Summary
Um método simples e escalável foi desenvolvido para avaliar o significado funcional de variantes missense em Ube3a, um gene cuja perda e ganho de função estão ligados à síndrome de Angelman e ao transtorno do espectro do autismo.
Abstract
O aumento do uso de sequenciamento na medicina identificou milhões de variantes codificadoras no genoma humano. Muitas dessas variantes ocorrem em genes associados a distúrbios do neurodesenvolvimento, mas o significado funcional da grande maioria das variantes permanece desconhecido. O presente protocolo descreve o estudo de variantes para Ube3a, um gene que codifica uma ubiquitina ligase E3 ligada ao autismo e à síndrome de Angelman. A duplicação ou triplicação de Ube3a está fortemente ligada ao autismo, enquanto sua deleção causa a síndrome de Angelman. Assim, a compreensão da valência das alterações na atividade da proteína UBE3A é importante para os desfechos clínicos. Aqui, um método rápido, baseado em células, que emparelha variantes Ube3a com um repórter de via Wnt é descrito. Este ensaio simples é escalável e pode ser usado para determinar a valência e a magnitude das mudanças de atividade em qualquer variante do Ube3a . Além disso, a facilidade deste método permite a geração de uma riqueza de informações estrutura-função, que podem ser usadas para obter insights profundos sobre os mecanismos enzimáticos da UBE3A.
Introduction
Avanços tecnológicos recentes têm tornado rotineiro o sequenciamento de exomas e genomas em ambientes clínicos 1,2. Isso levou à descoberta de um grande número de variantes genéticas, incluindo milhões de variantes missense que normalmente mudam um aminoácido em uma proteína. Compreender o significado funcional dessas variantes continua sendo um desafio, e apenas uma pequena fração (~2%) das variantes de missense conhecidas tem uma interpretação clínica 1,3.
Um exemplo proeminente desse problema é o Ube3a, um gene que codifica uma ligase de ubiquitina E3 que tem como alvo proteínas de substrato para degradação4. Ube3a reside no cromossomo 15q11-13 e é expresso exclusivamente a partir do alelo herdado maternalmente 5,6,7. Observações da genética da doença sugerem fortemente que a atividade insuficiente ou excessiva da enzima UBE3A causa distúrbios distintos do neurodesenvolvimento. A deleção do cromossomo materno 15q11-13 causa síndrome de Angelman (EA)8, distúrbio caracterizado por deficiência intelectual grave, comprometimento motor, convulsões, comportamento feliz com sorriso frequente e características faciais dismórficas 8,9,10. Em contraste, a duplicação ou triplicação do cromossomo materno 15q11-13 causa a síndrome de Dup15q, uma condição heterogênea reconhecida como uma das formas sindrômicas mais prevalentes de autismo11,12,13. Além disso, existem centenas de variantes missense identificadas no Ube3a, a maioria das quais são consideradas variantes de significado incerto (USV), pois seu significado funcional e clínico são desconhecidos. Assim, há um interesse considerável no desenvolvimento de métodos que possam avaliar empiricamente as variantes do Ube3a para determinar se elas contribuem para a doença do neurodesenvolvimento.
A enzima UBE3A pertence à família de domínios HECT (homóloga ao E6-AP C-terminus) de ligases E3 ubiquitina que possuem o domínio homônimo HECT, que contém o maquinário bioquímico necessário para aceitar ubiquitina ativada de enzimas E2 e transferi-la para proteínas de substrato14. Historicamente, a caracterização das enzimas E3 tem se baseado em sistemas in vitro reconstituídos que requerem um conjunto de proteínas purificadas 4,15,16. Tais métodos são lentos e trabalhosos e não são passíveis de avaliar a atividade de um grande número de variantes. Em trabalhos anteriores, o UBE3A foi identificado para ativar a via Wnt em células HEK293T, modulando a função do proteassoma para retardar a degradação da β-catenina17. Essa percepção permite o uso de repórteres de via Wnt como um método eficiente e rápido para identificar variantes de perda e ganho de função do Ube3a18. O protocolo abaixo descreve em detalhes um método para gerar variantes Ube3a, bem como um repórter baseado em luciferase para avaliar mudanças na atividade de variantes Ube3a.
