Summary
En enkel og skalerbar metode ble utviklet for å vurdere den funksjonelle betydningen av missense-varianter i Ube3a, et gen hvis tap og gevinst av funksjon er knyttet til både Angelman syndrom og autismespektrumforstyrrelse.
Abstract
Den økte bruken av sekvensering i medisin har identifisert millioner av kodende varianter i det menneskelige genomet. Mange av disse variantene forekommer i gener assosiert med nevroutviklingsforstyrrelser, men den funksjonelle betydningen av de aller fleste varianter er fortsatt ukjent. Den nåværende protokollen beskriver studiet av varianter for Ube3a, et gen som koder for en E3 ubiquitin ligase knyttet til både autisme og Angelman syndrom. Duplisering eller triplikasjon av Ube3a er sterkt knyttet til autisme, mens slettingen forårsaker Angelman syndrom. Forståelse av valensen av endringer i UBE3A proteinaktivitet er derfor viktig for kliniske utfall. Her beskrives en rask, cellebasert metode som parrer Ube3a-varianter med en Wnt-banereporter. Denne enkle analysen er skalerbar og kan brukes til å bestemme valensen og størrelsen på aktivitetsendringer i en hvilken som helst Ube3a-variant . Videre tillater anlegget av denne metoden generering av et vell av strukturfunksjonsinformasjon, som kan brukes til å få dyp innsikt i de enzymatiske mekanismene til UBE3A.
Introduction
Nylige teknologiske fremskritt har gjort sekvensering av eksomer og genomer rutine i kliniske omgivelser 1,2. Dette har ført til oppdagelsen av et stort antall genetiske varianter, inkludert millioner av missense-varianter som vanligvis endrer en aminosyre i et protein. Å forstå den funksjonelle betydningen av disse variantene er fortsatt en utfordring, og bare en liten brøkdel (~ 2%) av de kjente missense-variantene har en klinisk tolkning 1,3.
Et fremtredende eksempel på dette problemet er Ube3a, et gen som koder for en E3 ubiquitin ligase som retter seg mot substratproteiner for nedbrytning4. Ube3a ligger innenfor kromosom 15q11-13 og uttrykkes utelukkende fra det maternelle arvelige allelet 5,6,7. Observasjoner fra sykdomsgenetikk tyder sterkt på at utilstrekkelig eller overdreven aktivitet av UBE3A-enzymet forårsaker distinkte nevroutviklingsforstyrrelser. Sletting av mors kromosom 15q11-13 forårsaker Angelman syndrom (AS)8, en lidelse preget av alvorlig intellektuell funksjonshemming, motoriske funksjonsnedsettelser, anfall, en lykkelig oppførsel med hyppig smilende og dysmorfe ansiktsegenskaper 8,9,10. I motsetning til dette forårsaker duplisering eller triplikasjon av mors kromosom 15q11-13 Dup15q syndrom, en heterogen tilstand anerkjent som en av de mest utbredte syndromiske former for autisme11,12,13. I tillegg er det identifisert hundrevis av missense-varianter i Ube3a, hvorav de fleste anses som varianter av usikker betydning (VUS) da deres funksjonelle og kliniske signifikans er ukjente. Det er derfor stor interesse for å utvikle metoder som empirisk kan vurdere Ube3a-varianter for å avgjøre om de bidrar til nevroutviklingssykdom.
UBE3A-enzymet tilhører HECT-domenefamilien (homolog til E6-AP C-terminus) av E3 ubiquitin-ligaser som alle har det eponymiske HECT-domenet, som inneholder det biokjemiske maskineriet som er nødvendig for å akseptere aktivert ubiquitin fra E2-enzymer og overføre det til substratproteiner14. Historisk har karakteriseringen av E3-enzymer vært avhengig av rekonstituerte in vitro-systemer som krever et ensemble av rensede proteiner 4,15,16. Slike metoder er langsomme og arbeidsintensive og ikke egnet til å vurdere aktiviteten til et stort antall varianter. I tidligere arbeid ble UBE3A identifisert for å aktivere Wnt-banen i HEK293T-celler ved å modulere proteasomets funksjon for å bremse nedbrytningen av β-catenin17. Denne innsikten gjør det mulig å bruke Wnt-banereportere som en effektiv og rask metode for å identifisere både taps- og gevinst-av-funksjon-varianter av Ube3a18. Protokollen nedenfor beskriver i detalj en metode for å generere Ube3a-varianter, samt en luciferase-basert reporter for å vurdere endringer i aktiviteten til Ube3a-varianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mutagenesekloning for å generere Ube3a-varianter
- Klon alle Ube3a-varianter inn i pCIG2-plasmidet (figur 1A), en bicistronisk vektor som inneholder en kylling-β-aktinpromotor og et internt ribosominngangssted (IRES) for EGFP-uttrykk19. Ube3a-konstruksjoner i full lengde inneholder en N-terminal Myc-tag-sekvens og klones til pCIG2 ved hjelp av et 5' SacI-område og et 3' XmaI-nettsted. I tillegg brukes også naturlig forekommende EcoRI-, EcoRV- og PstI-steder i Ube3a-kodesekvensen til å subklone fragmenter.
