Summary
En enkel og skalerbar metode blev udviklet til at vurdere den funktionelle betydning af missense-varianter i Ube3a, et gen, hvis tab og funktionsgevinst er forbundet med både Angelman syndrom og autismespektrumforstyrrelse.
Abstract
Den øgede brug af sekventering i medicin har identificeret millioner af kodende varianter i det menneskelige genom. Mange af disse varianter forekommer i gener forbundet med neuroudviklingsforstyrrelser, men den funktionelle betydning af langt de fleste varianter forbliver ukendt. Den nuværende protokol beskriver undersøgelsen af varianter for Ube3a, et gen, der koder for en E3 ubiquitin ligase forbundet med både autisme og Angelman syndrom. Duplikering eller tredobling af Ube3a er stærkt forbundet med autisme, mens dets sletning forårsager Angelman syndrom. Således er forståelse af valensen af ændringer i UBE3A-proteinaktivitet vigtig for kliniske resultater. Her beskrives en hurtig, cellebaseret metode, der parrer Ube3a-varianter med en Wnt-vejreporter. Dette enkle assay er skalerbart og kan bruges til at bestemme valensen og størrelsen af aktivitetsændringer i enhver Ube3a-variant . Desuden tillader faciliteten af denne metode generering af et væld af strukturfunktionsinformation, som kan bruges til at få dyb indsigt i de enzymatiske mekanismer i UBE3A.
Introduction
Nylige teknologiske fremskridt har gjort sekventering af exomer og genomer rutine i kliniske indstillinger 1,2. Dette har ført til opdagelsen af et stort antal genetiske varianter, herunder millioner af missense-varianter, der typisk ændrer en aminosyre i et protein. At forstå den funktionelle betydning af disse varianter er fortsat en udfordring, og kun en lille brøkdel (~ 2%) af de kendte missense-varianter har en klinisk fortolkning 1,3.
Et fremtrædende eksempel på dette problem er Ube3a, et gen, der koder for en E3 ubiquitin ligase, der er målrettet mod substratproteiner til nedbrydning4. Ube3a ligger inden for kromosom 15q11-13 og udtrykkes udelukkende fra den moderligt arvede allel 5,6,7. Observationer fra sygdomsgenetik tyder stærkt på, at utilstrækkelig eller overdreven aktivitet af UBE3A-enzymet forårsager forskellige neuroudviklingsforstyrrelser. Sletning af moderkromosom 15q11-13 forårsager Angelman syndrom (AS)8, en lidelse præget af alvorlig intellektuel handicap, motoriske svækkelser, anfald, en glad opførsel med hyppigt smil og dysmorfe ansigtstræk 8,9,10. I modsætning hertil forårsager duplikering eller tredobling af moderkromosom 15q11-13 Dup15q syndrom, en heterogen tilstand anerkendt som en af de mest udbredte syndromiske former for autisme11,12,13. Derudover er der hundredvis af missense-varianter identificeret i Ube3a, hvoraf størstedelen betragtes som varianter af usikker betydning (VUS), da deres funktionelle og kliniske betydning er ukendt. Der er således stor interesse for at udvikle metoder, der empirisk kan vurdere Ube3a-varianter for at afgøre, om de bidrager til neuroudviklingssygdom.
UBE3A-enzymet tilhører HECT-domænefamilien (homolog til E6-AP C-terminus) af E3-ubiquitin-ligaser, der alle besidder det eponyme HECT-domæne, som indeholder det biokemiske maskineri, der er nødvendigt for at acceptere aktiveret ubiquitin fra E2-enzymer og overføre det til substratproteiner14. Historisk set har karakteriseringen af E3-enzymer været afhængig af rekonstituerede in vitro-systemer, der kræver et ensemble af oprensede proteiner 4,15,16. Sådanne metoder er langsomme og arbejdskrævende og ikke egnede til at vurdere aktiviteten af et stort antal varianter. I tidligere arbejde blev UBE3A identificeret for at aktivere Wnt-vejen i HEK293T-celler ved at modulere proteasomets funktion for at bremse nedbrydningen af β-catenin17. Denne indsigt gør det muligt at bruge Wnt-vejreportere som en effektiv og hurtig metode til at identificere både tabs- og gevinst-af-funktionsvarianter af Ube3a18. Protokollen nedenfor beskriver detaljeret en metode til at generere Ube3a-varianter samt en luciferase-baseret reporter til at vurdere ændringer i aktiviteten af Ube3a-varianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mutagenesekloning for at generere Ube3a-varianter
- Klon alle Ube3a-varianter ind i pCIG2-plasmidet (figur 1A), en bicistronisk vektor, der indeholder en kylling-β-actin-promotor og et internt ribosomindgangssted (IRES) til EGFP-ekspression19. Ube3a-konstruktioner i fuld længde indeholder en N-terminal Myc-tag-sekvens og klones til pCIG2 ved hjælp af et 5' SacI-sted og et 3' XmaI-sted. Derudover bruges naturligt forekommende EcoRI-, EcoRV- og PstI-steder inden for Ube3a-kodningssekvensen også til at subklone fragmenter.