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Protocol
1. Clonagem de mutagênese para gerar variantes do Ube3a
- Clone todas as variantes de Ube3a no plasmídeo pCIG2 (Figura 1A), um vetor bicistrônico que contém um promotor de acetina β galinha e um local de entrada interno de ribossomo (IRES) para a expressão EGFP19. Construções Ube3a de comprimento total contêm uma sequência de N-terminal Myc-tag e são clonadas em pCIG2 usando um site SacI de 5' e um site XmaI de 3'. Além disso, os locais EcoRI, EcoRV e PstI que ocorrem naturalmente dentro da sequência de codificação Ube3a também são usados para subclonar fragmentos.
NOTA: Variantes não identificadas para Ube3a podem ser obtidas através da literatura e em repositórios acessíveis ao público, como o banco de dados ClinVar1. Variantes adicionais não relatadas podem ser obtidas através da comunicação pessoal com centros médicos. - Use um método de mutagênese megaprimer de duas etapas adaptado20 para introduzir mutações no quadro de leitura do Ube3a . Na primeira etapa, projete o oligonucleotídeo mutagênico que contém a mutação desejada (o exemplo mostrado neste protocolo é gerar uma variante UBE3A Q588E) ladeado por pelo menos 30 pares de bases (pb) de homologia 5′ e 3′ à mutação (Figura 1B e Tabela 1).
- Utilizar o oligonucleotídeo mutagênico juntamente com um oligonucleotídeo complementar para a primeira rodada de PCR para gerar um megaprimer de 200-400 pb contendo a mutação (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Use todos os 50 μL do volume de reação de PCR para eletroforese em gel de agarose usando um gel a 1% e subsequente purificação em gel (Tabela de Materiais). Eluir o produto de PCR em 30 μL de H 2 O deionizado (diH2O)para uso na segunda etapa de PCR abaixo da rodada.
- Configure a segunda rodada de PCR conforme indicado (Figura 1C; Tabela 2 e Tabela 3). Esta etapa gerará fragmentos de DNA maiores (tipicamente ~1-1,5 kb de comprimento) contendo os locais de mutação e restrição terminal adequados para subclonagem (Figura 1C).
- Após a conclusão da reação de PCR, purifice o produto resultante usando um kit de purificação de PCR (Tabela de Materiais). Eluir em 30 μL e digerir todo o produto purificado e o construto pCIG2 Ube3a WT com as enzimas de restrição apropriadas (o exemplo mostra a digestão com EcoRI e XmaI).
- Após 2 h de digestão a 37 °C, resolver os produtos da digestão através da eletroforese em gel de agarose (gel a 1%) e purificar os produtos apropriados. Configure ligaduras de acordo com o protocolo do fabricante (Tabela de Materiais), transforme os produtos de ligadura em uma cepa bacteriana DH10B (Tabela de Materiais) e, em seguida, pratique com ampicilina (100 μg/mL) de seleção.
- No dia seguinte, escolha de duas a quatro colônias para inocular 3 mL de culturas contendo caldo de Luria (LB) e 100 μg/mL de ampicilina. Deixe as culturas crescerem durante a noite a 37 °C em uma incubadora orbital com agitação (225 rpm).
- No dia seguinte, use 1-1,5 mL da cultura bacteriana para minipreparar o DNA plasmidial (Tabela de Materiais). Salve a cultura restante colocando-a a 4 °C. Rastreie os plasmídeos minipreparados por sequenciamento de Sanger usando um oligonucleotídeo que se liga ~ 200 pb da mutação desejada.
- Use as culturas bacterianas salvas a 4 °C para re-inocular 50 mL de culturas para midiprep o plasmídeo correto (Tabela de Materiais). Sequencie completamente a sequência de codificação Ube3a para validar a sequência correta do DNA.
- Crie estoques de trabalho de plasmídeos variantes de Ube3a, bem como o repórter ativado por β-catenina (BAR)21, luciferase TK-Renilla, Ube3a morto de ligase (mutação UBE3A C820A) e vetor vazio pCIG2 a uma concentração de 100 ng/μL usando H2O estéril para as etapas de transfecção subsequentes.