MERK: Avidentifiserte varianter for Ube3a kan fås gjennom litteraturen og i offentlig tilgjengelige depoter som ClinVar-databasen1. Ytterligere urapporterte varianter kan fås gjennom personlig kommunikasjon med medisinske sentre. - Bruk en tilpasset to-trinns megaprimer mutagenese metode20 for å introdusere mutasjoner i Ube3a leseramme. I det første trinnet, design mutagene oligonukleotid som inneholder ønsket mutasjon (eksemplet vist i denne protokollen er å generere en UBE3A Q588E-variant) flankert av minst 30 basepar (bp) av homologi 5 'og 3' til mutasjonen (figur 1B og tabell 1).
- Bruk mutagene oligonukleotid sammen med et komplementært oligonukleotid for første runde PCR for å generere en 200-400 bp megaprimer som inneholder mutasjonen (figur 1C; Tabell 2 og tabell 3). Bruk hele 50 μL av PCR-reaksjonsvolumet for agarosegelelektroforese ved bruk av en 1% gel og påfølgende gelrensing (Table of Materials). Elute PCR-produktet i 30 μL avionisert H 2 O (diH2O) for bruk i andrerunde PCR-trinnet nedenfor.
- Sett opp andre runde PCR som angitt (figur 1C; Tabell 2 og tabell 3). Dette trinnet vil generere større DNA-fragmenter (vanligvis ~ 1-1,5 kb i lengde) som inneholder mutasjons- og terminalbegrensningsstedene som er egnet for subkloning (figur 1C).
- Etter fullføring av PCR-reaksjonen, rens det resulterende produktet ved hjelp av et PCR-rensesett (Materialtabell). Eluter i 30 μL og fordøye alt det rensede produktet og pCIG2 Ube3a WT-konstruksjonen med passende restriksjonsenzymer (eksemplet viser fordøyelse med EcoRI og XmaI).
- Etter 2 timers fordøyelse ved 37 ° C, løs fordøyelsesproduktene gjennom agarosegelelektroforese (1% gel), og gelrens de aktuelle produktene. Sett opp ligasjoner i henhold til produsentens protokoll (Table of Materials), transformer ligeringsproduktene til en DH10B bakteriestamme (Table of Materials), og deretter plate med ampicillin (100 μg / ml) valg.
- Neste dag velger du to til fire kolonier for å inokulere 3 ml kulturer som inneholder Luria-buljong (LB) og 100 μg / ml ampicillin. La kulturene vokse over natten ved 37 °C i en orbital inkubator med risting (225 o/min).
- Neste dag, bruk 1-1,5 ml av bakteriekulturen for å minimere plasmid-DNA (Materialtabell). Spar den gjenværende kulturen ved å plassere dem ved 4 °C. Skjerm de miniprepped plasmidene ved Sanger-sekvensering ved hjelp av et oligonukleotid som binder ~ 200 bp fra ønsket mutasjon.
- Bruk bakteriekulturer lagret ved 4 °C for å re-inokulere 50 ml kulturer for å midiprep riktig plasmid (Materialtabell). Sekvenser Ube3a-kodesekvensen fullstendig for å validere den riktige sekvensen av DNA.
- Lag arbeidslagre av Ube3a-variantplasmider, samt β-catenin-aktivert reporter (BAR)21, TK-Renilla luciferase, ligasedød Ube3a (UBE3A C820A-mutasjon) og pCIG2 tom vektor ved en konsentrasjon på 100 ng / μL ved bruk av steril H2O for de påfølgende transfeksjonstrinnene.
2. Forberedelse og transfeksjon av humane embryonale nyre 293T (HEK293T) celler
- Utfør analysene i HEK293T-celler dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) forhåndssupplert med glutamin, 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika-antimykotisk middel som beskrevet tidligere17. Dyrk cellene i en steril, fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2.
