Summary
यूबी 3 ए में मिससेंस वेरिएंट के कार्यात्मक महत्व का आकलन करने के लिए एक सरल और स्केलेबल विधि विकसित की गई थी, एक जीन जिसका नुकसान और कार्य का लाभ एंजेलमैन सिंड्रोम और ऑटिज़्म स्पेक्ट्रम विकार दोनों से जुड़ा हुआ है।
Abstract
चिकित्सा में अनुक्रमण के बढ़ते उपयोग ने मानव जीनोम में लाखों कोडिंग वेरिएंट की पहचान की है। इनमें से कई वेरिएंट न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों से जुड़े जीन में होते हैं, लेकिन वेरिएंट के विशाल बहुमत का कार्यात्मक महत्व अज्ञात रहता है। वर्तमान प्रोटोकॉल यूबी 3 ए के लिए वेरिएंट के अध्ययन का वर्णन करता है, एक जीन जो ऑटिज़्म और एंजेलमैन सिंड्रोम दोनों से जुड़े ई 3 यूबिकिटिन लिगेज को एन्कोड करता है। Ube3a का दोहराव या ट्राइप्लिकेशन ऑटिज़्म से दृढ़ता से जुड़ा हुआ है, जबकि इसका विलोपन एंजेलमैन सिंड्रोम का कारण बनता है। इस प्रकार, नैदानिक परिणामों के लिए यूबीई 3 ए प्रोटीन गतिविधि में परिवर्तन की वैधता को समझना महत्वपूर्ण है। यहां, एक तेजी से, सेल-आधारित विधि जो डब्ल्यूएनटी पाथवे रिपोर्टर के साथ यूबीई 3 ए वेरिएंट को जोड़ती है, का वर्णन किया गया है। यह सरल परख स्केलेबल है और इसका उपयोग किसी भी यूबीई 3 ए संस्करण में गतिविधि परिवर्तनों की वैलेंस और परिमाण को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की सुविधा संरचना-फ़ंक्शन जानकारी के धन की पीढ़ी की अनुमति देती है, जिसका उपयोग यूबीई 3 ए के एंजाइमेटिक तंत्र में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
हाल की तकनीकी प्रगति ने नैदानिक सेटिंग्स 1,2 में एक्सोम और जीनोम के अनुक्रमण को नियमित बना दिया है। इससे बड़ी संख्या में आनुवंशिक वेरिएंट की खोज हुई है, जिसमें लाखों गलत तरीके से वेरिएंट शामिल हैं जो आम तौर पर एक प्रोटीन में एक एमिनो एसिड को बदलते हैं। इन वेरिएंट के कार्यात्मक महत्व को समझना एक चुनौती बनी हुई है, और ज्ञात मिससेंस वेरिएंट के केवल एक छोटे से अंश (~ 2%) में नैदानिक व्याख्या 1,3 है।
इस समस्या का एक प्रमुख उदाहरण Ube3a है, एक जीन जो एक E3 यूबिकिटिन लिगेज को एन्कोड करता है जो गिरावट के लिए सब्सट्रेट प्रोटीनको लक्षित करता है। Ube3a क्रोमोसोम 15q11-13 के भीतर रहता है और विशेष रूप से मातृ विरासत वाले एलील 5,6,7 से व्यक्त किया जाता है। रोग आनुवंशिकी के अवलोकन दृढ़ता से सुझाव देते हैं कि यूबीई 3 ए एंजाइम की अपर्याप्त या अत्यधिक गतिविधि अलग-अलग न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों का कारण बनती है। मातृ क्रोमोसोम 15q11-13 का विलोपन एंजेलमैन सिंड्रोम (एएस) 8 का कारण बनता है, एक विकार जो गंभीर बौद्धिक विकलांगता, मोटर हानि, दौरे, लगातार मुस्कुराने के साथ एक खुश व्यवहार और डिस्मॉर्फिक चेहरे की विशेषताओं 8,9,10 की विशेषता है। इसके विपरीत, मातृ गुणसूत्र 15q11-13 का दोहराव या ट्रिप्लिकेशन Dup15q सिंड्रोम का कारण बनता है, एक विषम स्थिति जिसे ऑटिज़्म 11,12,13 के सबसे प्रचलित सिंड्रोमिक रूपों में से एक के रूप में मान्यता प्राप्त है। इसके अलावा, Ube3a में पहचाने गए सैकड़ों गलत समझ वाले वेरिएंट हैं, जिनमें से अधिकांश को अनिश्चित महत्व (वीयूएस) के वेरिएंट माना जाता है क्योंकि उनके कार्यात्मक और नैदानिक महत्व अज्ञात हैं। इस प्रकार, उन तरीकों को विकसित करने में काफी रुचि है जो अनुभवजन्य रूप से यूबीई 3 ए वेरिएंट का आकलन कर सकते हैं ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि वे न्यूरोडेवलपमेंटल बीमारी में योगदान करते हैं या नहीं।