BEMÆRK: Afidentificerede varianter for Ube3a kan fås gennem litteraturen og i offentligt tilgængelige arkiver såsom ClinVar-databasen1. Yderligere urapporterede varianter kan fås gennem personlig kommunikation med medicinske centre. - Brug en tilpasset to-trins megaprimer mutagenese metode20 til at introducere mutationer i Ube3a læserammen. I det første trin skal du designe det mutagene oligonukleotid, der indeholder den ønskede mutation (eksemplet vist i denne protokol er at generere en UBE3A Q588E-variant) flankeret af mindst 30 basepar (bp) homologi 5 ′ og 3 ′ til mutationen (figur 1B og tabel 1).
- Brug det mutagene oligonukleotid sammen med et komplementært oligonukleotid til den første runde PCR til at generere en 200-400 bp megaprimer indeholdende mutationen (figur 1C; Tabel 2 og tabel 3). Brug hele 50 μL af PCR-reaktionsvolumenet til agarosegelelektroforese ved anvendelse af en 1% gel og efterfølgende gelrensning (materialetabel). Elute PCR-produktet i 30 μL deioniseret H 2 O (diH2O) til brug i anden runde PCR-trin nedenfor.
- Opsæt anden runde PCR som angivet (figur 1C; Tabel 2 og tabel 3). Dette trin vil generere større DNA-fragmenter (typisk ~ 1-1,5 kb i længden) indeholdende mutations- og terminale begrænsningssteder, der er egnede til underkloning (figur 1C).
- Efter afslutningen af PCR-reaktionen skal du rense det resulterende produkt ved hjælp af et PCR-rensningssæt (Materialetabel). Elute i 30 μL og fordøje hele det rensede produkt og pCIG2 Ube3a WT-konstruktionen med de relevante restriktionsenzymer (eksemplet viser fordøjelse med EcoRI og XmaI).
- Efter 2 timers fordøjelse ved 37 °C skal fordøjelsesprodukterne opløses gennem agarosegelelektroforese (1% gel) og gelrenses de relevante produkter. Opsæt ligeringer i henhold til producentens protokol (materialetabel), omdan ligeringsprodukterne til en DH10B-bakteriestamme (materialetabel) og derefter plade med ampicillin (100 μg / ml) valg.
- Den næste dag skal du vælge to til fire kolonier for at inokulere 3 ml kulturer indeholdende Luria bouillon (LB) og 100 μg / ml ampicillin. Lad kulturerne vokse natten over ved 37 °C i en orbital inkubator med omrystning (225 o / min).
- Den følgende dag skal du bruge 1-1,5 ml bakteriekultur til at miniprep plasmid-DNA'et (materialetabel). Gem den resterende kultur ved at placere dem ved 4 °C. Screen de miniprepped plasmider ved Sanger-sekventering ved hjælp af et oligonukleotid, der binder ~ 200 bp fra den ønskede mutation.
- Brug bakteriekulturerne gemt ved 4 °C til at re-inokulere 50 ml kulturer for at midiprep det korrekte plasmid (Tabel over materialer). Sekvenser Ube3a-kodningssekvensen fuldt ud for at validere den korrekte sekvens af DNA'et.
- Opret arbejdslagre af Ube3a-variantplasmider samt den β-cateninaktiverede reporter (BAR)21, TK-Renilla luciferase, ligasedød Ube3a (UBE3A C820A-mutation) og pCIG2-tom vektor i en koncentration på 100 ng/μL ved anvendelse af sterilH2O-faktortil de efterfølgende transfektionstrin.