- Ved hjelp av et biosikkerhetsskap, først plate de suspenderte HEK293T-cellene på vevskulturbehandlede 96-brønns flatbunnede plater med en tetthet på 2,2 × 104 celler per brønn i 100 μL kulturmedier og la dem vokse over natten.
- På den andre dagen, transfect cellene i et biosikkerhetsskap med Firefly og Renilla luciferase reporter plasmider (tabell 4) og Ube3a plasmider i tre eksemplarer. Utfør transfeksjonene i 10 μL totalt volum per brønn ved å bruke et 10: 1: 8-forhold mellom plasmider (henholdsvis 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla og 40 ng Ube3a plasmid per brønn), som tidligere beskrevet18 og 0,4 μL transfeksjonsreagens (tabell 4).
MERK: For hvert eksperiment blir en tom vektor (kun GFP) og en plasmidkode ligasedød Ube3a også transfisert for å fungere som negative kontroller. - Lag en masterblanding for transfeksjonene for hver variant i et 1,5 ml mikrosentrifugerrør (tabell 4) og inkuber ved romtemperatur (RT) i 15 minutter. Etter inkubasjonen omrøres transfeksjonsblandingen forsiktig ved å tappe røret, og tilsett deretter 10 μL av transfeksjonsblandingen direkte til det eksisterende vekstmediet i brønnene.
- Etterpå, returner cellene til inkubatoren og la plasmidene uttrykke seg i 48 timer. Utskifting av vekstmediene er ikke nødvendig.
- Overvåk transfeksjonseffektiviteten ved GFP-fluorescens ved hjelp av et fluorescensmikroskop. HEK293T-celler transfiseres effektivt ved denne metoden, og >80% av cellene skal uttrykke GFP etter 48 timer.
3. Måling av luciferaseaktivitet
MERK: Luciferase-aktivitet vurderes ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system som analyserer både Firefly og Renilla luciferase (materialtabell) i henhold til produsentens protokoll.
- Aspirer forsiktig kulturmediet fra transfekterte HEK293T-celler, og vask deretter cellene med kaldt fosfatbufret saltvann (PBS). Aspirer PBS og lyse cellene ved å tilsette 25 μL ikke-denaturerende lysisbuffer og inkubere i 15 minutter med forsiktig gynging på is.
- Deretter tilsettes 20 μL av det resulterende lysatet (ingen sentrifugering er nødvendig) i en ny 96-brønns analyseplate som inneholder 100 μL av et Firefly luciferase substratreagens. Bland tallerkenen forsiktig ved å banke.
- Legg platen på en plateleser og mål luminescensen ved hjelp av en toppdetektor med en lesehøyde på 1 mm og en integrasjonstid på 1 s.
MERK: Forsterkningen av detektoren må kanskje justeres basert på signalets styrke. - Umiddelbart etter å ha lest Firefly luciferase luminescens, tilsett 100 μL Renilla luciferase substrat til brønnene. Dette trinnet slukker samtidig Firefly luciferase-aktiviteten mens du vurderer Renilla luciferase-aktiviteten. Bland prøvene ved forsiktig omrøring av platen og mål luminescensen igjen for å vurdere Renilla luciferase-aktiviteten.
MERK: Mens andre plater kan brukes til denne analysen, vil bruk av plater med svarte rammer og hvite brønner gi de mest følsomme resultatene, da dette forsterker luciferase-signalet samtidig som støy minimeres. - Kvantifiser reporterens svar som Firefly luciferase til Renilla luciferase ratio (Firefly / Renilla), og gjennomsnitt verdiene for de tredoble målingene. Etterpå normaliserer du Firefly/Renilla-verdien for hver variant mot verdiene for wild-type (WT) Ube3a-uttrykksceller for å sammenligne den relative aktiviteten til variantproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Storskala funksjonell screening av Ube3a missense-varianter identifiserer et bredt landskap av taps- og gevinst-av-funksjon-mutasjoner
Tidligere arbeid med Ube3a-mutanter antydet at Wnt-responsen kan tjene som reporter for cellulær UBE3A-proteinaktivitet. Disse observasjonene ble utvidet, og ytterligere valideringseksperimenter ble utført for å undersøke om BAR-analysen er egnet til å rapportere en rekke UBE3A-aktiviteter i cellen. Først ble HEK293T-celler transfisert med varierende mengder plasmid-DNA som koder for human WT Ube3a. Dette eksperimentet viste at BAR-responsen endres lineært med mengden Ube3a transfisert til celler (figur 2A). For det andre ble BAR-analysen testet ved hjelp av plasmid-DNA som koder for sykdomsbundne varianter som tidligere ble karakterisert i litteraturen22. Blant disse var godartede varianter (R39H og A178T), en autismebundet gain-of-function-variant (T458A), og en samling bekreftede Angelman syndrom-koblede varianter som forårsaker tap av UBE3A-funksjon gjennom ulike mekanismer15,22. BAR-analysen identifiserte hver variant korrekt (figur 2B), inkludert alle tap-av-funksjon-varianter, og demonstrerte nøyaktigheten og generaliteten til denne metoden18.