यूबीई 3 ए एंजाइम ई 3 यूबिकिटिन लिगेस के एचईसीटी (ई 6-एपी सी-टर्मिनस के समरूप) डोमेन परिवार से संबंधित है, जिसमें सभी के पास नामांकित एचईसीटी डोमेन होता है, जिसमें ई 2 एंजाइमों से सक्रिय यूबिकिटिन को स्वीकार करने और इसे सब्सट्रेट प्रोटीन14 में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक जैव रासायनिक मशीनरी होती है। ऐतिहासिक रूप से, ई 3 एंजाइमों के लक्षण वर्णन ने पुनर्गठित इन विट्रो सिस्टम पर भरोसा किया है जिनके लिए शुद्ध प्रोटीन 4,15,16 की एक टुकड़ी की आवश्यकता होती है। इस तरह के तरीके धीमे और श्रम-गहन हैं और बड़ी संख्या में वेरिएंट की गतिविधि का आकलन करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। पिछले काम में, यूबीई 3 ए को एचईके 293 टी कोशिकाओं में डब्ल्यूएनटी मार्ग को सक्रिय करने के लिए β-कैटेनिन17 के क्षरण को धीमा करने के लिए प्रोटियासोम के कार्य को संशोधित करके पहचाना गया था। यह अंतर्दृष्टि डब्ल्यूएनटी पाथवे रिपोर्टर्स के उपयोग को एक कुशल और तेज़ विधि के रूप में Ube3a18 के हानि- और लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन वेरिएंट दोनों की पहचान करने की अनुमति देती है। नीचे दिया गया प्रोटोकॉल यूबी 3 ए वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए एक विधि के साथ-साथ यूबीई 3 ए वेरिएंट की गतिविधि में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक ल्यूसिफेरस-आधारित रिपोर्टर का विस्तार से वर्णन करता है।
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Protocol
1. यूबीई 3 ए वेरिएंट उत्पन्न करने के लिए म्यूटेनेसिस क्लोनिंग
- सभी यूबी 3 ए वेरिएंट को पीसीआईजी 2 प्लास्मिड (चित्रा 1 ए) में क्लोन करें, एक बिसिस्ट्रोनिक वेक्टर जिसमें ईजीएफपी अभिव्यक्ति19 के लिए चिकन-β-एक्टिन प्रमोटर और एक आंतरिक राइबोसोम एंट्री साइट (आईआरईएस) शामिल है। पूर्ण लंबाई वाले Ube3a निर्माणों में एक N-टर्मिनल Myc-टैग अनुक्रम होता है और इसे 5'SACI साइट और 3'XMAI साइट का उपयोग करके pCIG2 में क्लोन किया जाता है। इसके अलावा, Ube3a कोडिंग अनुक्रम के भीतर स्वाभाविक रूप से होने वाली EcoRI, EcoRV और PSTI साइटों का उपयोग टुकड़ों को उपक्लोन करने के लिए भी किया जाता है।
नोट: Ube3a के लिए डी-आइडेंटिफाइड वेरिएंट साहित्य के माध्यम से और सार्वजनिक रूप से सुलभ रिपॉजिटरी जैसे क्लिनवर डेटाबेस1 में प्राप्त किए जा सकते हैं। अतिरिक्त असूचित वेरिएंट चिकित्सा केंद्रों के साथ व्यक्तिगत संचार के माध्यम से प्राप्त किए जा सकते हैं। - Ube3a रीडिंग फ्रेम में उत्परिवर्तन पेश करने के लिए एक अनुकूलित दो-चरण मेगाप्राइमर म्यूटेनेसिस विधि20 का उपयोग करें। पहले चरण में, म्यूटाजेनिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड को डिजाइन करें जिसमें वांछित उत्परिवर्तन होता है (इस प्रोटोकॉल में दिखाया गया उदाहरण एक UBE3A Q588E संस्करण उत्पन्न करना है) उत्परिवर्तन के लिए होमोलॉजी 5 ' और 3 ′ के कम से कम 30 बेस जोड़े (बीपी) से घिरा हुआ है (चित्रा 1 बी और तालिका 1)।
- उत्परिवर्तन युक्त 200-400 बीपी मेगाप्राइमर उत्पन्न करने के लिए पहले राउंड पीसीआर के लिए पूरक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड के साथ म्यूटाजेनिक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करें (चित्रा 1 सी; चित्र 1 सी) तालिका 2 और तालिका 3)। 1% जेल और बाद में जेल शुद्धिकरण (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा के पूरे 50 μL का उपयोग करें। नीचे दिए गए दूसरे दौर के पीसीआर चरण में उपयोग के लिए 30 μL विआयनीकृत H2O (diH2O) में पीसीआर उत्पाद का उपयोग करें।
- संकेत के अनुसार दूसरे दौर पीसीआर सेट करें (चित्रा 1 सी; तालिका 2 और तालिका 3)। यह चरण बड़े डीएनए टुकड़े (आमतौर पर ~ 1-1.5 केबी लंबाई में) उत्पन्न करेगा जिसमें उप-क्लोनिंग के लिए उपयुक्त उत्परिवर्तन और टर्मिनल प्रतिबंध साइटें शामिल हैं (चित्रा 1 सी)।
- पीसीआर प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, पीसीआर शुद्धिकरण किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके परिणामी उत्पाद को शुद्ध करें। 30 μL में एल्यूट करें और सभी शुद्ध उत्पाद और pCIG2 Ube3a WT निर्माण को उचित प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पचाएं (उदाहरण EcoRI और XMAI के साथ पाचन दिखाता है)।