2. Forberedelse og transfektion af humane embryonale nyreceller 293T (HEK293T)
- Udfør assays i HEK293T-celler dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) præsuppleret med glutamin, 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotisk-antimykotisk middel som beskrevet tidligere17. Cellerne dyrkes i en steril, befugtet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Ved hjælp af et biosikkerhedsskab skal du først plade de suspenderede HEK293T-celler på vævskulturbehandlede 96-godt fladbundede plader med en densitet på 2,2 × 104 celler pr. Brønd i 100 μL kulturmedier og lade dem vokse natten over.
- På den anden dag transficeres cellerne i et biosikkerhedsskab med Firefly og Renilla luciferase reporterplasmider (tabel 4) og Ube3a-plasmider i tre eksemplarer. Transfektionerne udføres i 10 μL af det samlede volumen pr. brønd ved hjælp af et 10: 1: 8-forhold mellem plasmider (henholdsvis 50 ng BAR, 5 ng TK-Rennie og 40 ng Ube3a-plasmid pr. Brønd), som tidligere beskrevet18 og 0,4 μL transfektionsreagens (tabel 4).
BEMÆRK: For hvert eksperiment transficeres også en tom vektor (kun GFP) og et plasmid, der koder for ligasedød Ube3a , for at tjene som negative kontroller. - Opret en masterblanding til transfektionerne for hver variant i et 1,5 ml mikrocentrifugerør (tabel 4) og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 15 minutter. Efter inkubationen omrøres transfektionsblandingen forsigtigt ved at tappe røret, og tilsæt derefter 10 μL af transfektionsblandingen direkte til det eksisterende vækstmedie i brøndene.
- Derefter returneres cellerne til inkubatoren og lad plasmiderne udtrykke sig i 48 timer. Udskiftning af vækstmedierne er ikke nødvendig.
- Overvåg transfektionseffektiviteten ved GFP-fluorescens ved hjælp af et fluorescensmikroskop. HEK293T-celler transficeres effektivt ved denne metode, og >80% af cellerne skal udtrykke GFP efter 48 timer.
3. Måling af luciferaseaktivitet
BEMÆRK: Luciferaseaktivitet vurderes ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system, der analyserer både Firefly og Renilla luciferase (Materialetabel) i henhold til producentens protokol.
- Opsug forsigtigt kulturmediet fra transinficerede HEK293T-celler, og vask derefter cellerne med koldt fosfatbufferet saltvand (PBS). Aspirer PBS og lys cellerne ved at tilsætte 25 μL ikke-denaturerende lysisbuffer og inkuberes i 15 minutter med blid rocking på is.
- Derefter tilsættes 20 μL af det resulterende lysat (ingen centrifugering er nødvendig) i en ny 96-brønds analyseplade indeholdende 100 μL af et Firefly luciferase substratreagens. Bland pladen forsigtigt ved at banke.
- Læg pladen på en pladelæser, og mål luminescensen ved hjælp af en topdetektor med en læsehøjde på 1 mm og en integrationstid på 1 s.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere detektorens forstærkning baseret på signalets styrke. - Umiddelbart efter at have læst Firefly luciferase luminescens, tilsættes 100 μL Renilla luciferase substrat til brøndene. Dette trin slukker samtidig Firefly luciferase-aktiviteten, mens Renilla luciferase-aktiviteten vurderes. Bland prøverne ved blid omrøring af pladen og mål luminescensen igen for at vurdere Renilla luciferase-aktiviteten.