BAR-analysen ble brukt til å skjerme 152 missense-varianter, hvorav de fleste ble identifisert fra ClinVar-databasen. I likhet med genetisk evidens for variasjoner i kopitall ved Ube3a-avhengige lidelser, var den funksjonelle effekten av missense-varianter bred og inkluderte godartede varianter samt både funksjonstaps- og gevinst-av-funksjon-varianter (figur 3)18. Av spesiell interesse var gain-of-function-variantene identifisert ved hjelp av denne metoden alle nye, og etterfølgende validering foreslo sterkt at de definerer en underklasse av Ube3a-avhengige lidelser med fenotyper som avviger fra klassisk Angelman syndrom18.
Effekten av missense-varianter er ofte uforutsigbar, noe som understreker behovet for funksjonsvurdering.
En spennende observasjon fra funksjonell screening av Ube3a-varianter er at endringer ved noen aminosyreposisjoner gir drastisk forskjellige effekter, og understreker dermed viktigheten av empirisk variantvurdering18. For eksempel ble tre individer identifisert med varianter ved glutamin 588 (Q588) posisjon i UBE3A som inkluderte en gain-of-function glutamatsubstitusjon (Q588E), en tap-av-funksjon argininsubstitusjon (Q588R), og en annen tap-av-funksjon prolinsubstitusjon (Q588P; Figur 4A). En omfattende mutasjonstilnærming ble brukt til å mutere Q588-posisjonen til alle mulige aminosyrer. Når aktiviteten til disse variantene ble målt ved hjelp av BAR-analysen, viste den at enhver negativt ladet aminosyre ved 588-posisjonen produserer et hyperaktivt enzym (figur 4B). Denne innsikten ga viktige funksjonelle ledetråder som tillot oppdagelsen av et nytt sted innenfor HECT-domenet til UBE3A som letter ubiquitin-kjedeforlengelse18.
Figur 1: PCR-avhengig mutagenese av Ube3a. (A) Representasjon av Ube3a-ekspresjonsvektoren som indikerer relevante restriksjonssteder. (B) DNA-sekvensen som koder for UBE3A vises øverst. Q588-kodonet er angitt med fet skrift. Q588E mutageneseprimer (Mut. primer) vises justert til UBE3A-sekvensen. Den røde bokstaven indikerer det mutageniserte stedet. (C) Et skjema av PCR for å generere megaprimeren og DNA-fragmentet som brukes til å subklone Q588E-fragmentet vises. Posisjonen til Q588E-mutasjonen er indikert med den røde stjernen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Validering av BAR-analysen som reporter av UBE3A ubiquitin ligaseaktivitet . (A) HEK293T-celler transfisert med økende mengder plasmidkoding WT UBE3A viser en lineær økning i BAR-responsen. Gjennomsnittsverdier vises for Firefly/Renilla luciferase-forhold ± standardfeil (SE). N = 3 uavhengige eksperimenter. (B) Tidligere karakteriserte Ube3a-varianter ble testet i BAR-analysen. Responsen ble normalisert på WT UBE3A, og verdiene er vist som gjennomsnittet ± SE. Antall eksperimenter (n) og p-verdier beregnet ved hjelp av en ett-prøve t-test (to-tailed) med Benjamini-Hochberg multiple comparisons correction (FDR = 0,05) er som følger: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1.519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7.787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Data gjengitt med tillatelse fra Weston et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: UBE3A-varianter som omfatter et bredt spekter av funksjonelle effekter. BAR-analyseskjerm med 152 Ube3a-varianter som viser godartede (grå), tap-av-funksjon (blå) og gain-of-function (rød) mutasjoner i forhold til WT UBE3A. Signifikans ble bestemt ved hjelp av en ett-utvalgs t-test (tosidig) med Benjamini-Hochberg multippel sammenligningskorreksjon (FDR = 0,05). Rød, gevinst-av-funksjon; Grå, ingen endring fra WT UBE3A; Blå, tap av funksjon. Data gjengitt med tillatelse fra Weston et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: UBE3A-varianter som omfatter et bredt spekter av funksjonelle effekter. (A) BAR-analyseresultater av varianter i posisjon 588 av UBE3A som viser både taps- og gevinst-av-funksjon-substitusjoner. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, One-sample t-test (two-tailed) med Benjamini-Hochberg multiple comparison correction (FDR = 0,05). (B) Varmeplott som viser normaliserte BAR-resultater for omfattende mutasjonsanalyse i posisjon 588 i UBE3A. Den hvite skyggeleggingen representerer WT UBE3A-aktivitetsnivåer, den blå skyggeleggingen indikerer tap av funksjon, og den røde skyggeleggingen indikerer gevinst-av-funksjon. Skalalinjen viser prosentvis endring i forhold til WT UBE3A. N = 3 uavhengige eksperimenter for Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 for Q588E, n = 6 for Q588D, n = 5 for Q588R, n = 4 for Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Ett-utvalgs t-test (tosidig) med Benjamini-Hochberg multippel sammenligningskorreksjon (FDR = 0,05). Data gjengitt med tillatelse fra Weston et al.18. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn | Sekvens | Brukes til | |
| Primer 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a EcoRI sans | |
| Mut. Primer | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagenese antisense | |
| Primer 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisense | |
Tabell 1: Primere brukt for UBE3A Q588E mutagenese.
| 1. runde PCR | |
| Reagent | Reaksjonsmengde |
| 5x hi-fi-buffer | 10 mikroliter |
| dNTP (10 mM lager) | 1 mikroliter |
| Primer 1 (10 mM lager) | 1 mikroliter |
| Primer 2 (10 mM lager) | 1 mikroliter |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL lager) | 1 mikroliter |
| H2O | 35 mikroliter |
| High-fidelity DNA-polymerase | 1 mikroliter |
| Totalt volum | 50 mikroliter |
| 2. runde PCR | |
| Reagent | Reaksjonsmengde |
| 5x hi-fi-buffer | 10 mikroliter |
| dNTP (10 mM lager) | 1 mikroliter |
| Primer 3 (10 mM lager) | 1 mikroliter |
| Renset PCR-produkt (Megaprimer) | 30 mikroliter |
| WT-Ube3a DNA (150 ng/μL lager) | 1 mikroliter |
| H2O | 6 mikroliter |
| High-fidelity DNA-polymerase | 1 mikroliter |
| Totalt volum | 50 mikroliter |
Tabell 2: PCR-parametere for mutagenese.
| 1. runde PCR | ||
| Skritt | Temperatur | Tid |
| Innledende denaturering | 95 °C | 2 min |
| (1 syklus) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30-tallet |
| Annealing | 50 °C | 20-tallet |
| Forlengelse | 72 °C | 15 s |
| (30 sykluser) | ||
| Endelig forlengelse | 72 °C | 1 min |
| Holde | 4 °C | Uendelig |
| 2. runde PCR | ||
| Skritt | Temperatur | Tid |
| Innledende denaturering | 95 °C | 2 min |
| (1 syklus) | ||
| Denaturering | 95 °C | 30-tallet |
| Annealing | 50 °C | 20-tallet |
| Forlengelse | 72 °C | 35 s |
| (30 sykluser) | ||
| Endelig forlengelse | 72 °C | 1 min |
| Holde | 4 °C | Uendelig |
Tabell 3: PCR-programparametere for mutagenese.
