المكونة من خطوتين 20 لإدخال طفرات في إطار قراءة Ube3a . في الخطوة الأولى ، صمم قليل النوكليوتيد المطفر الذي يحتوي على الطفرة المطلوبة (المثال الموضح في هذا البروتوكول هو إنشاء متغير UBE3A Q588E) محاطا بما لا يقل عن 30 زوجا أساسيا (bp) من التماثل 5 ′ و 3 ′ إلى الطفرة (الشكل 1B والجدول 1).
- استخدم قليل النوكليوتيد المطفر جنبا إلى جنب مع قليل النوكليوتيد التكميلي للجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد 200-400 نقطة أساس ميغابريمر يحتوي على الطفرة (الشكل 1C; الجدول 2 والجدول 3). استخدم كامل 50 ميكرولتر من حجم تفاعل PCR للرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز باستخدام هلام 1٪ وتنقية هلام لاحقة (جدول المواد). قم بإخراج منتج PCR في 30 ميكرولتر من H 2 O منزوع الأيونات (diH2O) للاستخدامفي الجولة الثانية من خطوة PCR أدناه.
- قم بإعداد الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح (الشكل 1C ؛ الجدول 2 والجدول 3). ستولد هذه الخطوة شظايا أكبر من الحمض النووي (عادة ~ 1-1.5 كيلو بايت في الطول) تحتوي على مواقع الطفرة والتقييد النهائي المناسبة للاستنساخ الفرعي (الشكل 1C).
- بعد الانتهاء من تفاعل PCR ، قم بتنقية المنتج الناتج باستخدام مجموعة تنقية PCR (جدول المواد). قم بالتخلص من 30 ميكرولتر واهضم كل المنتج المنقى وبناء pCIG2 Ube3a WT مع إنزيمات التقييد المناسبة (يوضح المثال الهضم باستخدام EcoRI و XmaI).
- بعد 2 ساعة من الهضم عند 37 درجة مئوية ، قم بحل منتجات الهضم من خلال الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (1٪ هلام) ، وتنقية المنتجات المناسبة. قم بإعداد الأربطة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد) ، وقم بتحويل منتجات الربط إلى سلالة بكتيرية DH10B (جدول المواد) ، ثم قم بلوحة مع اختيار الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل).
- في اليوم التالي ، اختر مستعمرتين إلى أربع مستعمرات لتلقيح 3 مزارع مل تحتوي على مرق لوريا (LB) و 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين. دع الثقافات تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في حاضنة مدارية مع اهتزاز (225 دورة في الدقيقة).
- في اليوم التالي ، استخدم 1-1.5 مل من الثقافة البكتيرية لتحضير الحمض النووي البلازميد (جدول المواد). احفظ الثقافة المتبقية بوضعها في 4 درجات مئوية. فحص البلازميدات المصغرة عن طريق تسلسل سانجر باستخدام قليل النوكليوتيد الذي يربط ~ 200 bp من الطفرة المطلوبة.
- استخدم المزارع البكتيرية المحفوظة عند 4 درجات مئوية لإعادة تلقيح مزارع 50 مل ل midiprep البلازميد الصحيح (جدول المواد). تسلسل تسلسل ترميز Ube3a بالكامل للتحقق من صحة التسلسل الصحيح للحمض النووي.
- قم بإنشاء مخزون عامل من البلازميدات المتغيرة Ube3a ، بالإضافة إلى المراسل المنشط β-catenin (BAR) 21 ، TK-Renilla luciferase ، Ube3a الميت (طفرة UBE3A C820A) ، وناقل pCIG2 الفارغ بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام H2O المعقم لخطوات النقل اللاحقة.