BEMÆRK: Mens andre plader kan bruges til dette assay, vil brug af plader med sorte rammer og hvide brønde give de mest følsomme resultater, da dette forstærker luciferasesignalet, samtidig med at støj minimeres. - Kvantificer reportersvarene som Firefly luciferase til Renilla luciferase ratio (Firefly / Renilla), og gennemsnit værdierne for de tredobbelte målinger. Derefter normaliseres Firefly/Renilla-værdien for hver variant mod værdierne for wild-type (WT) Ube3a-ekspressionsceller for at sammenligne den relative aktivitet af variantproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Storstilet funktionel screening af Ube3a missense-varianter identificerer et bredt landskab af tabs- og gevinst-af-funktionsmutationer
Tidligere arbejde med Ube3a-mutanter antydede, at Wnt-responsen kan tjene som reporter af cellulær UBE3A-proteinaktivitet. Disse observationer blev udvidet, og yderligere valideringseksperimenter blev udført for at undersøge, om BAR-analysen er egnet til at rapportere en række UBE3A-aktiviteter i cellen. Først blev HEK293T-celler transficeret med varierende mængder plasmid-DNA, der koder for human WT Ube3a. Dette eksperiment viste, at BAR-responsen ændrer sig lineært med mængden af Ube3a transficeret til celler (figur 2A). For det andet blev BAR-analysen testet ved hjælp af plasmid-DNA, der koder for sygdomsbundne varianter, der tidligere var karakteriseret i litteraturen22. Blandt disse var godartede varianter (R39H og A178T), en autisme-bundet gain-of-function-variant (T458A) og en samling af bekræftede Angelman syndrom-linkede varianter, der forårsager et tab af UBE3A-funktion gennem forskellige mekanismer15,22. BAR-analysen identificerede korrekt hver variant (figur 2B), herunder alle funktionstabsvarianter, hvilket viser nøjagtigheden og generaliteten af denne metode18.
BAR-analysen blev brugt til at screene 152 missense-varianter, hvoraf de fleste blev identificeret fra ClinVar-databasen. I lighed med genetiske beviser vedrørende kopinummervariationer i Ube3a-afhængige lidelser var den funktionelle virkning af missense-varianter bred og omfattede godartede varianter samt både funktionstab og gain-of-function-varianter (figur 3)18. Af særlig interesse var de gain-of-function-varianter, der blev identificeret ved hjælp af denne metode, alle nye, og efterfølgende validering antydede kraftigt, at de definerer en underklasse af Ube3a-afhængige lidelser med fænotyper, der adskiller sig fra klassisk Angelman-syndrom18.
Effekten af missense-varianter er ofte uforudsigelig, hvilket understreger behovet for funktionel vurdering
En spændende observation fra den funktionelle screening af Ube3a-varianter er, at ændringer ved nogle aminosyrepositioner producerer drastisk forskellige effekter og derved understreger vigtigheden af empirisk variantvurdering18. For eksempel blev tre individer identificeret med varianter ved glutamin 588 (Q588) position i UBE3A, der omfattede en gain-of-function glutamatsubstitution (Q588E), en tab-af-funktion arginin substitution (Q588R) og et andet tab af funktion prolin substitution (Q588P; Figur 4A). En omfattende mutationsmetode blev brugt til at mutere Q588-positionen til enhver mulig aminosyre. Når aktiviteten af disse varianter blev målt ved hjælp af BAR-analysen, viste det, at enhver negativt ladet aminosyre i 588-positionen producerer et hyperaktivt enzym (figur 4B). Denne indsigt gav vigtige funktionelle spor, der tillod opdagelsen af et nyt sted inden for HECT-domænet for UBE3A, der letter ubiquitinkædeforlængelse18.
Figur 1: PCR-afhængig mutagenese af Ube3a. (A) Repræsentation af Ube3a-ekspressionsvektoren , der angiver relevante begrænsningssteder. (B) DNA-sekvensen, der koder for UBE3A, er vist øverst. Q588-kodonen er angivet med fed skrift. Q588E mutageneseprimeren (Mut. primer) vises justeret til UBE3A-sekvensen. Den røde skrift angiver det mutageniserede sted. (C) Der vises et skema over PCR til generering af megaprimeren og DNA-fragmentet, der bruges til at subklone Q588E-fragmentet. Placeringen af Q588E-mutationen er angivet med den røde stjerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Validering af BAR-analysen som en reporter af UBE3A ubiquitin ligase aktivitet . (A) HEK293T-celler transficeret med stigende mængder plasmid, der koder for WT UBE3A, viser en lineær stigning i BAR-responsen. Middelværdier