- 37 डिग्री सेल्सियस पर पाचन के 2 घंटे के बाद, अगारोस जेल वैद्युतकणसंचलन (1% जेल) के माध्यम से पाचन उत्पादों को हल करें, और उचित उत्पादों को जेल-शुद्ध करें। निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका) के अनुसार लिगेशन सेट करें, बंधाव उत्पादों को डीएच 10 बी बैक्टीरियल स्ट्रेन (सामग्री की तालिका) में बदलें, और फिर एम्पीसिलीन (100 μg / mL) चयन के साथ प्लेट करें।
- अगले दिन, लुरिया शोरबा (एलबी) और 100 μg / mL एम्पीसिलीन युक्त 3 एमएल संस्कृतियों को टीका लगाने के लिए दो से चार कॉलोनियों का चयन करें। संस्कृतियों को एक कक्षीय इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर हिलाने (225 आरपीएम) के साथ बढ़ने दें।
- अगले दिन, प्लास्मिड डीएनए (सामग्री की तालिका) को छोटा करने के लिए बैक्टीरिया संस्कृति के 1-1.5 एमएल का उपयोग करें। शेष संस्कृति को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखकर बचाएं। एक ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण द्वारा मिनीप्रेप्ड प्लास्मिड को स्क्रीन करें जो वांछित उत्परिवर्तन से ~ 200 बीपी को बांधता है।
- सही प्लास्मिड (सामग्री की तालिका) को मिडिप करने के लिए 50 एमएल संस्कृतियों को फिर से टीका लगाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सहेजी गई जीवाणु संस्कृतियों का उपयोग करें। डीएनए के सही अनुक्रम को मान्य करने के लिए Ube3a कोडिंग अनुक्रम को पूरी तरह से अनुक्रमित करें।
- यूबीई 3 ए वेरिएंट प्लास्मिड के कामकाजी स्टॉक बनाएं, साथ ही β-कैटेनिन एक्टिवेटेड रिपोर्टर (बीएआर)21, टीके-रेनिला लूसिफेरस, लिगेज-डेड यूबीई 3 ए (यूबीई 3 ए सी 820 ए म्यूटेशन), और बाद के अभिकर्मक चरणों के लिए बाँझ एच2ओ का उपयोग करके 100 एनजी /
2. मानव भ्रूण किडनी 293 टी (एचईके 293 टी) कोशिकाओं की तैयारी और अभिकर्मक
- डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) में उगाए गए एचईके 293 टी कोशिकाओं में ग्लूटामाइन, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक एजेंट के साथ पूर्व-पूरक किया गया है, जैसा कि पहलेवर्णित है। कोशिकाओं को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ, ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में उगाएं।
- बायोसेफ्टी कैबिनेट का उपयोग करते हुए, पहले निलंबित एचईके 293 टी कोशिकाओं को ऊतक संस्कृति-उपचारित 96-अच्छी तरह से फ्लैट-बॉटम प्लेटों पर 2.2 × 104 कोशिकाओं के घनत्व पर 100 μL कल्चर मीडिया में चढ़ाएं और उन्हें रातोंरात बढ़ने की अनुमति दें।
- दूसरे दिन, कोशिकाओं को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में जुगनू और रेनिला लूसिफेरस रिपोर्टर प्लास्मिड (तालिका 4) और यूबे 3 ए प्लास्मिड के साथ तीन प्रतियों में स्थानांतरित करें। प्लास्मिड के 10: 1: 8 अनुपात (बीएआर के 50 एनजी, टीके-रेनिला के 5 एनजी, और यूबी 3 ए प्लास्मिड के 40 एनजी प्रति कुएं) का उपयोग करके प्रति कुएं कुल मात्रा के 10 μL में अभिकर्मक का प्रदर्शन करें, जैसा कि पहले वर्णित18, और 0.4 μL अभिकर्मक (तालिका 4)।
नोट: प्रत्येक प्रयोग के लिए, एक खाली वेक्टर (केवल जीएफपी) और एक प्लास्मिड एन्कोडिंग लिगेज-डेड यूबी 3 ए को भी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए स्थानांतरित किया जाता है। - 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब (तालिका 4) में प्रत्येक संस्करण के लिए अभिकर्मकों के लिए एक मास्टर मिश्रण बनाएं और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ट्यूब को टैप करके अभिकर्मक मिश्रण को धीरे से उत्तेजित करें, और फिर कुओं में मौजूदा विकास मीडिया में सीधे अभिकर्मक मिश्रण का 10 μL जोड़ें।
- बाद में, कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें और प्लास्मिड को 48 घंटे के लिए व्यक्त करने की अनुमति दें। विकास मीडिया का प्रतिस्थापन आवश्यक नहीं है।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीएफपी प्रतिदीप्ति द्वारा अभिकर्मक दक्षता की निगरानी करें। एचईके 293 टी कोशिकाओं को इस विधि द्वारा कुशलतापूर्वक स्थानांतरित किया जाता है, और >80% कोशिकाओं को 48 घंटे के बाद जीएफपी व्यक्त करना चाहिए।