2. Preparação e transfecção de células 293T embrionárias do rim humano (HEK293T)
- Realizar os ensaios em células HEK293T cultivadas em meio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco pré-suplementado com glutamina, soro fetal bovino a 10% (FBS) e antibiótico-antimicótico, conforme descrito anteriormente17. Cultivar as células em uma incubadora estéril e umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
- Usando um gabinete de biossegurança, primeiro coloque as células HEK293T suspensas em placas de fundo plano de 96 poços tratadas com cultura de tecidos a uma densidade de 2,2 × 104 células por poço em 100 μL de meios de cultura e permita que elas cresçam durante a noite.
- No segundo dia, transfectar as células em um gabinete de biossegurança com plasmídeos repórteres Firefly e Renilla luciferase (Tabela 4) e plasmídeos Ube3a em triplicado. Realizar as transfecções em 10 μL de volume total por poço utilizando uma proporção de 10:1:8 de plasmídeos (50 ng de BAR, 5 ng de TK-Renilla e 40 ng de plasmídeo Ube3a por poço, respectivamente), conforme descrito anteriormente18, e 0,4 μL de reagente de transfecção (Tabela 4).
NOTA: Para cada experimento, um vetor vazio (somente GFP) e um plasmídeo codificando Ube3a morto por ligase também são transfectados para servir como controles negativos. - Criar uma mistura mestra para as transfecções para cada variante em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (Tabela 4) e incubar à temperatura ambiente (RT) por 15 min. Após a incubação, agite suavemente a mistura de transfecção batendo no tubo e, em seguida, adicione 10 μL da mistura de transfecção diretamente ao meio de crescimento existente nos poços.
- Depois, devolva as células à incubadora e permita que os plasmídeos se expressem por 48 h. A substituição do meio de crescimento não é necessária.
- Monitore a eficiência da transfecção por fluorescência GFP usando um microscópio de fluorescência. As células HEK293T são eficientemente transfectadas por este método e >80% das células devem expressar GFP após 48 h.
3. Medição da atividade da luciferase
NOTA: A atividade da Luciferase é avaliada usando um sistema comercialmente disponível que ensaia a luciferase Firefly e Renilla (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
- Aspirar cuidadosamente o meio de cultura a partir de células HEK293T transfectadas e, em seguida, lavar as células com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS). Aspirar o PBS e lisar as células adicionando 25 μL de tampão de lise não desnaturante e incubar por 15 min com balanço suave no gelo.
- Posteriormente, adicione 20 μL do lisado resultante (nenhuma centrifugação é necessária) em uma nova placa de ensaio de 96 poços contendo 100 μL de um reagente de substrato de luciferase Firefly. Misture o prato suavemente batendo.
- Carregue a placa em um leitor de placas e meça a luminescência usando um detector superior com uma altura de leitura de 1 mm e um tempo de integração de 1 s.
NOTA: O ganho do detector pode precisar ser ajustado com base na força do sinal. - Imediatamente após a leitura da luminescência da luciferase Firefly, adicione 100 μL de substrato de luciferase Renilla aos poços. Este passo simultaneamente extingue a atividade da luciferase Firefly enquanto avalia a atividade da luciferase Renilla. Misture as amostras por agitação suave da placa e meça a luminescência novamente para avaliar a atividade da luciferase de Renilla .
NOTA: Enquanto outras placas podem ser usadas para este ensaio, o uso de placas com quadros pretos e poços brancos fornecerá os resultados mais sensíveis, pois isso amplifica o sinal de luciferase, minimizando o ruído. - Quantifique as respostas do repórter como a razão Luciferase Firefly para Renilla luciferase (Firefly/Renilla) e calcule a média dos valores das medições triplicadas. Posteriormente, normalize o valor de Firefly/Renilla para cada variante em relação aos valores para células expressivas Ube3a do tipo selvagem (WT) para comparar a atividade relativa das proteínas variantes.
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Representative Results
A triagem funcional em larga escala de variantes de Missense do Ube3a identifica um amplo cenário de mutações de perda e ganho de função
Trabalhos anteriores com mutantes Ube3a sugeriram que a resposta Wnt pode servir como um repórter da atividade celular da proteína UBE3A. Essas observações foram expandidas e experimentos de validação adicionais foram realizados para investigar se o ensaio BAR é adequado para relatar uma série de atividades UBE3A na célula. Primeiro, as células HEK293T foram transfectadas com quantidades variáveis de DNA plasmidial que codifica o WT Ube3a humano. Este experimento demonstrou que a resposta da BAR muda linearmente com a quantidade de Ube3a transfectada em células (Figura 2A). Em segundo lugar, o ensaio BAR foi testado utilizando DNA plasmídico que codifica variantes ligadas à doença previamente caracterizadas na literatura22. Entre elas estavam variantes benignas (R39H e A178T), uma variante de ganho de função ligada ao autismo (T458A) e uma coleção de variantes confirmadas ligadas à síndrome de Angelman que causam perda da função UBE3A por meio de vários mecanismos15,22. O ensaio BAR identificou corretamente cada variante (Figura 2B), incluindo todas as variantes de perda de função, demonstrando a acurácia e generalidade desse método18.