2. تحضير ونقل خلايا الكلى الجنينية البشرية 293T (HEK293T)
- قم بإجراء المقايسات في خلايا HEK293T المزروعة في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل مسبقا بالجلوتامين ، ومصل البقر الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، وعامل مضاد حيوي مضاد للميكروبات كما هو موضح سابقا17. تنمو الخلايا في حاضنة معقمة ومرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
- باستخدام خزانة السلامة الحيوية ، قم أولا بطلاء خلايا HEK293T المعلقة على ألواح مسطحة القاع المعالجة بزراعة الأنسجة 96 بئرا بكثافة 2.2 × 104 خلايا لكل بئر في 100 ميكرولتر من وسائط الاستزراع والسماح لها بالنمو بين عشية وضحاها.
- في اليوم الثاني ، قم بنقل الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام بلازميدات مراسل Firefly و Renilla luciferase (الجدول 4) وبلازميدات Ube3a في ثلاث نسخ. إجراء عمليات النقل في 10 ميكرولتر من الحجم الكلي لكل بئر باستخدام نسبة 10: 1: 8 من البلازميدات (50 نانوغرام من BAR ، و 5 نانوغرام من TK-Renela ، و 40 نانوغرام من بلازميد Ube3a لكل بئر ، على التوالي) ، كما هو موضح سابقا18 ، و 0.4 ميكرولتر من كاشف النقل (الجدول 4).
ملاحظة: لكل تجربة ، يتم أيضا نقل متجه فارغ (GFP فقط) و Ube3a الميت بترميز البلازميد ليكون بمثابة عناصر تحكم سلبية. - قم بإنشاء مزيج رئيسي لعمليات النقل لكل متغير في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (الجدول 4) واحتضانه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بتحريك خليط النقل برفق عن طريق النقر على الأنبوب ، ثم أضف 10 ميكرولتر من خليط النقل مباشرة إلى وسائط النمو الموجودة في الآبار.
- بعد ذلك ، أعد الخلايا إلى الحاضنة واترك البلازميدات تعبر لمدة 48 ساعة. استبدال وسائط النمو ليس ضروريا.
- مراقبة كفاءة النقل عن طريق مضان GFP باستخدام مجهر مضان. يتم نقل خلايا HEK293T بكفاءة بهذه الطريقة ، ويجب أن تعبر >80٪ من الخلايا عن GFP بعد 48 ساعة.
3. قياس نشاط لوسيفيراز
ملاحظة: يتم تقييم نشاط لوسيفيراز باستخدام نظام متاح تجاريا يقوم بفحص كل من Firefly و Renilla luciferase (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- استنشاق وسائط الاستزراع بعناية من خلايا HEK293T المنقولة ، ثم اغسل الخلايا بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS). قم بشفط PBS وقم بتحليل الخلايا بإضافة 25 ميكرولتر من محلول التحلل غير المعطل واحتضانه لمدة 15 دقيقة مع هزاز لطيف على الجليد.
- بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولتر من المحللة الناتجة (لا يلزم الطرد المركزي) إلى لوحة فحص جديدة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من كاشف ركيزة لوسيفيراز Firefly. امزج الطبق برفق عن طريق النقر.
- قم بتحميل اللوحة على قارئ لوحة وقم بقياس التلألؤ باستخدام كاشف علوي بارتفاع قراءة 1 مم ووقت تكامل يبلغ 1 ثانية.
ملاحظة: قد يلزم ضبط كسب الكاشف بناء على قوة الإشارة. - مباشرة بعد قراءة تلألؤ لوسيفيراز اليراع ، أضف 100 ميكرولتر من ركيزة رينيلا لوسيفيراز إلى الآبار. هذه الخطوة في نفس الوقت تروي نشاط لوسيفيراز اليراع أثناء تقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز. امزج العينات عن طريق التقليب اللطيف للوحة وقياس التلألؤ مرة أخرى لتقييم نشاط رينيلا لوسيفيراز.