3. लूसिफेरस गतिविधि का माप
नोट: लुसिफेरस गतिविधि का मूल्यांकन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है जो निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार जुगनू और रेनिला लूसिफेरस (सामग्री की तालिका) दोनों को परखता है।
- सावधानी से ट्रांसक्रिप्टेड एचईके 293 टी कोशिकाओं से संस्कृति मीडिया को एस्पिरेट करें, और फिर ठंडे फॉस्फेट-बफर ्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोएं। पीबीएस को एस्पिरेट करें और 25 μL गैर-विकृत लाइसिस बफर जोड़कर कोशिकाओं को लाइस करें और बर्फ पर कोमल रॉकिंग के साथ 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- इसके बाद, परिणामी लाइसेट के 20 μL (कोई सेंट्रीफ्यूजेशन आवश्यक नहीं है) को एक नई 96-वेल परख प्लेट में जोड़ें जिसमें जुगनू ल्यूसिफेरस सब्सट्रेट अभिकर्मक का 100 μL होता है। प्लेट को टैप करके धीरे से मिलाएं।
- प्लेट को प्लेट रीडर पर लोड करें और 1 मिमी की पढ़ने की ऊंचाई और 1 सेकंड के एकीकरण समय के साथ एक शीर्ष डिटेक्टर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस को मापें।
नोट: डिटेक्टर के लाभ को सिग्नल की ताकत के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। - जुगनू लूसिफेरस ल्यूमिनेसेंस को पढ़ने के तुरंत बाद, कुओं में रेनिला ल्यूसिफेरस सब्सट्रेट के 100 μL जोड़ें। यह कदम रेनिला ल्यूसिफेरस गतिविधि का आकलन करते समय जुगनू लूसिफेरस गतिविधि को एक साथ बुझाता है। प्लेट के कोमल आंदोलन द्वारा नमूनों को मिलाएं और रेनिला ल्यूसिफेरस गतिविधि का आकलन करने के लिए फिर से ल्यूमिनेसेंस को मापें।
नोट: जबकि इस परख के लिए अन्य प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है, काले फ्रेम और सफेद कुओं वाली प्लेटों का उपयोग सबसे संवेदनशील परिणाम प्रदान करेगा क्योंकि यह शोर को कम करते हुए ल्यूसिफेरस सिग्नल को बढ़ाता है। - रिपोर्टर प्रतिक्रियाओं को रेनिला ल्यूसिफेरस अनुपात (जुगनू / रेनिला) के लिए जुगनू लूसिफेरस के रूप में निर्धारित करें, और तीन प्रतियों के माप के मूल्यों का औसत निकालें। इसके बाद, वेरिएंट प्रोटीन की सापेक्ष गतिविधि की तुलना करने के लिए वाइल्ड-टाइप (डब्ल्यूटी) यूबीई 3 ए व्यक्त करने वाली कोशिकाओं के मूल्यों के खिलाफ प्रत्येक संस्करण के लिए जुगनू / रेनिला मान को सामान्य करें।
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Representative Results
Ube3a मिससेंस वेरिएंट की बड़े पैमाने पर कार्यात्मक स्क्रीनिंग हानि- और लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन म्यूटेशन के व्यापक परिदृश्य की पहचान करती है
Ube3a उत्परिवर्ती के साथ पिछले काम ने सुझाव दिया कि WNT प्रतिक्रिया सेलुलर UBE3A प्रोटीन गतिविधि के रिपोर्टर के रूप में काम कर सकती है। इन टिप्पणियों का विस्तार किया गया था, और यह जांचने के लिए अतिरिक्त सत्यापन प्रयोग किए गए थे कि क्या बीएआर परख सेल में यूबीई 3 ए गतिविधियों की एक श्रृंखला की रिपोर्ट करने के लिए उपयुक्त है। सबसे पहले, एचईके 293 टी कोशिकाओं को मानव डब्ल्यूटी यूबी 3 ए को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड डीएनए की अलग-अलग मात्रा के साथ स्थानांतरित किया गया था। इस प्रयोग से पता चला कि बीएआर प्रतिक्रिया कोशिकाओं में स्थानांतरित Ube3a की मात्रा के साथ रैखिक रूप से बदलती है (चित्रा 2 ए)। दूसरे, बीएआर परख का परीक्षण प्लास्मिड डीएनए एन्कोडिंग रोग से जुड़े वेरिएंट का उपयोग करके किया गया था जो पहले साहित्य22 में विशेषता थी। इनमें सौम्य वेरिएंट (आर 3 9 एच और ए 178 टी), एक ऑटिज़्म-लिंक्ड गेन-ऑफ-फंक्शन वेरिएंट (टी 458 ए), और पुष्टि किए गए एंजेलमैन सिंड्रोम से जुड़े वेरिएंट का एक संग्रह था जो विभिन्नतंत्रों के माध्यम से यूबीई 3 ए फ़ंक्शन के नुकसान का कारण बनता है। बीएआर परख ने प्रत्येक संस्करण (चित्रा 2 बी) की सही पहचान की, जिसमें सभी हानि-ऑफ-फ़ंक्शन वेरिएंट शामिल हैं, जो इस विधि18 की सटीकता और व्यापकता का प्रदर्शन करते हैं।