O ensaio BAR foi usado para rastrear 152 variantes de missense, a maioria das quais foi identificada a partir do banco de dados ClinVar. Semelhante à evidência genética sobre variações no número de cópias em distúrbios dependentes de Ube3a, o impacto funcional das variantes missense foi amplo e incluiu variantes benignas, bem como variantes de perda de função e ganho de função (Figura 3)18. De particular interesse, as variantes de ganho de função identificadas por esse método eram todas novas, e a validação subsequente sugeriu fortemente que elas definem uma subclasse de transtornos dependentes de Ube3a com fenótipos que diferem da síndrome de Angelman clássica18.
O efeito das variantes missense é muitas vezes imprevisível, ressaltando a necessidade de avaliação funcional
Uma observação intrigante da triagem funcional de variantes de Ube3a é que as mudanças em algumas posições de aminoácidos produzem efeitos drasticamente diferentes, ressaltando assim a importância da avaliação empírica de variantes18. Por exemplo, três indivíduos foram identificados com variantes na posição de glutamina 588 (Q588) na UBE3A que incluíram uma substituição de glutamato de ganho de função (Q588E), uma substituição de arginina de perda de função (Q588R) e outra substituição de prolina de perda de função (Q588P; Figura 4A). Uma abordagem de mutação abrangente foi usada para mutar a posição Q588 para todos os aminoácidos possíveis. Quando a atividade dessas variantes foi medida usando o ensaio BAR, mostrou-se que qualquer aminoácido carregado negativamente na posição 588 produz uma enzima hiperativa (Figura 4B). Esse insight forneceu importantes pistas funcionais que permitiram a descoberta de um novo sítio dentro do domínio HECT da UBE3A que facilita o alongamento da cadeia de ubiquitina18.
Figura 1: Mutagênese dependente de PCR de Ube3a. (A) Representação do vetor de expressão Ube3a indicando locais de restrição relevantes. (B) A sequência de DNA que codifica UBE3A é mostrada na parte superior. O códon Q588 é indicado por letras em negrito. O primer de mutagênese Q588E (Mut. primer) é mostrado alinhado à sequência UBE3A. As letras vermelhas indicam o local mutagenizado. (C) Um esquema da PCR para gerar o megaprimer e o fragmento de DNA usado para subclonar o fragmento Q588E é mostrado. A posição da mutação Q588E é indicada pelo asterisco vermelho. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Validação do ensaio BAR como relator da atividade da ubiquitina ligase UBE3A. (A) As células HEK293T transfectadas com quantidades crescentes de plasmídeo codificando WT UBE3A mostram um aumento linear na resposta BAR. Os valores médios são mostrados para as razões de luciferase Firefly/Renilla ± erro padrão (SE). N= 3 experimentos independentes. (B) Variantes de Ube3a previamente caracterizadas foram testadas no ensaio BAR. As respostas foram normalizadas para WT UBE3A, e os valores são apresentados como a média ± SE. O número de experimentos (n) e os valores de p calculados usando um teste t de uma amostra (bicaudal) com correção de comparações múltiplas de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05) são os seguintes: GFP, n = 19, ***p = 1,733 × 10−31; WT UBE3A, n = 19; UBE3A LD, n = 19, ***p = 1,519 × 10−31; R39H, n = 3, p = 0,567; A178T, n = 4, p = 0,828; T485A, n = 5, *p = 0,019; C21Y, n = 3, ***p = 8,725 × 10−6; C117R, n = 3, ***p = 3,419 × 10−4; N243K, n = 3, **p = 0,0072; E269G, n = 3, **p = 7,787 × 10−4; L273F, n = 3, **p = 0,0052; S349P, n = 3, **p = 0,0016; L502P, n = 3, **p = 0,0033; R506C, n = 3, **p = 0,0033; T106K, n = 6, **p = 0,0,0078; T106P, n = 3, **p = 0,0013; I130T, n = 6, *p = 0,016; R477P, n = 3, ***p = 4,24 × 10−4; M478I, n = 3, ***p = 3,39 × 10−4; R482P, n = 3, **p = 5,82 × 10−4; I329T, n = 5, ***p = 1,22 × 10−5; E550L, n = 3, *p = 0,0013. Dados reimpressos com permissão de Weston et al.18. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Variantes UBE3A que abrangem uma ampla gama de efeitos funcionais. Tela de ensaio BAR de 152 variantes de Ube3a mostrando mutações benignas (cinza), perda de função (azul) e ganho de função (vermelho) em relação ao WT UBE3A. A significância foi determinada por meio do teste t de uma amostra (bicaudal) com correção de comparações múltiplas de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Vermelho, ganho de função; Cinza, sem alteração do WT UBE3A; Azul, perda de função. Dados reimpressos com permissão de Weston et al.18. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Variantes UBE3A abrangendo uma ampla gama de efeitos funcionais. (A) Resultados do ensaio BAR de variantes na posição 588 do UBE3A mostrando substituições de perda e ganho de função. Q588E, n = 6; Q588P, n = 3; Q588R, n = 4; p < 0,0005, teste t de uma amostra (bicaudal) com correção de comparação múltipla de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). (B) Gráfico de calor mostrando resultados normalizados de BAR para análise mutacional abrangente na posição 588 em UBE3A. O sombreamento branco representa os níveis de atividade WT UBE3A, o sombreamento azul indica perda de função e o sombreamento vermelho indica ganho de função. A barra de escala mostra a variação percentual em relação ao WT UBE3A. N = 3 experimentos independentes para Q588S, Q588T, Q588N, Q588K, Q588P, Q588M, Q588G, Q588A, Q588F, Q588Y, Q588W, Q588L, Q588V, Q588I, Q588C; n = 8 para Q588E, n = 6 para Q588D, n = 5 para Q588R, n = 4 para Q588H, *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Teste t de uma amostra (bicaudal) com correção de comparações múltiplas de Benjamini-Hochberg (FDR = 0,05). Dados reimpressos com permissão de Weston et al.18. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Seqüenciar | Usado para | |
| Cartilha 1 | GATTATATTATGACAATAGAA TTCGCATGTACAGTGAAC |
Ube3a Sentido EcoRI | |
| Cartilha Mut. | CCAGACCCAGTACTATGCCAAT CAGAGTAAACTCACCCTCAGTT TCAAAAGAAGATGGATTAAACC |
UBE3A Q588E mutagênese antisense | |
| Cartilha 2 | ATTATATTCCCGGGTTACAGCAT GCCAAATCCTTTGG |
Ube3a XmaI antisense | |
Tabela 1: Primers utilizados para a mutagênese UBE3A Q588E.
| 1ª Rodada PCR | |
| Reagente | Quantidade de reação |
| 5x buffer de alta fidelidade | 10 μL |
| dNTP (estoque de 10 mM) | 1 μL |
| Primer 1 (estoque de 10 mM) | 1 μL |
| Primer 2 (estoque de 10 mM) | 1 μL |
| DNA WT-Ube3a (estoque de 150 ng/μL) | 1 μL |
| H2O | 35 μL |
| DNA polimerase de alta fidelidade | 1 μL |
| Total Volume | 50 μL |
| 2ª Rodada PCR | |
| Reagente | Quantidade de reação |
| 5x buffer de alta fidelidade | 10 μL |
| dNTP (estoque de 10 mM) | 1 μL |
| Primer 3 (estoque de 10 mM) | 1 μL |
| Produto de PCR purificado (Megaprimer) | 30 μL |
| DNA WT-Ube3a (estoque de 150 ng/μL) | 1 μL |
| H2O | 6 μL |
| DNA polimerase de alta fidelidade | 1 μL |
| Total Volume | 50 μL |
Tabela 2: Parâmetros de PCR para mutagênese.