vises for Firefly/Renilla luciferase-forhold ± standardfejl (SE). N= 3 uafhængige eksperimenter. (B) Tidligere karakteriserede Ube3a-varianter blev testet i BAR-analysen. Svarene blev normaliseret til WT UBE3A, og værdierne vises som middelværdien ± SE. Antallet af eksperimenter (n) og p-værdier beregnet ved hjælp af en en-prøve t-test (to-halet) med Benjamini-Hochberg multiple comparisons correction (FDR = 0,05) er som følger: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10-31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1.519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3.419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7.787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10-5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Data genoptrykt med tilladelse fra Weston et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: UBE3A-varianter, der omfatter en bred vifte af funktionelle effekter. BAR-analyseskærm af 152 Ube3a-varianter , der viser godartede (grå), funktionstab (blå) og gain-of-function (rød) mutationer i forhold til WT UBE3A. Signifikansen blev bestemt ved hjælp af en en-prøve t-test (to-halet) med Benjamini-Hochberg multiple comparisons korrektion (FDR = 0,05). Rød, gevinst af funktion; Grå, ingen ændring fra WT UBE3A; Blå, funktionstab. Data genoptrykt med tilladelse fra Weston et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: UBE3A-varianter, der omfatter en bred vifte af funktionelle effekter. (A) BAR-analyseresultater af varianter ved position 588 i UBE3A, der viser både tabs- og gevinst af funktionssubstitutioner. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, En-prøve t-test (tohalet) med Benjamini-Hochberg multiple sammenligningskorrektion (FDR = 0,05). (B) Varmediagram, der viser normaliserede BAR-resultater til omfattende mutationsanalyse ved position 588 i UBE3A. Den hvide skygge repræsenterer WT UBE3A-aktivitetsniveauer, den blå skygge angiver tab af funktion, og den røde skygge angiver gevinst af funktion. Skalalinjen viser den procentvise ændring i forhold til WT UBE3A. N = 3 uafhængige eksperimenter for Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 for Q588E, n = 6 for Q588D, n = 5 for Q588R, n = 4 for Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. En-prøve t-test (to-halet) med Benjamini-Hochberg flere sammenligninger korrektion (FDR = 0,05). Data genoptrykt med tilladelse fra Weston et al.18. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Navn | Sekvens | Bruges til | |
| Primer 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI-sans | |
| Mut. Primer | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagenese antisense | |
| Primer 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisense | |
Tabel 1: Primere anvendt til UBE3A Q588E mutagenese.
| 1. runde PCR | |
| Reagens | Reaktion Mængde |
| 5x hi-fi-buffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 1 (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 2 (10 mM lager) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL bestand) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| High-fidelity DNA-polymerase | 1 μL |
| Samlet volumen | 50 μL |
| 2. runde PCR | |
| Reagens | Reaktion Mængde |
| 5x hi-fi-buffer | 10 μL |
| dNTP (10 mM lager) | 1 μL |
| Primer 3 (10 mM lager) | 1 μL |
| Renset PCR-produkt (Megaprimer) | 30 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL bestand) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| High-fidelity DNA-polymerase | 1 μL |
| Samlet volumen | 50 μL |
Tabel 2: PCR-parametre for mutagenese.
| 1. runde PCR | ||
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt |
| Indledende denaturering | 95 °C | 2 minutter |
| (1 cyklus) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30 s |
| Udglødning | 50 °C | 20 sek. |
| Forlængelse | 72 °C | 15 sek. |
| (30 cyklusser) | ||
| Endelig forlængelse | 72 °C | 1 minut |
| Holde | 4 °C | Uendelig |
| 2. runde PCR | ||
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt |
| Indledende denaturering | 95 °C | 2 minutter |
| (1 cyklus) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30 s |
| Udglødning | 50 °C | 20 sek. |
| Forlængelse | 72 °C | 35 sek. |
| (30 cyklusser) | ||
| Endelig forlængelse | 72 °C | 1 minut |
| Holde | 4 °C | Uendelig |
Tabel 3: PCR-programparametre for mutagenese.