बीएआर परख का उपयोग 152 मिससेंस वेरिएंट को स्क्रीन करने के लिए किया गया था, जिनमें से अधिकांश को क्लिनवर डेटाबेस से पहचाना गया था। यूबीई 3 ए-निर्भर विकारों में कॉपी संख्या भिन्नताओं के बारे में आनुवंशिक साक्ष्य के समान, मिससेंस वेरिएंट का कार्यात्मक प्रभाव व्यापक था और इसमें सौम्य वेरिएंट के साथ-साथ लॉस-ऑफ-फंक्शन और गेन-ऑफ-फंक्शन वेरिएंट (चित्रा 3)18 शामिल थे। विशेष रुचि के, इस पद्धति का उपयोग करके पहचाने गए गेन-ऑफ-फंक्शन वेरिएंट सभी नए थे, और बाद के सत्यापन ने दृढ़ता से सुझाव दिया कि वे क्लासिक एंजेलमैन सिंड्रोम18 से भिन्न फेनोटाइप के साथ यूबीई 3 ए-निर्भर विकारों के एक उप-वर्ग को परिभाषित करते हैं।
मिससेंस वेरिएंट का प्रभाव अक्सर अप्रत्याशित होता है, जो कार्यात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता को रेखांकित करता है
यूबीई 3 ए वेरिएंट की कार्यात्मक स्क्रीनिंग से एक दिलचस्प अवलोकन यह है कि कुछ एमिनो एसिड स्थितियों में परिवर्तन काफी अलग प्रभाव पैदा करते हैं, जिससे अनुभवजन्य संस्करण मूल्यांकन18 के महत्व को रेखांकित किया जाता है। उदाहरण के लिए, तीन व्यक्तियों को UBE3A में ग्लूटामाइन 588 (Q588) स्थिति में वेरिएंट के साथ पहचाना गया था जिसमें एक गेन-ऑफ-फंक्शन ग्लूटामेट प्रतिस्थापन (Q588E), एक लॉस-ऑफ-फंक्शन आर्गिनिन प्रतिस्थापन (Q588R), और एक अन्य लॉस-ऑफ-फंक्शन प्रोलाइन प्रतिस्थापन (Q588P; चित्र 4 ए)। Q588 स्थिति को हर संभव अमीनो एसिड में उत्परिवर्तित करने के लिए एक व्यापक उत्परिवर्तन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। जब इन वेरिएंट की गतिविधि को बीएआर परख का उपयोग करके मापा गया था, तो यह दिखाया गया कि 588 स्थिति में कोई भी नकारात्मक चार्ज एमिनो एसिड एक अति सक्रिय एंजाइम (चित्रा 4 बी) का उत्पादन करता है। इस अंतर्दृष्टि ने महत्वपूर्ण कार्यात्मक सुराग प्रदान किए जिसने यूबीई 3 ए के एचईसीटी डोमेन के भीतर एक नई साइट की खोज की अनुमति दी जो यूबिकिटिन श्रृंखला बढ़ाव18 की सुविधा प्रदान करता है।
चित्र 1: Ube3a का पीसीआर-निर्भर म्यूटेनेसिस(A) Ube3a अभिव्यक्ति वेक्टर का प्रतिनिधित्व जो प्रासंगिक प्रतिबंध साइटों को दर्शाता है। (बी) डीएनए अनुक्रम एन्कोडिंग यूबीई 3 ए शीर्ष पर दिखाया गया है। Q588 कोडन बोल्ड लेटरिंग द्वारा इंगित किया गया है। Q588E म्यूटेनेसिस प्राइमर (Mut. primer) को UBE3A अनुक्रम के साथ संरेखित दिखाया गया है। लाल अक्षर उत्परिवर्तन साइट को इंगित करता है। (सी) मेगाप्राइमर उत्पन्न करने के लिए पीसीआर का एक योजनाबद्ध और क्यू 588 ई टुकड़े को उपक्लोन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनए टुकड़े को दिखाया गया है। Q588E उत्परिवर्तन की स्थिति लाल तारांकन चिह्न द्वारा इंगित की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: UBE3A यूबिकिटिन लिगेज गतिविधि के रिपोर्टर के रूप में BAR परख का सत्यापन। (A) HEK293T कोशिकाएं प्लास्मिड एन्कोडिंग WT UBE3A की बढ़ती मात्रा के साथ स्थानांतरित होती हैं जो BAR प्रतिक्रिया में रैखिक वृद्धि दिखाती हैं। रेनिला लूसिफेरस अनुपात के लिए मानक त्रुटि (एसई) ± माध्य मान दिखाए गए हैं। एन = 3 स्वतंत्र प्रयोग। (बी) पहले विशेषता वाले यूबीई 3 ए वेरिएंट का परीक्षण बीएआर परख में किया गया था। प्रतिक्रियाओं को डब्ल्यूटी यूबीई 3 ए के लिए सामान्यीकृत किया गया था, और मूल्यों को एसई के औसत ± रूप में दिखाया गया है। बेंजामिनी-होचबर्ग एकाधिक तुलना सुधार (एफडीआर = 0.05) के साथ एक-नमूना टी-टेस्ट (दो पूंछ वाले) का उपयोग करके गणना किए गए प्रयोगों (एन) और पी-मानों की संख्या इस प्रकार है: जीएफपी, एन = 19, ***पी = 1.733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1.519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0.567; A178T, n = 4, p = 0.828; T485A, n = 5, *p = 0.019; C21Y, n = 3, ***p = 8.725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3.419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0.0072; E269G, n = 3, **p = 7.787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0.0052; S349P, n = 3, **p = 0.0016; L502P, n = 3, **p = 0.0033; R506C, n = 3, **p = 0.0033; T106K, n = 6, **p = 0.0.0078; T106P, n = 3, **p = 0.0013; I130T, n = 6, *p = 0.016; R477P, n = 3, ***p = 4.24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3.39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5.82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1.22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0.0013 वेस्टन एट अल.18 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: यूबीई 3 ए वेरिएंट कार्यात्मक प्रभावों की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करता है। डब्ल्यूटी यूबीई 3 ए के सापेक्ष सौम्य (ग्रे), लॉस-ऑफ-फंक्शन (नीला), और गेन-ऑफ-फंक्शन (लाल) उत्परिवर्तन दिखाने वाले 152 यूबीई 3 ए वेरिएंट की बीएआर परख स्क्रीन। बेंजामिनी-होचबर्ग एकाधिक तुलना सुधार (एफडीआर = 0.05) के साथ एक-नमूना टी-टेस्ट (दो पूंछ वाले) का उपयोग करके महत्व निर्धारित किया गया था। लाल, लाभ-कार्य; ग्रे, डब्ल्यूटी यूबीई 3 ए से कोई बदलाव नहीं; नीला, फ़ंक्शन का नुकसान। वेस्टन एट अल.18 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: UBE3A वेरिएंट जिसमें कार्यात्मक प्रभावों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। (A) UBE3A के स्थान 588 पर वेरिएंट के BAR परख परिणाम हानि और लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन प्रतिस्थापन दोनों दिखाते हैं। Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; पी < 0.0005, बेंजामिनी-होचबर्ग मल्टीपल तुलना सुधार (एफडीआर = 0.05) के साथ एक-नमूना टी-टेस्ट (दो पूंछ वाला)। (ख) यूबीई3ए में स्थिति 588 पर व्यापक उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए सामान्यीकृत बीएआर परिणाम दर्शाने वाला ताप प्लॉट। सफेद छायांकन डब्ल्यूटी यूबीई 3 ए गतिविधि स्तरों का प्रतिनिधित्व करता है, नीला छायांकन फ़ंक्शन के नुकसान को इंगित करता है, और लाल छायांकन लाभ-ऑफ-फ़ंक्शन को इंगित करता है। स्केल बार डब्ल्यूटी यूबीई 3 ए के सापेक्ष प्रतिशत परिवर्तन दिखाता है। Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C के लिए N = 3 स्वतंत्र प्रयोग; Q588E के लिए n = 8, Q588D के लिए n = 6, Q588R के लिए n = 5, Q588H के लिए n = 4, *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005। बेंजामिनी-होचबर्ग एकाधिक तुलना सुधार (एफडीआर = 0.05) के साथ एक-नमूना टी-टेस्ट (दो पूंछ वाला)। वेस्टन एट अल.18 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| नाम | अनुक्रम | के लिए उपयोग किया जाता है | |
| प्राइमर 1 | GATTATTATGACAATAAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI भावना | |
| मूल प्राइमर | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAGAAGAGATGATAACC |
UBE3A Q588E म्यूटेनेसिस एंटीसेंस | |
| प्राइमर 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XMAI एंटीसेंस | |
तालिका 1: यूबीई 3 ए क्यू 588 ई म्यूटेनेसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर।
| पहले राउंड पीसीआर | |
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अभिक्रिया मात्रा |
| 5x उच्च निष्ठा बफर | 10 μL |
| dNTP (10 mM स्टॉक) | 1 μL |
| प्राइमर 1 (10 mM स्टॉक) | 1 μL |
| प्राइमर 2 (10 mM स्टॉक) | 1 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL स्टॉक) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ | 1 μL |
| कुल मात्रा | 50 μL |
| दूसरा राउंड पीसीआर | |