| 1ª Rodada PCR | ||
| Passo | Temperatura | Hora |
| Desnaturação inicial | 95 °C | 2 min |
| (1 ciclo) | ||
| Desnaturação | 95 °C | 30 s |
| Recozimento | 50 °C | 20 s |
| Extensão | 72 °C | 15 s |
| (30 ciclos) | ||
| Prorrogação final | 72 °C | 1 min |
| Segurar | 4 °C | Infinito |
| 2ª Rodada PCR | ||
| Passo | Temperatura | Hora |
| Desnaturação inicial | 95 °C | 2 min |
| (1 ciclo) | ||
| Desnaturação | 95 °C | 30 s |
| Recozimento | 50 °C | 20 s |
| Extensão | 72 °C | 35 s |
| (30 ciclos) | ||
| Prorrogação final | 72 °C | 1 min |
| Segurar | 4 °C | Infinito |
Tabela 3: Parâmetros do Programa de PCR para Mutagênese.
| Reagente | Concentração de trabalho | 1x transfecção | 3.5x master mix |
| Plasmídeo pGL3 BAR | 100 ng/μL | 0,5 μL | 1,75 μL |
| Plasmídeo pTK Renilla | 100 ng/μL | 0,05 μL | 0,175 μL |
| Plasmídeo Ube3a | 100 ng/μL | 0,4 μL | 1,4 μL |
| DMEM suplementado com glutamina | 8,65 μL | 30,275 μL | |
| Reagente de transfecção | 0,4 μL | 1,4 μL |
Tabela 4: Misturas de transfecção.
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Discussion
O protocolo aqui descrito fornece um método eficiente e escalável para avaliar a atividade enzimática das variantes de Ube3a. Existem vários detalhes técnicos que merecem uma consideração cuidadosa ao usar este ensaio. Uma consideração é a escolha dos plasmídeos repórteres Wnt utilizados neste ensaio. O protocolo descrito aqui usa especificamente o β-catenin activated reporter (BAR)21, um reportador que contém um concatenador de 12 elementos de resposta do fator de células T (TCF) separados por sequências de vinculadores especificamente projetadas para minimizar a recombinação e a perda de locais de ligação ao TCF. Existem plasmídeos repórteres Wnt adicionais à base de luciferase descritos na literatura23 e, embora estudos anteriores indiquem que alguns podem ser usados para avaliar a atividade da UBE3A, o plasmídeo BAR tem sido mais bem caracterizado para esse fim17,18. Em segundo lugar, a escolha do plasmídeo Renilla luciferase é fundamental. Um plasmídeo que codifica Renilla luciferase é incluído durante a etapa de transfecção para normalizar a eficiência da transfecção. O plasmídeo utilizado neste protocolo expressa constitutivamente a luciferase de Renilla sob o controle de um promotor de timidina quinase (TK) (TK-Renilla). O uso de plasmídeos contendo outros promotores, como o amplamente utilizado citomegalovírus (CMV), pode levar a desfechos variáveis na expressão da luciferase de Renilla.
Uma segunda consideração é o comportamento das células, dependendo do tipo e lote de FBS usado para cultura celular. Por exemplo, a FBS pode afetar de forma variável a taxa de crescimento das células HEK293T. O protocolo atual foi otimizado com células exibindo um tempo de duplicação típico de 18-24 h, tornando a densidade celular no momento da transfecção aproximadamente ~ 4 × 104 células por poço. Como a densidade celular pode afetar a eficiência da transfecção, as taxas de crescimento celular devem ser cuidadosamente avaliadas pelo usuário e os números de células ajustados de acordo no momento do chapeamento. Além disso, a resposta BAR dependente de UBE3A requer alguma quantidade de ligante Wnt para estar presente durante o experimento. Na maioria das condições padrão, há Wnt suficiente no FBS para conduzir essa resposta; no entanto, essa resposta também pode variar. Recomenda-se a titulação das razões plasmídicas utilizadas para a transfecção para garantir que a resposta da BAR seja medida dentro da faixa linear apropriada. Uma abordagem alternativa é estimular a sinalização Wnt usando um ligante Wnt recombinante ou meio de crescimento suplementado com Wnt17.