ملاحظة: بينما يمكن استخدام لوحات أخرى لهذا الفحص ، فإن استخدام الألواح ذات الإطارات السوداء والآبار البيضاء سيوفر النتائج الأكثر حساسية لأن هذا يضخم إشارة لوسيفيراز مع تقليل الضوضاء. - حدد استجابات المراسل كنسبة لوسيفيراز اليراع إلى رينيلا لوسيفيراز (Firefly / Renilla) ، ومتوسط قيم القياسات الثلاثية. بعد ذلك ، قم بتطبيع قيمة Firefly / Renilla لكل متغير مقابل قيم الخلايا المعبرة عن Ube3a من النوع البري (WT) لمقارنة النشاط النسبي للبروتينات المتغيرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يحدد الفحص الوظيفي واسع النطاق لمتغيرات Ube3a الخاطئة مشهدا واسعا من طفرات فقدان واكتساب الوظيفة
اقترح العمل السابق مع طفرات Ube3a أن استجابة Wnt يمكن أن تكون بمثابة مراسل لنشاط بروتين UBE3A الخلوي. تم توسيع هذه الملاحظات ، وتم إجراء تجارب تحقق إضافية للتحقق مما إذا كان اختبار BAR مناسبا للإبلاغ عن مجموعة من أنشطة UBE3A في الخلية. أولا ، تم نقل خلايا HEK293T بكميات متفاوتة من الحمض النووي البلازميد الذي يشفر WT Ube3a البشري. أظهرت هذه التجربة أن استجابة BAR تتغير خطيا مع كمية Ube3a المنقولة إلى الخلايا (الشكل 2 أ). ثانيا ، تم اختبار اختبار اختبار BAR باستخدام متغيرات مرتبطة بالحمض النووي المشفر للبلازميد والتي تم وصفها سابقا في الأدبيات22. من بين هذه المتغيرات الحميدة (R39H و A178T) ، متغير واحد مرتبط بالتوحد (T458A) ، ومجموعة من المتغيرات المؤكدة المرتبطة بمتلازمة أنجلمان والتي تسبب فقدان وظيفة UBE3A من خلال آليات مختلفة15,22. حدد اختبار BAR بشكل صحيح كل متغير (الشكل 2 ب) ، بما في ذلك جميع متغيرات فقدان الوظيفة ، مما يدل على دقة وعمومية هذه الطريقة18.
تم استخدام اختبار BAR لفحص 152 متغيرا خاطئا ، تم تحديد معظمها من قاعدة بيانات ClinVar. على غرار الأدلة الجينية المتعلقة باختلافات عدد النسخ في الاضطرابات المعتمدة على Ube3a ، كان التأثير الوظيفي للمتغيرات الخاطئة واسعا وشمل المتغيرات الحميدة بالإضافة إلى متغيرات فقدان الوظيفة واكتساب الوظيفة (الشكل 3) 18. ذات أهمية خاصة ، كانت متغيرات اكتساب الوظيفة التي تم تحديدها باستخدام هذه الطريقة كلها جديدة ، واقترح التحقق اللاحق بقوة أنها تحدد فئة فرعية من الاضطرابات المعتمدة على Ube3a مع الأنماط الظاهرية التي تختلف عن متلازمة أنجلمانالكلاسيكية 18.
غالبا ما يكون تأثير المتغيرات الخاطئة غير متوقع ، مما يؤكد الحاجة إلى التقييم الوظيفي
ملاحظة مثيرة للاهتمام من الفحص الوظيفي لمتغيرات Ube3a هي أن التغييرات في بعض مواضع الأحماض الأمينية تنتج تأثيرات مختلفة بشكل جذري ، مما يؤكد أهمية تقييم المتغير التجريبي18. على سبيل المثال ، تم تحديد ثلاثة أفراد مع متغيرات في موضع الجلوتامين 588 (Q588) في UBE3A والتي تضمنت استبدال الغلوتامات المكتسبة من الوظيفة (Q588E) ، واستبدال الأرجينين بفقدان الوظيفة (Q588R) ، واستبدال آخر للبرولين بفقدان الوظيفة (Q588P; الشكل 4 أ). تم استخدام نهج طفرة شامل لتحور موضع Q588 إلى كل حمض أميني ممكن. عندما تم قياس نشاط هذه المتغيرات باستخدام اختبار BAR ، أظهر أن أي حمض أميني سالب الشحنة في الموضع 588 ينتج إنزيما مفرط النشاط (الشكل 4 ب). قدمت هذه الرؤية أدلة وظيفية مهمة سمحت باكتشاف موقع جديد داخل مجال HECT ل UBE3A الذي يسهل استطالة سلسلة ubiquitin18.