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | अभिक्रिया मात्रा |
| 5x उच्च निष्ठा बफर | 10 μL |
| dNTP (10 mM स्टॉक) | 1 μL |
| प्राइमर 3 (10 mM स्टॉक) | 1 μL |
| शुद्ध पीसीआर उत्पाद (मेगाप्राइमर) | 30 μL |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL स्टॉक) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ | 1 μL |
| कुल मात्रा | 50 μL |
तालिका 2: म्यूटेनेसिस के लिए पीसीआर पैरामीटर।
| पहले राउंड पीसीआर | ||
| क़दम | तापमान | समय |
| प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 °C | 2 मिनट |
| (1 चक्र) | ||
| विकृतीकरण | 95 °C | 30 s |
| एनीलिंग | 50 °C | 20 s |
| विस्तार | 72 °C | 15 s |
| (30 चक्र) | ||
| अंतिम विस्तार | 72 °C | 1 मिनट |
| पकड | 4 °C | अनंत |
| दूसरा राउंड पीसीआर | ||
| क़दम | तापमान | समय |
| प्रारंभिक विकृतीकरण | 95 °C | 2 मिनट |
| (1 चक्र) | ||
| विकृतीकरण | 95 °C | 30 s |
| एनीलिंग | 50 °C | 20 s |
| विस्तार | 72 °C | 35 s |
| (30 चक्र) | ||
| अंतिम विस्तार | 72 °C | 1 मिनट |
| पकड | 4 °C | अनंत |
तालिका 3: म्यूटेनेसिस के लिए पीसीआर प्रोग्राम पैरामीटर।
| अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) | काम करने की एकाग्रता | 1x अभिकर्मक | 3.5x मास्टर मिश्रण |
| पीजीएल 3 बार प्लास्मिड | 100 ng/μL | 0.5 μL | 1.75 μL |
| पीटीके रेनिला प्लास्मिड | 100 ng/μL | 0.05 μL | 0.175 μL |
| Ube3a प्लास्मिड | 100 ng/μL | 0.4 μL | 1.4 μL |
| डीएमईएम ग्लूटामाइन के साथ पूरक | 8.65 μL | 30.275 μL | |
| अभिकर्मक अभिकर्मक | 0.4 μL | 1.4 μL |
तालिका 4: अभिकर्मक मिश्रण।
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Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल यूबीई 3 ए वेरिएंट की एंजाइमेटिक गतिविधि का आकलन करने के लिए एक कुशल और स्केलेबल विधि प्रदान करता है। कई तकनीकी विवरण हैं जो इस परख का उपयोग करते समय सावधानीपूर्वक विचार करने की आवश्यकता है। एक विचार इस परख में उपयोग किए जाने वाले डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर प्लास्मिड की पसंद है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विशेष रूप से β-कैटेनिन एक्टिवेटेड रिपोर्टर (बीएआर) 21 का उपयोग करता है, एक रिपोर्टर जिसमें टीसीएफ-बाइंडिंग साइटों के पुनर्संयोजन और हानि को कम करने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए लिंकर अनुक्रमों द्वारा अलग किए गए 12 टी-सेल फैक्टर (टीसीएफ) प्रतिक्रिया तत्वों का एक संयोजन होता है। साहित्य23 में वर्णित अतिरिक्त लूसिफेरस-आधारित डब्ल्यूएनटी रिपोर्टर प्लास्मिड हैं, और हालांकि पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि कुछ का उपयोग यूबीई 3 ए गतिविधि का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, बीएआर प्लास्मिड को इस उद्देश्य के लिए सबसे अच्छी तरह से विशेषता दी गई है। दूसरे, रेनिला ल्यूसिफेरस प्लास्मिड का विकल्प महत्वपूर्ण है। अभिकर्मक दक्षता को सामान्य करने के लिए अभिकर्मक चरण के दौरान एक प्लास्मिड एन्कोडिंग रेनिला लूसिफेरस को शामिल किया जाता है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्लास्मिड संवैधानिक रूप से थाइमिडाइन काइनेज (टीके) प्रमोटर (टीके-रेनिला) के नियंत्रण में रेनिला लूसिफेरस को व्यक्त करता है। अन्य प्रमोटरों वाले प्लास्मिड का उपयोग, जैसे कि व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) प्रमोटर, रेनिला ल्यूसिफेरस अभिव्यक्ति में परिवर्तनीय परिणाम पैदा कर सकते हैं।