Uma vantagem do ensaio BAR é que ele pode relatar a atividade da ubiquitina ligase de todas as isoformas de Ube3a . Os seres humanos expressam três isoformas de Ube3a que diferem em seu extremo N-termini devido ao uso de locais de início transcricionais alternativos24. O ensaio BAR fornece a mesma leitura agnóstica às isoformas e, portanto, este ensaio pode ser usado para avaliar todas as variantes de Ube3a . Além disso, a caracterização em larga escala de variantes de Ube3a fornece dados profundos de estrutura-função que podem descobrir novos domínios e mecanismos que são críticos para a função enzimática. Um estudo anterior utilizou dados variantes para descobrir um domínio de ligação à ubiquitina dentro do UBE3A que facilita o alongamento da cadeia de ubiquitina18. Estudos adicionais de estrutura-função provavelmente fornecerão novos insights sobre os mecanismos bioquímicos da UBE3A que podem ser aproveitados para o desenvolvimento terapêutico.
Existem algumas limitações para o ensaio BAR que merecem uma consideração cuidadosa ao determinar a patogenicidade de uma variante. Devido à impressão epigenética de Ube3a em neurônios, este ensaio não pode discriminar alelos maternos e paternos, e evidências genéticas adicionais devem ser pesadas juntamente com dados funcionais para determinar a patogenicidade de uma variante. Além disso, variáveis adicionais além da atividade da ubiquitina ligase da UBE3A devem ser consideradas no contexto da doença. Por exemplo, trabalhos anteriores mostraram que a UBE3A localizada nuclear contribui para a patologia da síndrome de Angelman25 e que algumas variantes perturbam esse padrão de localização da enzima26. Assim, caracterizações adicionais a jusante devem ser realizadas para obter uma compreensão completa da contribuição das variantes de Ube3a para a patologia do neurodesenvolvimento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um Simons Foundation Bridge to Independence Award (SFARI Award #387972; J.J.Y.), um NARSAD Young Investigator Award da Brain and Behavior Research Foundation (J.J.Y.), uma bolsa de pesquisa da Alfred P. Sloan Foundation (J.J.Y.), e bolsas de pesquisa da Angelman Syndrome Foundation (J.J.Y.), da Whitehall Foundation (J.J.Y.) e do NIMH (R01MH122786; J.J.Y.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300-054 | |
| 1 Kb DNA ladder | Lambda Biotech | M108-S | |
| 100 bp DNA Ladder | Lambda Biotech | M107 | |
| 10x Buffer for T4 DNA Ligase with 10 mM ATP | New England BioLabs | B0202A | |
| 5x Phusion HF Reaction Buffer | New England BioLabs | B0518S | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning | 30004CI | |
| Black/White Isoplate-96 Black Frame White Well plate | PerkinElmer | 6005030 | |
| Carbenicillin Disodium Salt | Midwest Scientific | KCC46000-5 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | C10283 | |
| Countess II Automated Cell Counter | life technologies | Cell counting machine | |
| Custom DNA oligos | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England BioLabs | N0447S | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569044 | Basal medium for supporting the growth of HEK293T cell line |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-136 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Restriction enzyme |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | Fetal bovine serum |
| Fisherbrand Surface Treated Tissue Culture Dishes | Fisherbrand | FB012924 | |
| FuGENE 6 Transfection Reagent | Promega | E2691 | |
| Gel Loading Dye Purple (6x) | New England BioLabs | B7024A | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| High Efficiency ig 10B Chemically Competent Cells | Intact Genomics | 1011-12 | E. coli DH10B cells |
| HiSpeed Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12643 | Midi prep |
| pCIG2 plasmid | |||
| pGL3 BAR plasmid | |||
| Phusion HF DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | DNA polymerase |
| ProFlex 3 x 32 well PCR System | Applied biosystems by life technologies | Thermocycler | |
| pTK Renilla plasmid | |||
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | Mini prep |
| QIAquick Gel Extraction Kit (250) | Qiagen | 28706 | Gel purification |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | PCR purification |
| rCutSmart Buffer | New England BioLabs | B6004S | |
| SacI-HF | New England BioLabs | R3156S | Restriction enzyme |
| Synergy HTX Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader runs Gen5 software v3.08 (BioTek) | |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202L | Ligase |
| TAE Buffer, Tris-Acetate-EDTA, 50x Solution, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP13324 | |
| Tissue Culture Plate 96 wells, Flat Bottom | Fisherbrand | FB012931 | |
| UltraPure Ethidium Bromide Solution | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | 15585011 | |
| XmaI | New England BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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