الشكل 1: الطفرات المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ل Ube3a. (أ) تمثيل متجه تعبير Ube3a الذي يشير إلى مواقع التقييد ذات الصلة. (ب) تتابع الحمض النووي (DNA) الذي يشفر UBE3A موضح في الأعلى. يشار إلى كودون Q588 بأحرف غامقة. يظهر التمهيدي للطفرات Q588E (Mut. التمهيدي) محاذاة لتسلسل UBE3A. تشير الحروف الحمراء إلى موقع الطفرات. (ج) يظهر رسم تخطيطي لتفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد الميجا برايمر وشظية الحمض النووي المستخدمة لاستنساخ جزء Q588E. يشار إلى موضع طفرة Q588E بعلامة النجمة الحمراء. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: التحقق من صحة مقايسة BAR كمراسل لنشاط UBE3A ubiquitin ligase. (أ) تظهر خلايا HEK293T المنقولة بكميات متزايدة من ترميز البلازميد WT UBE3A زيادة خطية في استجابة BAR. يتم عرض القيم المتوسطة لنسب Firefly / Renilla luciferase ± الخطأ المعياري (SE). N = 3 تجارب مستقلة. (ب) تم اختبار متغيرات Ube3a المميزة سابقا في اختبار BAR. تمت تسوية الاستجابات ل WT UBE3A ، وتظهر القيم كمتوسط ± SE. عدد التجارب (n) وقيم p المحسوبة باستخدام اختبار t لعينة واحدة (ثنائي الذيل) مع تصحيح مقارنات متعددة Benjamini-Hochberg (FDR = 0.05) هي كما يلي: GFP ، n = 19 ، ***p = 1.733 × 10−31 ؛ WT UBE3A ، ن = 19 ؛ UBE3A LD ، ن = 19 ، ***p = 1.519 × 10−31 ؛ R39H ، ن = 3 ، ع = 0.567 ؛ A178T ، ن = 4 ، ع = 0.828 ؛ T485A ، ن = 5 ، * ع = 0.019 ؛ C21Y ، ن = 3 ، ***p = 8.725 × 10−6 ؛ C117R ، ن = 3 ، ***p = 3.419 × 10−4 ؛ N243K ، ن = 3 ، ** ع = 0.0072 ؛ E269G ، ن = 3 ، ** ع = 7.787 × 10−4 ؛ L273F ، ن = 3 ، ** ع = 0.0052 ؛ S349P ، ن = 3 ، ** ع = 0.0016 ؛ L502P ، ن = 3 ، ** ع = 0.0033 ؛ R506C ، ن = 3 ، ** ع = 0.0033 ؛ T106K ، ن = 6 ، ** ع = 0.0.0078 ؛ T106P ، ن = 3 ، ** ع = 0.0013 ؛ I130T ، ن = 6 ، * ع = 0.016 ؛ R477P ، ن = 3 ، ***p = 4.24 × 10−4 ؛ M478I ، ن = 3 ، ***p = 3.39 × 10−4 ؛ R482P ، ن = 3 ، ** ع = 5.82 × 10−4 ؛ I329T ، ن = 5 ، ***p = 1.22 × 10−5 ؛ E550L ، ن = 3 ، * ع = 0.0013. أعيد طبع البيانات بإذن من Weston et al.18. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: متغيرات UBE3A التي تشمل مجموعة واسعة من التأثيرات الوظيفية. شاشة فحص BAR ل 152 متغيرا من متغيرات Ube3a تظهر طفرات حميدة (رمادية) وفقدان الوظيفة (أزرق) واكتساب الوظيفة (حمراء) بالنسبة إلى WT UBE3A . تم تحديد الدلالة باستخدام اختبار t لعينة واحدة (ثنائي الذيل) مع تصحيح مقارنات متعددة Benjamini-Hochberg (FDR = 0.05). الأحمر ، كسب الوظيفة ؛ رمادي ، لا تغيير من WT UBE3A ؛ أزرق ، فقدان الوظيفة. أعيد طبع البيانات بإذن من Weston et al.18. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: متغيرات UBE3A التي تشمل مجموعة واسعة من التأثيرات الوظيفية. (أ) نتائج مقايسة BAR للمتغيرات في الموضع 588 من UBE3A تظهر بدائل الخسارة وكسب الوظيفة. Q588E ، ن = 6 ؛ Q588P ، ن = 3 ؛ Q588R ، ن = 4 ؛ p < 0.0005 ، اختبار t لعينة واحدة (ثنائي الذيل) مع تصحيح مقارنة متعددة Benjamini-Hochberg (FDR = 0.05). (ب) مخطط حراري يوضح نتائج BAR الطبيعية للتحليل الطفري الشامل في الموضع 588 في UBE3A. يمثل التظليل الأبيض مستويات نشاط WT UBE3A ، ويشير التظليل الأزرق إلى فقدان الوظيفة ، ويشير التظليل الأحمر إلى كسب الوظيفة. يعرض شريط المقياس النسبة المئوية للتغير بالنسبة إلى WT UBE3A. N = 3 تجارب مستقلة ل Q588S و Q588T و Q588N و Q588K و Q588P و Q588M و Q588G و Q588A و Q588F و Q588Y و Q588W و Q588L و Q588V و Q588I و Q588C ؛ n = 8 ل Q588E ، n = 6 ل Q588D ، n = 5 ل Q588R ، n = 4 ل Q588H ، * p < 0.05 ، ** p < 0.005 ، *** p < 0.0005. اختبار t لعينة واحدة (ثنائي الذيل) مع تصحيح مقارنات متعددة Benjamini-Hochberg (FDR = 0.05). أعيد طبع البيانات بإذن من Weston et al.18. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| اسم | تسلسل | تستخدم ل | |
| التمهيدي 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a إحساس إيكوري | |
| Mut. التمهيدي | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT كاغاغاتاأكتاكCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E الطفرات المضادة للحساسية | |
| التمهيدي 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI مضاد للحساسية | |
الجدول 1: البادئات المستخدمة في الطفرات UBE3A Q588E.
| 1st جولة PCR | |
| الكاشف | كمية التفاعل |
| 5x عازلة عالية الدقة | 10 ميكرولتر |
| dNTP (مخزون 10 مللي متر) | 1 ميكرولتر |
| التمهيدي 1 (مخزون 10 مللي متر) | 1 ميكرولتر |
| التمهيدي 2 (مخزون 10 مللي متر) | 1 ميكرولتر |
| WT-Ube3a DNA (مخزون 150 نانوغرام / ميكرولتر) | 1 ميكرولتر |
| H2O | 35 ميكرولتر |
| بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | 1 ميكرولتر |
| الحجم الإجمالي | 50 ميكرولتر |
| 2nd الجولة PCR | |
| الكاشف | كمية التفاعل |
| 5x عازلة عالية الدقة | 10 ميكرولتر |
| dNTP (مخزون 10 مللي متر) | 1 ميكرولتر |
| التمهيدي 3 (مخزون 10 مللي متر) | 1 ميكرولتر |
| منتج PCR المنقى (Megaprimer) | 30 ميكرولتر |
| WT-Ube3a DNA (مخزون 150 نانوغرام / ميكرولتر) | 1 ميكرولتر |
| H2O | 6 ميكرولتر |
| بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | 1 ميكرولتر |
| الحجم الإجمالي | 50 ميكرولتر |
الجدول 2: بارامترات تفاعل البوليميراز المتسلسل للطفرات.