एक दूसरा विचार सेल संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले एफबीएस के प्रकार और बहुत कुछ के आधार पर कोशिकाओं का व्यवहार है। उदाहरण के लिए, एफबीएस एचईके 293 टी कोशिकाओं की वृद्धि दर को प्रभावित कर सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को 18-24 घंटे के विशिष्ट दोहरीकरण समय का प्रदर्शन करने वाली कोशिकाओं के साथ अनुकूलित किया गया था, जिससे अभिकर्मक के समय सेल घनत्व लगभग ~ 4 × 104 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से हो जाती हैं। चूंकि सेल घनत्व अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित कर सकता है, सेल विकास दर को उपयोगकर्ता द्वारा सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाना चाहिए और प्लेटिंग के समय तदनुसार समायोजित सेल संख्या। इसके अतिरिक्त, यूबीई 3 ए-निर्भर बीएआर प्रतिक्रिया को प्रयोग के दौरान मौजूद होने के लिए डब्ल्यूएनटी लिगैंड की कुछ मात्रा की आवश्यकता होती है। अधिकांश मानक स्थितियों में, इस प्रतिक्रिया को चलाने के लिए एफबीएस में पर्याप्त डब्ल्यूएनटी है; हालाँकि, यह प्रतिक्रिया भी भिन्न हो सकती है। अभिकर्मक के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड अनुपात के अनुमापन की सिफारिश यह सुनिश्चित करने के लिए की जाती है कि बीएआर प्रतिक्रिया को उचित रैखिक सीमा के भीतर मापा जाता है। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक पुनः संयोजक डब्ल्यूएनटी लिगैंड या डब्ल्यूएनटी-पूरक विकास मीडिया17 का उपयोग करके डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग को प्रोत्साहित करना है।
बीएआर परख का एक लाभ यह है कि यह सभी यूबीई 3 ए आइसोफॉर्म की यूबिकिटिन लिगेज गतिविधि की रिपोर्ट कर सकता है। मनुष्य यूबीई 3 ए के तीन आइसोफॉर्म व्यक्त करते हैं जो वैकल्पिक ट्रांसक्रिप्शनल स्टार्टसाइटों 24 के उपयोग के कारण अपने चरम एन-टर्मिनी पर भिन्न होते हैं। बीएआर परख आइसोफॉर्म के लिए एक ही रीडआउट अज्ञेय प्रदान करता है, और इस प्रकार, इस परख का उपयोग सभी यूबीई 3 ए वेरिएंट का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, Ube3a वेरिएंट के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन गहरी संरचना-फ़ंक्शन डेटा प्रदान करता है जो एंजाइम फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण नए डोमेन और तंत्र को उजागर कर सकता है। एक पिछले अध्ययन ने यूबीई 3 ए के भीतर एक यूबिकिटिन-बाइंडिंग डोमेन की खोज के लिए वेरिएंट डेटा का उपयोग किया जो यूबिकिटिन श्रृंखला बढ़ाव18 की सुविधा प्रदान करता है। अतिरिक्त संरचना-फ़ंक्शन अध्ययन संभवतः यूबीई 3 ए के जैव रासायनिक तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे जो चिकित्सीय विकास के लिए लाभ उठाया जा सकता है।
बीएआर परख की कुछ सीमाएं हैं जो एक संस्करण की रोगजनकता का निर्धारण करते समय सावधानीपूर्वक विचार करती हैं। न्यूरॉन्स में यूबीई 3 ए के एपिजेनेटिक छाप के कारण, यह परख मातृ और पैतृक एलील्स को भेदभाव नहीं कर सकती है, और एक संस्करण की रोगजनकता निर्धारित करने के लिए कार्यात्मक डेटा के साथ अतिरिक्त आनुवंशिक साक्ष्य को तौला जाना चाहिए। इसके अलावा, यूबीई 3 ए की यूबिकिटिन लिगेज गतिविधि से परे अतिरिक्त चर को बीमारी के संदर्भ में माना जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, पिछले काम से पता चला है कि परमाणु-स्थानीयकृत यूबीई 3 ए एंजेलमैन सिंड्रोम पैथोलॉजी25 में योगदान देता है और कुछ वेरिएंट एंजाइम26 के इस स्थानीयकरण पैटर्न को परेशान करते हैं। इस प्रकार, न्यूरोडेवलपमेंटल पैथोलॉजी के लिए यूबीई 3 ए वेरिएंट के योगदान की पूरी समझ हासिल करने के लिए अतिरिक्त डाउनस्ट्रीम लक्षण वर्णन किया जाना चाहिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को सिमन्स फाउंडेशन ब्रिज टू इंडिपेंडेंस अवार्ड (एसएफएआरआई पुरस्कार # 387972 द्वारा समर्थित किया गया था; जे.जे.वाई., मस्तिष्क और व्यवहार अनुसंधान फाउंडेशन (जे.जे.वाई.) से एनएआरएसएडी युवा अन्वेषक पुरस्कार, अल्फ्रेड पी स्लोन फाउंडेशन (जे.जे.वाई.) से एक शोध फैलोशिप, और एंजेलमैन सिंड्रोम फाउंडेशन (जे.जे.वाई.), व्हाइटहॉल फाउंडेशन (जे.जे.वाई.), और एनआईएमएच (आर01एमएच 122786) से अनुसंधान अनुदान; जे.जे.वाई.)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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