| Reagens | Koncentration af arbejdet | 1x transfekt | 3.5x master mix |
| pGL3 BAR plasmid | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| pTK Renilla plasmid | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a plasmid | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM suppleret med glutamin | 8,65 μL | 30.275 μL | |
| Transfektion reagens | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabel 4: Transfektionsblandinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her giver en effektiv og skalerbar metode til at vurdere den enzymatiske aktivitet af Ube3a-varianter. Der er flere tekniske detaljer, der kræver nøje overvejelse, når du bruger dette assay. En overvejelse er valget af Wnt-reporterplasmider, der anvendes i dette assay. Den protokol, der er beskrevet her, bruger specifikt β-cateninaktiveret reporter (BAR)21, en reporter, der indeholder en sammenkædning af 12 T-cellefaktor (TCF) responselementer adskilt af specielt designede linkersekvenser for at minimere rekombination og tab af TCF-bindingssteder. Der er yderligere luciferase-baserede Wnt-reporterplasmider beskrevet i litteraturen23, og selvom tidligere undersøgelser tyder på, at nogle kan bruges til at vurdere UBE3A-aktivitet, er BAR-plasmidet blevet mest grundigt karakteriseret til dette formål17,18. For det andet er valget af Renilla luciferase plasmid kritisk. En plasmidkodning Renilla luciferase er inkluderet under transfektionstrin for at normalisere transfektionseffektiviteten. Plasmidet anvendt i denne protokol udtrykker konstitutivt Renilla luciferase under kontrol af en thymidinkinase (TK) promotor (TK-Renilla). Anvendelsen af plasmider indeholdende andre promotorer, såsom den meget anvendte cytomegalovirus (CMV) promotor, kan føre til variable resultater i Renilla luciferase-ekspression.
En anden overvejelse er cellernes opførsel afhængigt af typen og partiet af FBS, der anvendes til cellekultur. For eksempel kan FBS variere vækstraten for HEK293T-celler. Den nuværende protokol blev optimeret med celler, der udviser en typisk fordoblingstid på 18-24 timer, hvilket gør celletætheden på transfektionstidspunktet ca. ~ 4 × 104 celler pr. Brønd. Da celletæthed kan påvirke transfektionseffektiviteten, skal cellevæksthastighederne vurderes omhyggeligt af brugeren, og cellenumrene justeres i overensstemmelse hermed på platingstidspunktet. Derudover kræver det UBE3A-afhængige BAR-respons en vis mængde Wnt-ligand for at være til stede under eksperimentet. Under de fleste standardforhold er der nok Wnt i FBS til at drive dette svar; Dette svar kan dog også variere. Titreringen af plasmidforhold, der anvendes til transfektion, anbefales for at sikre, at BAR-responset måles inden for det passende lineære område. En alternativ tilgang er at stimulere Wnt-signalering ved hjælp af et rekombinant Wnt-ligand eller Wnt-suppleret vækstmedie17.
En fordel ved BAR-analysen er, at den kan rapportere ubiquitin ligaseaktiviteten af alle Ube3a isoformer. Mennesker udtrykker tre isoformer af Ube3a , der adskiller sig ved deres ekstreme N-termini på grund af brugen af alternative transkriptionelle startsteder24. BAR-analysen giver den samme udlæsningsanostiker til isoformer, og dette assay kan derfor bruges til at vurdere alle Ube3a-varianter . Derudover giver den storstilede karakterisering af Ube3a-varianter dybe strukturfunktionsdata, der kan afdække nye domæner og mekanismer, der er kritiske for enzymfunktionen. En tidligere undersøgelse udnyttede variantdata til at opdage et ubiquitinbindende domæne inden for UBE3A, der letter ubiquitinkædeforlængelse18. Yderligere strukturfunktionsundersøgelser vil sandsynligvis give ny indsigt i de biokemiske mekanismer i UBE3A, der kan udnyttes til terapeutisk udvikling.
Der er nogle begrænsninger for BAR-analysen, der berettiger til omhyggelig overvejelse, når man bestemmer patogeniciteten af en variant. På grund af den epigenetiske prægning af Ube3a i neuroner kan dette assay ikke diskriminere moderens og faderlige alleler, og yderligere genetiske beviser skal vejes sammen med funktionelle data for at bestemme patogeniciteten af en variant. Desuden skal yderligere variabler ud over ubiquitin ligaseaktiviteten af UBE3A overvejes i forbindelse med sygdom. For eksempel viste tidligere arbejde, at nuklear-lokaliseret UBE3A bidrager til Angelman syndrompatologi25 , og at nogle varianter forstyrrer dette lokaliseringsmønster af enzymet26. Således skal yderligere nedstrøms karakteriseringer udføres for at få en fuldstændig forståelse af bidraget fra Ube3a-varianter til neuroudviklingspatologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), en NARSAD Young Investigator Award fra Brain and Behavior Research Foundation (JJY), et forskningsstipendium fra Alfred P. Sloan Foundation (JJY) og forskningsbevillinger fra Angelman Syndrome Foundation (JJY), Whitehall Foundation (JJY) og NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