| 1st جولة PCR | ||
| درج | درجة الحرارة | الوقت |
| تمسخ أولي | 95 درجة مئوية | 2 دقيقة |
| (1 دورة) | ||
| تمسخ | 95 درجة مئوية | 30 ثانية |
| الصلب | 50 درجة مئوية | 20 ثانية |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 15 ثانية |
| (30 دورة) | ||
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة |
| مسك | 4 درجة مئوية | انهائي |
| 2nd الجولة PCR | ||
| درج | درجة الحرارة | الوقت |
| تمسخ أولي | 95 درجة مئوية | 2 دقيقة |
| (1 دورة) | ||
| تمسخ | 95 درجة مئوية | 30 ثانية |
| الصلب | 50 درجة مئوية | 20 ثانية |
| امتداد | 72 درجة مئوية | 35 ثانية |
| (30 دورة) | ||
| التمديد النهائي | 72 درجة مئوية | 1 دقيقة |
| مسك | 4 درجة مئوية | انهائي |
الجدول 3: معلمات برنامج تفاعل البوليميراز المتسلسل للطفرات.
| الكاشف | تركيز العمل | 1x نقل | 3.5x ماستر ميكس |
| pGL3 شريط البلازميد | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 0.5 ميكرولتر | 1.75 ميكرولتر |
| pTK رينيلا بلازميد | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 0.05 ميكرولتر | 0.175 ميكرولتر |
| Ube3a بلازميد | 100 نانوغرام / ميكرولتر | 0.4 ميكرولتر | 1.4 ميكرولتر |
| مكمل DMEM بالجلوتامين | 8.65 ميكرولتر | 30.275 ميكرولتر | |
| كاشف النقل | 0.4 ميكرولتر | 1.4 ميكرولتر |
الجدول 4: مخاليط النقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة فعالة وقابلة للتطوير لتقييم النشاط الأنزيمي لمتغيرات Ube3a. هناك العديد من التفاصيل الفنية التي تتطلب دراسة متأنية عند استخدام هذا الفحص. أحد الاعتبارات هو اختيار بلازميدات مراسل Wnt المستخدمة في هذا الفحص. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا على وجه التحديد المراسل المنشط β-catenin (BAR)21 ، وهو مراسل يحتوي على سلسلة من 12 عنصر استجابة لعامل الخلايا التائية (TCF) مفصولة بتسلسلات رابط مصممة خصيصا لتقليل إعادة التركيب وفقدان مواقع ربط TCF. هناك بلازميدات مراسل Wnt إضافية قائمة على luciferase موصوفة في الأدبيات23 ، وعلى الرغم من أن الدراسات السابقة تشير إلى أنه يمكن استخدام بعضها لتقييم نشاط UBE3A ، فقد تم وصف بلازميد BAR بشكل أكثر شمولا لهذا الغرض17,18. ثانيا ، يعد اختيار بلازميد رينيلا لوسيفيراز أمرا بالغ الأهمية. يتم تضمين ترميز البلازميد Renilla luciferase أثناء خطوة النقل لتطبيع كفاءة النقل. يعبر البلازميد المستخدم في هذا البروتوكول بشكل أساسي عن رينيلا لوسيفيراز تحت سيطرة مروج ثيميدين كيناز (TK-Renilla). قد يؤدي استخدام البلازميدات التي تحتوي على محفزات أخرى ، مثل مروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) المستخدم على نطاق واسع ، إلى نتائج متغيرة في تعبير رينيلا لوسيفيراز.