| Reagent | Arbeidskonsentrasjon | 1x transfeksjon | 3,5x master mix |
| pGL3 BAR plasmid | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 mikroliter |
| pTK Renilla plasmid | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Ube3a plasmid | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 mikroliter |
| DMEM supplert med glutamin | 8,65 mikroliter | 30.275 μL | |
| Transfeksjonsreagens | 0,4 μL | 1,4 mikroliter |
Tabell 4: Transfeksjonsblandinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir en effektiv og skalerbar metode for å vurdere den enzymatiske aktiviteten til Ube3a-varianter. Det er flere tekniske detaljer som krever nøye vurdering når du bruker denne analysen. En vurdering er valget av Wnt-reporterplasmider som brukes i denne analysen. Protokollen som er beskrevet her, bruker spesifikt β-catenin activated reporter (BAR)21, en reporter som inneholder en sammenkobling av 12 T-cellefaktor (TCF) responselementer atskilt av spesielt utformede linkersekvenser for å minimere rekombinasjon og tap av TCF-bindingssteder. Det er flere luciferasebaserte Wnt-reporterplasmider beskrevet i litteraturen23, og selv om tidligere studier indikerer at noen kan brukes til å vurdere UBE3A-aktivitet, har BAR-plasmidet blitt mest grundig karakterisert for dette formålet17,18. For det andre er valget av Renilla luciferase plasmid kritisk. En plasmidkoding Renilla luciferase er inkludert under transfeksjonstrinnet for å normalisere transfeksjonseffektiviteten. Plasmidet som brukes i denne protokollen uttrykker konstitutivt Renilla luciferase under kontroll av en tymidinkinase (TK) promotor (TK-Renilla). Bruk av plasmider som inneholder andre promotorer, slik som den mye brukte cytomegalovirus (CMV) promotor, kan føre til variable utfall i Renilla luciferase uttrykk.
En annen vurdering er oppførselen til celler avhengig av type og mye FBS som brukes til cellekultur. For eksempel kan FBS variere påvirke vekstraten til HEK293T-celler. Den nåværende protokollen ble optimalisert med celler som viser en typisk doblingstid på 18-24 timer, noe som gjør celletettheten på transfeksjonstidspunktet omtrent ~ 4 × 104 celler per brønn. Siden celletetthet kan påvirke transfeksjonseffektiviteten, bør cellevekstratene vurderes nøye av brukeren og cellenumrene justeres tilsvarende på tidspunktet for plating. I tillegg krever den UBE3A-avhengige BAR-responsen en viss mengde Wnt-ligand for å være til stede under eksperimentet. Under de fleste standardforhold er det nok Wnt i FBS til å drive dette svaret; Dette svaret kan imidlertid også variere. Titrering av plasmidforhold som brukes til transfeksjon anbefales for å sikre at BAR-responsen måles innenfor det aktuelle lineære området. En alternativ tilnærming er å stimulere Wnt-signalering ved hjelp av en rekombinant Wnt-ligand eller Wnt-supplert vekstmedium17.
En fordel med BAR-analysen er at den kan rapportere ubiquitin ligaseaktiviteten til alle Ube3a-isoformer . Mennesker uttrykker tre isoformer av Ube3a som er forskjellige ved deres ekstreme N-termini på grunn av bruk av alternative transkripsjonelle startsteder24. BAR-analysen gir samme avlesningsagnostiker til isoformer, og dermed kan denne analysen brukes til å vurdere alle Ube3a-varianter . I tillegg gir den store karakteriseringen av Ube3a-varianter dype strukturfunksjonsdata som kan avdekke nye domener og mekanismer som er kritiske for enzymfunksjonen. En tidligere studie benyttet variantdata for å oppdage et ubiquitinbindende domene innenfor UBE3A som letter ubiquitinkjedeforlengelse18. Ytterligere strukturfunksjonsstudier vil trolig gi ny innsikt i de biokjemiske mekanismene til UBE3A som kan utnyttes for terapeutisk utvikling.
Det er noen begrensninger i BAR-analysen som krever nøye vurdering ved bestemmelse av patogeniteten til en variant. På grunn av det epigenetiske avtrykket av Ube3a i nevroner, kan denne analysen ikke diskriminere mors og fars alleler, og ytterligere genetiske bevis må veies sammen med funksjonelle data for å bestemme patogeniteten til en variant. Videre må ytterligere variabler utover ubiquitin ligaseaktiviteten til UBE3A vurderes i sammenheng med sykdom. For eksempel viste tidligere arbeid at kjernefysisk lokalisert UBE3A bidrar til Angelman syndrom patologi25 og at noen varianter forstyrrer dette lokaliseringsmønsteret av enzymet26. Dermed må ytterligere nedstrøms karakteriseringer utføres for å få en fullstendig forståelse av bidraget fra Ube3a-varianter til nevrodevelopmental patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), en NARSAD Young Investigator Award fra Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), et stipendiat fra Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), og forskningsstipend fra Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), Whitehall Foundation (J.J.Y.), og NIMH (R01MH122786; JJY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
- Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
- Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
- Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
- Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
- Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
- Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
- Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
- Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
- Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
- Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
- Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
- de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
- Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
- Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
- Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
- Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
- Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809 (2021).
- Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30 (2011).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
- Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
- Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
- Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
- Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
- Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
- Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).