الاعتبار الثاني هو سلوك الخلايا اعتمادا على نوع والكثير من FBS المستخدمة لزراعة الخلايا. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤثر FBS بشكل متغير على معدل نمو خلايا HEK293T. تم تحسين البروتوكول الحالي مع الخلايا التي تظهر وقت مضاعفة نموذجي من 18-24 ساعة ، مما يجعل كثافة الخلية في وقت النقل حوالي ~ 4 × 104 خلايا لكل بئر. نظرا لأن كثافة الخلايا قد تؤثر على كفاءة النقل ، يجب تقييم معدلات نمو الخلايا بعناية من قبل المستخدم وتعديل أرقام الخلايا وفقا لذلك في وقت الطلاء. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب استجابة BAR المعتمدة على UBE3A وجود قدر من Wnt ligand أثناء التجربة. في معظم الظروف القياسية ، هناك ما يكفي من Wnt في FBS لدفع هذه الاستجابة ؛ ومع ذلك ، يمكن أن تختلف هذه الاستجابة أيضا. يوصى بمعايرة نسب البلازميد المستخدمة في النقل لضمان قياس استجابة BAR ضمن النطاق الخطي المناسب. النهج البديل هو تحفيز إشارات Wnt باستخدام ليجند Wnt المؤتلف أو وسائط النمو المكملة Wnt17.
تتمثل ميزة اختبار BAR في أنه يمكنه الإبلاغ عن نشاط يوبيكويتين ليجاز لجميع أشكال Ube3a . يعبر البشر عن ثلاثة أشكال متساوية من Ube3a تختلف في أقصى N-termini بسبب استخدام مواقع بدء النسخ البديلة24. يوفر اختبار BAR نفس القراءة اللاأدرية للأشكال المتساوية ، وبالتالي ، يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم جميع متغيرات Ube3a . بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التوصيف واسع النطاق لمتغيرات Ube3a بيانات بنية ووظيفة عميقة يمكنها الكشف عن مجالات وآليات جديدة تعتبر حاسمة لوظيفة الإنزيم. استخدمت دراسة سابقة بيانات متغيرة لاكتشاف مجال ربط يوبيكويتين داخل UBE3A يسهل استطالة سلسلة يوبيكويتين18. من المرجح أن توفر دراسات وظائف الهيكل الإضافية رؤى جديدة حول الآليات الكيميائية الحيوية ل UBE3A التي يمكن الاستفادة منها في التطوير العلاجي.
هناك بعض القيود على مقايسة BAR التي تستدعي دراسة متأنية عند تحديد إمراضية المتغير. نظرا للبصمة اللاجينية ل Ube3a في الخلايا العصبية ، لا يمكن لهذا الفحص التمييز بين أليلات الأم والأب ، ويجب وزن الأدلة الجينية الإضافية جنبا إلى جنب مع البيانات الوظيفية لتحديد إمراضية المتغير. علاوة على ذلك ، يجب النظر في المتغيرات الإضافية التي تتجاوز نشاط يوبيكويتين ليجاز UBE3A في سياق المرض. على سبيل المثال ، أظهر العمل السابق أن UBE3A المترجمة نوويا تساهم في أمراض متلازمة أنجلمان25 وأن بعض المتغيرات تزعج نمط التوطين هذا للإنزيم26. وبالتالي ، يجب إجراء توصيفات إضافية في المراحل النهائية للحصول على فهم كامل لمساهمة متغيرات Ube3a في أمراض النمو العصبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة سيمونز جسر إلى الاستقلال (جائزة SFARI #387972; J.J.Y.) ، وجائزة NARSAD للباحثين الشباب من مؤسسة أبحاث الدماغ والسلوك (JJY) ، وزمالة بحثية من مؤسسة Alfred P. Sloan (JJY) ، ومنح بحثية من مؤسسة Angelman Syndrome Foundation (JJY) ، ومؤسسة Whitehall (J.J.Y.) ، و NIMH (R01MH122786; ج. ج. ي.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
